Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Ham Peritoneal Eksüda Hücreleri ve Doğal Antijen Stimülasyonu Kullanılarak Bir Ex vivo Mast Hücre Degranülasyon Testi

2.4K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61556

⸱

27 Nisan 2021

 ,  , 
1College of Pharmacy, Chungnam National University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Farelerden izole edilen, ilgilenilen bir farmakolojik ajan ile muamele edilen ve önceden anti-dinitrofenol (DNP) IgE uygulanan, bir taşıyıcı protein üzerinde DNP ile uygulanan ham peritoneal eksüda hücrelerinin inkübe edilmesiyle gerçekleştirilen bir ex vivo mast hücre degranülasyon testi oluşturduk.

Özet

Mast hücre stabilizatörleri alerji ilaçlarının önemli bir parçasıdır. Pasif sistemik anafilaksi (PSA), ilgilenilen bir farmakolojik ajanın mast hücreleri üzerindeki etkisini in vivo olarak araştırmak için yaygın olarak kullanılan bir hayvan testidir. Anafilaktik semptomlar esas olarak mast hücrelerinden granüllerin ekzositozuna atfedildiğinden, semptomların iyileşmesine neden olan ajanın mast hücresi stabilize edici bir aktiviteye sahip olduğu düşünülmektedir. Buna rağmen, tedavisini takiben mast hücrelerinin fonksiyonel aktivitesindeki düşüşü doğrudan göstererek aktiviteyi doğrulamak ihtiyatlıdır. Ölümsüzleştirilmiş bir mast hücre hattı veya kültürlenmiş primer mast hücreleri kullanılarak yapılan in vitro degranülasyon testleri bu amaçla rutin olarak kullanılır. İn vitro ve in vivo tahlillerden elde edilen sonuçlar her zaman birbirine benzemeyebilir; bununla birlikte, in vitro testler için tedavi koşulları (ör., tedavi dozu, zaman, çevredeki ortamlar) genellikle PSA gibi in vivo testler için olanlardan farklıdır. Bir farmakolojik ajanın in vivo olarak mast hücreleri üzerindeki etkisini daha yakından yansıtmak için in vitro (veya ex vivo) bir test arayışında, farelerden izole edilen, ajan ile muamele edilen ve anti-dinitrofenol (DNP) IgE uygulanan ham peritoneal eksüda hücrelerinin (PEC'ler) bir taşıyıcı protein üzerinde doğrudan DNP ile inkübe edildiği ex vivo mast hücre degranülasyon testini tasarladık. Testin sadece in vivo test ile gösterilen bir farmakolojik ajanın mast hücresi stabilize edici aktivitesini doğrulamada yararlı olmadığı, aynı zamanda pratik ve yüksek oranda tekrarlanabilir olduğu ortaya çıktı.

Giriş

Mast hücreleri alerjide merkezi bir rol oynar 1,2. IgE (FcεRI) için yüksek afiniteli reseptör ile etkileşim yoluyla mast hücrelerinin yüzeyinde bulunan IgE, aynı kökenli bir alerjenle karşılaştığında, granüllerin salınmasını sağlamak için bir sinyal kaskadı ortaya çıkar. Sonuç olarak, monoaminler (örneğin, histamin, serotonin), sitokinler (örneğin, TNF-α) ve proteolitik enzimler (örneğin, triptaz, kimaz) dahil olmak üzere çeşitli alerji efektör molekülleri, bir dizi immünolojik, nörolojik ve vazomüsküler reaksiyona neden olmak üzere salınır 3,4.

Mast hücre fonksiyonunu zayıflatarak alerji semptomlarını hafifleten bir farmasötik sınıfa mast hücre stabilizatörü denir5. Pasif sistemik anafilaksi (PSA), farmakolojik ajanların mast hücresi stabilize edici aktivitesini araştırmak için sıklıkla kullanılan bir hayvan modelidir. Anafilaktik semptomlar esas olarak, pasif olarak transfer edilen hapten-spesifik IgE'nin daha sonra hayvana enjekte edilen bir taşıyıcı protein üzerindeki hapten ile etkileşimini takiben mast hücrelerinin aktivasyonundan kaynaklandığından, ilgilenilen bir farmakolojik ajanın, tedavisi semptomların iyileşmesi ile sonuçlandığında bir mast hücresi stabilize edici aktivite taşıdığı iyi karşılanmaktadır6. Yine de, semptomların iyileşmesinin mast hücresi fonksiyonunun baskılanmasından başka bir mekanizmadan türetilme olasılığını dışlamak için ayrı bir deneyde ajan tarafından mast hücresi fonksiyonundaki bozulmanın doğrudan gösterilmesi genellikle zorunludur.

Mast hücrelerinin bir kimyasal reaktif veya spesifik bir IgE antijeni ile uyarılması ve salgı granüllerinin ekzositozunu indüklemek için mast hücrelerinin yüzeyinde FcεRI ile bir kompleks oluşturması yoluyla gerçekleştirilen mast hücresi degranülasyon testi (ör., degranülasyon), genellikle bir farmakolojik reaktifin in vitro7. Bu testte, sıçan bazofilik lösemi (RBL) hücre hattı8, kemik iliği kaynaklı mast hücreleri (BMMC)9 ve periton hücresinden türetilmiş mast hücreleri (PCMC)10 dahil olmak üzere çeşitli hücre türleri kullanılır. Çok sayıda hücre kolayca elde edilebildiği için yararlı olsa da, RBL, hücresel özellikleri artık vücuttaki mast hücrelerininkine benzemeyen ölümsüzleştirilmiş bir kanser hücre dizisidir. Hücresel özellikleri vücuttaki mast hücrelerininkine daha çok benzese de, yeterli sayıda BMMC veya PCMC elde etmek genellikle maliyetli ve zaman alıcıdır.

Saflaştırılmış primer mast hücreleri kullanılarak yapılan bir degranülasyon testi, arzu edilen bir alternatiftir11. Bununla birlikte, böyle bir tahlilin kullanımı, mast hücrelerinin hayvan dokusundan, özellikle fare dokusundan yüksek verimle saflaştırılması için kolay bir yöntem olarak yaygın değildir ve saflık henüz mevcut değildir. Ayrıca, in vitro olarak mast hücre fonksiyonunu inhibe etmek için farmakolojik bir ajanla tedavinin konsantrasyonu ve süresi her zaman in vivo olanlarla çakışmayabileceğinden, in vitro degranülasyon testi ile elde edilen sonuçlar, PSA gibi bir in vivo testten elde edilenleri yanlış temsil edebilir ve bunun tersi de geçerlidir. Bu nedenle, sadece in vivo olarak ortaya çıkan mast hücresi aktivasyonunun şeklini yakından taklit etmekle kalmayıp, aynı zamanda in vivo olarak mast hücrelerine uygulanan bir farmakolojik reaktifin etkilerini doğru bir şekilde yansıtan yeni bir degranülasyon testi yüksek talep görmektedir. Bu ihtiyaçları karşılamak için, farelerden izole edilen peritoneal eksüda hücrelerindeki (PEC'ler) mast hücrelerinin, ilgilenilen bir farmakolojik ajan ile muamele edildiği ve önceden dinitrofenol (DNP) için spesifik IgE'nin uygulandığı bir ex vivo mast hücre degranülasyon testi tasarladık, DNP ile konjuge sığır serum albümini (BSA) ile uyarılır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, Chungnam Ulusal Üniversitesi IACUC (Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi) tarafından sağlanan kılavuza uygun olarak gerçekleştirilmiştir (Hayvan Protokol Numarası: CNU-00996).

1. Ham PEC'lerin lizatındaki mast hücresine özgü moleküllerin miktarının belirlenmesi

  1. Hücreleri fare periton boşluğundanizole edin 12.
    1. Bir fareyi (8 haftalık, erkek, BALB / C) izofluran ile uyuşturun. Servikal çıkık yoluyla ötenazi yapın.
    2. Fareyi bir köpük bloğun üzerine yerleştirin. Karnı% 70 etanol ile silin.
    3. Ventral cildi künt kenar makasıyla uzunlamasına kesin. Forseps ve makas kullanarak farenin derisini soyun.
    4. 26 G iğne ile 10 mL'lik bir şırınga kullanarak 6 mL buz gibi Tyrode'un B tamponunu13 periton boşluğuna enjekte edin. Herhangi bir organın delinmesini önlemek için iğneyi nazikçe sokun.
    5. Periton hücrelerini Tyrode'un B tamponuna toplamak için farenin karnına 60-90 saniye masaj yapın. Kan damarlarına zarar vermemek için nazikçe yapın.
    6. 10 mL'lik bir şırınga eğimine bağlı iğneyi (20 G) yukarı doğru yerleştirin. Sıvıyı periton boşluğundan yavaşça aspire edin (tipik olarak 5-6 mL).
    7. İğneyi şırıngadan çıkarın. Periton sıvısını 50 mL'lik konik bir tüpe dağıtın. Tüpü buz üzerinde tutun.
    8. 1.1.4 - 1.1.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
    9. Tüpü 300 x g'da 10 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Hücreleri 1 mL 1x kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri 3 dakika buz üzerinde tutun.
    10. Hücre süspansiyonunu 2 mL Tyrode'un B tamponu ile seyreltin. Tüpü 300 x g'da 10 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
    11. Süpernatanı çıkarın. Hücreleri 0.5 mL Tyrode'un A tamponu13'te yeniden süspanse edin.
    12. Hücreleri bir hemositometre ile sayın. Tyrode'un A tamponu ile hücre numarasını 5 x 106/mL olarak ayarlayın.
  2. Manyetik hücre saflaştırma sistemi14 kullanarak mast hücresi tükenmiş PEC'leri hazırlayın.
    1. 5 x 105 ham PEC'yi 300 x g'da 10 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti 200 μL PBSBE hücre saflaştırma tamponunda (%0.5 BSA, 2 mM EDTA, 1 x PBS, pH 7.4) yeniden süspanse edin.
    2. Daha sonra eklenecek anti-c-kit monoklonal antikorun (mAb) spesifik olmayan bağlanmasını önlemek için hücrelere 1 μL Fc bloker (0.5 mg / mL) ekleyin. Hücreleri 5 dakika buz üzerinde tutun.
    3. 1 μL biyotinile anti-fare c-kit mAb15 (0.5 mg / mL) ekleyin. Hücreleri 10 dakika buz üzerinde tutun.
    4. 2 mL PBSBE tamponu ekleyin. Hücreleri 10 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    5. Süpernatanı çıkarın. Hücreleri tekrar 2 mL PBSBE tamponu ile yıkayın.
    6. Hücreleri 90 μL PBSBE tamponunda yeniden süspanse edin. 10 μL streptavidin konjuge mikro boncuk ekleyin. Hücreleri 15 dakika buz üzerinde tutun.
    7. 2 mL PBSBE tamponu ekleyin. Hücreleri 10 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    8. Sıkma sırasında orta manyetik bir kolon üzerine 500 μL PBSBE tamponu yükleyin. Arabelleğin sütundan akmasına izin verin.
    9. Santrifüjlemeden sonra süpernatanı çıkarın. Hücreleri 500 μL PBSBE tamponunda yeniden süspanse edin.
    10. Hücreleri sütuna yükleyin. Sütundan serbestçe geçen hücreleri toplayın.
    11. Kolonu 500 μL PBSBE tamponu ile yıkayın. Sütundan geçen hücreleri tekrar toplayın.
    12. Adım 1.2.11'i tekrarlayın.
    13. 1.2.9-1.2.11 adımlarındaki hücreleri tek bir tüpte birleştirin. Hücreleri 10 ° C'de 10 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin.
    14. Tyrode'un A tamponundaki hücreleri yeniden askıya alın. Hücreleri sayın. Hücre numarasını 5 x 106 hücre/mL olarak ayarlayın.
  3. PEC'lerin lizatını hazırlayın.
    1. Plaka PEC'leri (örneğin, 5 x 105) sırasıyla yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakada. Hücreleri toplamak için plakayı 300 x g'da 10 ° C'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetle dikkatlice çıkarın.
    2. Hücre peletine 100 μL hücre lizis tamponu ekleyin. Hücreleri birkaç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Plakayı 60 dakika buz üzerinde tutun.
    3. Hücre kalıntılarını gidermek için plakayı 300 x g'da 5 °C'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı (hücre lizatı) yeni bir 96 oyuklu plakaya aktarın.
  4. β-heksosaminidaz16'nın enzimatik aktivitesini ölçün.
    1. Hücre lizatını (50 μL) 96 oyuklu bir mikroplakada önceden ısıtılmış β-heksosaminidaz substrat çözeltisine (50 μL) ekleyin. Bunları bir pipetle nazikçe karıştırın.
    2. Plakayı 37 ° C'lik bir inkübatörde inkübe edin. Enzim reaksiyonunu sonlandırmak için 30 dakika sonra 50 μL durdurma çözeltisi (100 mM glisin, pH 10.7) ekleyin.
    3. Çift dalga boyu ayarında UV görünür absorbanslı bir mikroplaka okuyucu ile reaksiyon karışımlarının OD'sini okuyun; Enzim reaksiyonunun seviyesini belirlemek için sırasıyla 405 nm ve otomatik arka plan çıkarma için 620 nm.
  5. Histamin konsantrasyonunu ölçün17.
    1. Temizlenmiş hücre lizatlarının 100 μL'sini histamin ELISA kiti ile birlikte verilen anti-histamin mAb kaplı plakaya aktarın. Üretici kılavuzuna göre rekabetçi histamin ELISA testi yapın.
    2. 450 nm dalga boyunda UV görünür absorbanslı mikroplaka okuyucu ile numunelerin OD'sini okuyun.
  6. Akış sitometrisi18 ile PEC'lerdeki mast hücrelerinin oranını belirleyin.
    1. 1 x 105 ham veya mast hücresi tükenmiş PEC'leri yuvarlak tabanlı 96 oyuklu bir plakaya aktarın. Plakayı 300 x g'da 10 °C'de 2 dakika santrifüjleyin.
    2. Hücreleri 50 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin. 1 μL anti-fare c-kiti (0.5 mg / mL) ve anti-fare IgE mAbs (0.5 mg / mL) ekleyin.
    3. Hücreleri kısaca vorteksleyin. Hücreleri karanlıkta 20 dakika buz üzerinde tutun.
    4. Kuyuları 150 μL FACS tamponu ile doldurun. Plakayı 300 x g'da 10 °C'de 2 dakika santrifüjleyin. Plakayı hızlı bir şekilde çevirerek tamponu atın.
    5. Hücreleri propidyum iyodür (1 μg/mL) içeren 150 μL FACS tamponu ile yeniden süspanse edin. Hücreleri bir akış sitometresi ile analiz edin.

2. Ham PEC'ler kullanılarak mast hücre degranülasyon deneyi

  1. Mast hücresi degranülasyonunun derecesini belirleyin (% degranülasyon).
    1. 3 μg anti-DNP mAb (fare IgE) ile intravenöz (i.v.) 3 BALB / C faresine (8 haftalık, erkek) enjekte edin. Ab enjeksiyonundan bir gün sonra PEC'leri izole edin (bkz. adım 1.1).
    2. Düz tabanlı 96 kuyulu bir plakada (toplam 4 kuyucuk) 90 μL ham PEC (5.5 x 106 / mL) plakası. Plakayı 37 °C nemlendirilmiş CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
    3. PEC'ler içeren kuyucuklara 10 μL DNP-BSA (1x PBS'de 5 ng/mL) ekleyin. Plakayı 37 ° C'lik bir CO2 inkübatörde 10 dakika inkübe edin.
    4. Plakayı inkübasyondan hemen sonra 10 ° C'de 5 dakika boyunca 300 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanları (100 μL) pipetle dikkatlice alın. Onları buz üzerinde yeni bir yuvarlak tabanlı 96 kuyulu plakada saklayın.
    5. PEC'leri içeren mikroplaka kuyucuklarına 100 μL hücre lizis tamponu (1 x PBS'de% 0.1 Triton X-100, pH 7.4) ekleyin. Plakayı 60 dakika buz üzerinde tutun.
    6. β-heksosaminidaz testini gerçekleştirin.
      1. Degranülasyon testinden sonra buzda depolanan dört setten sırasıyla iki süpernatan ve karşılık gelen hücre lizatlarını alın (bkz. adım 2.1.4 ve 2.1.5). Testin çoğaltılması için süpernatanı ve hücre lizatını iki ayrı oyuğa (her biri 50 μL) bölün.
      2. Her oyuğa 50 μL β-heksosaminidaz substrat çözeltisi ekleyin. Plakayı 37 °C'de 30 dakika inkübe edin. Reaksiyon karışımına 50 μL durdurma çözeltisi (100 mM glisin, pH 10.7) ekleyin.
      3. Reaksiyon karışımlarının OD'sini okuyun (bkz. adım 1.4.3). Mast hücresi degranülasyonunun derecesini aşağıdaki gibi hesaplayın.
        % Degranülasyon = ODsüpernatanı /(ODsüpernatan + ODlizat) X% 100
    7. Histamin tahlilini gerçekleştirin.
      1. Numunelerin toplam hacmini 200 μL'ye getirmek için süpernatanların başka iki kuyusuna ve degranülasyondan sonra kaydedilen karşılık gelen hücre lizatlarına 100 μL 1x PBS ekleyin. Her numuneyi, histamin ELISA kiti ile birlikte verilen bir histamin ELISA plakasında iki ayrı oyuğa bölün.
      2. ELISA testini üretici kılavuzuna göre gerçekleştirin. 450 nm dalga boyunda UV görünür absorbanslı mikroplaka okuyucu ile numunelerin OD'sini okuyun. 2.1.6.3'teki gibi degranülasyon derecesini hesaplayın.
        % Degranülasyon = [histamin]sup /([histamin]sup + [histamin]lizat) X %100
  2. Antialerji ilaçlarının uygulanan mast hücreleri üzerindeki etkilerini değerlendirin in vivo ex vivo mast hücre degranülasyon testi ile.
    1. Farelere (6 haftalık, erkek) 3 gün boyunca günde bir kez (6 fare / grup) sırasıyla 200 μL deksametazon19 (DEX) ve ketotifen20 (KET) oral yoldan (po) uygulayın.
    2. 3. tedaviden sonra farelere intravenöz olarak (i.v.) 3 μg anti-DNP IgE enjekte edin. Her fare grubunu iki ayrı kafese bölün (3 fare/kafes); biri PSA testi ve diğeri ex vivo mast hücre degranülasyon testi için.
    3. PSA testi yapın
      1. Anti-DNP IgE enjeksiyonundan bir gün sonra farelere DNP-BSA (80 μg) enjekte edin. DNP-BSA enjeksiyonundan hemen sonra başlayarak vücut sıcaklığını 1 saat boyunca her 15 dakikada bir rektal termometre ile ölçün.
      2. DNP-BSA enjeksiyonundan bir gün sonra kanı alın. ELISA ile serumdaki MCPT-1 seviyelerini ölçün.
    4. Ex vivo mast hücre degranülasyon testi gerçekleştirin.
      1. Anti-DNP IgE enjeksiyonundan bir gün sonra farelerden PEC'leri izole edin. İzole edilmiş PEC'lerin sayısını sayın.
      2. 96 oyuklu bir plakada (fare başına 4 kuyucuk) 90 μL ham PEC (5.5 x 106 / mL) plakası. Plakaları 37 °C nemlendirilmiş CO2 inkübatörde 30 dakika inkübe edin.
      3. 10 μL DNP-BSA (5 ng/mL) ekleyin. Plakayı 37 ° C nemlendirilmiş CO2 inkübatörde 10 dakika inkübe edin.
      4. Plakayı 300 x g'da 10 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanları (100 μL) dikkatlice alın ve hücreleri kuyularda geride bırakın.
      5. Kuyucuklara 100 μL hücre lizis tamponu ekleyin. Plakayı 60 dakika buz üzerinde inkübe edin.
      6. 2.1.6 ve 2.1.7'de tarif edildiği gibi β-heksosaminidaz testi ve histamin ELISA testi gerçekleştirin. Adım 2.1.6.3'teki gibi % degranülasyonu hesaplayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Ex vivo mast hücre degranülasyon deneyi için optimal PEC sayısının belirlenmesi

Mast hücreleri (c-kit+· IgE + çift pozitif hücreler)15 PEC'lerin sadece yaklaşık %2'sini temsil eder (Şekil 1A). Granüllerin 0'ünün PEC'lerdeki mast hücreleri tarafından salındığı varsayımıyla kültür süpernatantlarında tespit edilecek maksimum mast hücresine özgü molekül seviyelerini tahmin ederek, farklı sayıda PEC'lerle h...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mast hücre degranülasyon testinin nispeten az sayıda ham fare PEC'si ile gerçekleştirilebileceği bulgusu önemlidir. PEC'lerin mükemmel bir birincil fare mast hücresi kaynağı olması gerekse de, PEC'lerdeki mast hücrelerinin saflaştırılması talep edilmektedir. Percoll25 gibi bir yoğunluk gradyan ortamı, sıçan PEC'lerinden mast hücrelerinin saflaştırılması için başarılı bir şekilde kullanılmış olsa da, fare peritoneal mast hücrelerinin saflaştırılması için kullanımı,...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Teknik ve idari yardımları için Bay Wonhee Lee ve Bayan Eunjoo Lee'ye teşekkür ederiz. Ayrıca düşünceli yorumları için Dr. Thi Minh Nguyet Nguyen'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, Chungnam Ulusal Üniversitesi'nden (CNU Araştırma Bursu 2017-2098-01) ve Kore Ulusal Araştırma Vakfı'ndan (NRF-2019R1F1A1061894 ve NRF-2019M3A9G4067293) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1 mL şırınga1757589701
1,5 mL mikro tüpHisolMT-15003
10 mL şırınga1757593161
15 mL konik tüpThermo Fisher scientific14-959-53A
20xPBSTech & YenilikBPB-9121-500mL
4-nitrofenil-N-asetil-β-D-glukozaminidSIGMAN9376
5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüpYaşam bilimleri352003
50 mL konik tüpThermo Fisher bilimsel14-959-49A
Alüminyum FiolBioFactTS1-3330
Anti-fare CD117 (c-kiti)Biolegend1351292-8 ° C'de kalır; C
Anti-fare IgE mAbsThermo Fisher scientific11-5992-812-8 ° C'de tutun; C
Antiti-DNP-IgESIGMAD8406-.2MG-20 ° C'de tutun;
C SantrifüjHANIL396150
D-(+)-gluozSIGMAG8270
DeksametazonSIGMAD2915-100MG
DNP-BSAcanlandırıcı2079360-20 ° C'de tutun; C
EDTABiofactPB131-500
Fetal Sığır serumuThermo Fisher bilimsel11455035
JelatinSIGMAG1890
GlisinJUNSEI27185-0350
hemositometreZEISS176045
HEPESThermo Fisher bilimsel15630130
Histamin ELISA kitiAbcamGK3275957-42-8 ° C'de tutun; C
Ocak gözü karıştırıcıLaboratuvarızso-9001
IsofluranceTroikaaI29159
ketotifen fumarat tuzuSIGMAK2628
MCPT-1 ELISA kitiThermo Fisher scientific88-7503-222-8 & derecede tutun; C
Fare Fc bloğuBD Biosciences5531412-8 ° C'de kalır; C
Propidium iyodiolSIGMA818452-8 ° C'de tutun; C
RBC lizis tamponuBiolegend420301
Yuvarlak tabanlı 96 kuyuluSPL-yaşam bilimleri30096
Tek kullanımlık şırınga filtresiStartoriusag16555
Streptavidin mikro boncuklarıMilteryiBiotec130-048-1012-8 & ° C'de tutun; C
Triton X-100HAZİRANİM49415-1601
TWEEN 20SIGMA9005-64-5
Su banyosuCHANGSHINSCIENCE190107

Kaynaklar

  1. Amin, K. The role of mast cells in allergic inflammation. Respiratory Medicine. 106 (1), 9-14 (2012).
  2. Holgate, S., et al. The anti-inflammatory effects of omalizumab confirm the central role of IgE in allergic inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 115 (3), 459-465 (2005).
  3. Galli, S. J., Tsai, M. IgE and mast cells in allergic disease. Nature Medicine. 18 (5), 693(2012).
  4. Roth, K., Chen, W. M., Lin, T. J. Positive and negative regulatory mechanisms in high-affinity IgE receptor-mediated mast cell activation. Archivum Immunologiae et Therapiae Experimentalis. 56 (6), 385-399 (2008).
  5. Finn, D., Walsh, J. Twenty-first century mast cell stabilizers. British Journal of Pharmacology. 170 (1), 23-37 (2013).
  6. Lu, Y., et al. Emodin, a naturally occurring anthraquinone derivative, suppresses IgE-mediated anaphylactic reaction and mast cell activation. Biochemical Pharmacology. 82 (11), 1700-1708 (2011).
  7. Demo, S., et al. Quantitative measurement of mast cell degranulation using a novel flow cytometric annexin-V binding assay. Cytometry: The Journal of the International Society for Analytical Cytology. 36 (4), 340-348 (1999).
  8. Passante, E., Ehrhardt, C., Sheridan, H., Frankish, N. RBL-2H3 cells are an imprecise model for mast cell mediator release. Inflammation Research. 58 (9), 611-618 (2009).
  9. Fukuishi, N., et al. Does β-hexosaminidase function only as a degranulation indicator in mast cells? The primary role of β-hexosaminidase in mast cell granules. The Journal of Immunology. 193 (4), 1886-1894 (2014).
  10. Malbec, O., et al. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro model of mature serosal-type mouse mast cells. The Journal of Immunology. 178 (10), 6465-6475 (2007).
  11. Arock, M., Le Nours, A., Malbec, O., Daëron, M. Innate Immunity. , Springer. 241-254 (2008).
  12. Befus, A., Pearce, F., Gauldie, J., Horsewood, P., Bienenstock, J. Mucosal mast cells. I. Isolation and functional characteristics of rat intestinal mast cells. The Journal of Immunology. 128 (6), 2475-2480 (1982).
  13. Yoon, S. C., et al. Anti-allergic and anti-inflammatory effects of aqueous extract of Pogostemon cablin. International Journal of Molecular Medicien. 37 (1), 217-224 (2016).
  14. Mierke, C. T., et al. Human endothelial cells regulate survival and proliferation of human mast cells. Journal of Experimental Medicien. 192 (6), 801-812 (2000).
  15. Hermes, B., et al. Altered expression of mast cell chymase and tryptase and of c-Kit in human cutaneous scar tissue. Journal of Investigative Dermatology. 114 (1), 51-55 (2000).
  16. Wendeler, M., Sandhoff, K. J. Hexosaminidase assays. Glycoconjugate Journal. 26 (8), 945-952 (2009).
  17. Russell, M., et al. Learned histamine release. Science. 225 (4663), 733-734 (1984).
  18. Darzynkiewicz, Z., et al. Features of apoptotic cells measured by flow cytometry. Cytometry. 13 (8), 795-808 (1992).
  19. Kitamura, Y., et al. Dexamethasone suppresses histamine synthesis by repressing both transcription and activity of HDC in allergic rats. Allergology International. 55 (3), 279-286 (2006).
  20. Grant, S. M., Goa, K. L., Fitton, A., Sorkin, E. M. Ketotifen. A review of its pharmacodynamic and pharmacokinetic properties, and therapeutic use in asthma and allergic disorder. Drugs. 40 (3), 412-448 (1990).
  21. Cook, E., Stahl, J., Barney, N., Graziano, F. Mechanisms of antihistamines and mast cell stabilizers in ocular allergic inflammation. Current Drug Targets-Inflammation & Allergy. 1 (2), 167-180 (2002).
  22. Schoch, C. In vitro inhibition of human conjunctival mast-cell degranulation by ketotifen. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 19 (1), 75-81 (2003).
  23. Franchimont, D., et al. Inhibition of Th1 immune response by glucocorticoids: dexamethasone selectively inhibits IL-12-induced Stat4 phosphorylation in T lymphocytes. The Journal of Immunology. 164 (4), 1768-1774 (2000).
  24. Simmons, C. P., et al. The clinical benefit of adjunctive dexamethasone in tuberculous meningitis is not associated with measurable attenuation of peripheral or local immune responses. The Journal of Immunology. 175 (1), 579-590 (2005).
  25. Cavalher-Machado, S. C., et al. The anti-allergic activity of the acetate fraction of Schinus terebinthifolius leaves in IgE induced mice paw edema and pleurisy. International Immunopharmacology. 8 (11), 1552-1560 (2008).
  26. Dhakal, H., et al. Gomisin M2 inhibits mast cell-mediated allergic inflammation via attenuation of FcεRI-mediated Lyn and Fyn activation and intracellular calcium levels. Frontiers in Pharmacology. 10, 869(2019).
  27. Galli, S. J., Wedemeyer, J., Tsai, M. Analyzing the roles of mast cells and basophils in host defense and other biological responses. International Journal of Hematology. 75 (4), 363-369 (2002).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Ex Vivo AnalizHam PEC zolasyonuAnti DNP IgE TedavisiDNP Ta y c Protein nk basyonuMast H cre Stabilizat r Do rulamasAlerji lac TestiPasif Sistemik Anafilaksi
Video yakında
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.