Burada, torasik kanal lenfositlerinin toplanması ve sıçan Peyer'in yamalarında bağırsak-tropik lenfositlerin zaman atlamalı fotoğrafçılığı kullanarak 3 saat boyunca göç ettiğini gözlemlemek için kesin bir yöntem açıklıyoruz. Bu teknik, lenfositlerin dinamiklerinin enflamatuar koşullar altında nasıl etkilendiğini netleştirebilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Sıçan Peyer Yamalarında Lenfosit Dinamiği Mikroskobik Gözlemi
Bu makalede
Özet
Özet
Naif lenfositler fizyolojik durum altında kandan lenfoid dokulara sirkülasyon yapar ve genellikle bağırsak bağışıklığında önemli bir fenomen olarak kabul edilir. Peyer yamaları (PP'ler) veya mezenterik lenf düğümleri gibi ikincil lenfoid organların stroma'sı, naif lenfositlerin antijenleri algıladığı yerdir. Naif lenfositler, PP'lere giriş portalı olan yüksek endotel venule'lere ulaşmak için kan dolaşımında dolaşır. Bazı immünomodülatörlerin lenfosit göçini etkilediği tahmin edilmektedir, ancak mikrositülasyon dinamiklerinin kesin olarak değerlendirilmesi çok zordur ve lenfosit göçini in vivo olarak gözlemlemek için bir yöntem oluşturmak kesin mekanizmaların netleşmesine katkıda bulunabilir. Lenf kanalından lenfosit toplama ve sıçan PP'lerindeki bağırsak-tropik lenfositlerin ayrıntılı dinamiklerini gözlemleme yöntemini iyileştirdik. Fare PP'lerini in vivo olarak gözlemlemek için konfokal lazer tarama mikroskopisini seçtik ve zaman atlamalı fotoğrafçılık kullanarak kaydettik. Artık lenfosit dinamiklerinin analizine katkıda bulunabilecek net görüntüler elde edebiliriz.
Giriş
Peyer'in yamaları (PP'ler) ince bağırsağın lamina propriasında yüzlerce lenfoid folikülden oluşur. PP'ler foliküllere, foliküller bölgeye ve lenfositlerin antijen sunumu ile uyarıldığı foliküllerin alt kısmında bulunan germinal merkezlere ayrılır. Farklı lenfatik damarlar yoktur ve antijenler epitel hücre tabakası yoluyla bağırsak lümeninden lamina propriasını istila eder. Lenfoid folikülleri kapsayan epitel bölgesine, özel serpiştirilmiş M hücrelerinin mukozal antijenleri aldığı folikül ilişkili epitel denir. M hücreleri luminal taraftan antijenleri alır ve antijenler daha sonra dendritik hücreler tarafından yakalanır ve yüksek endotel venules (HEV' ler) endotel yoluyla PP'lere akan naif lenfositlere doğru sunulur1. PP'ler bağırsak bağışıklığında önemli bir rol oynar ve iltihabın erken evresi ile ilgilidir. Birçok moleküler etkileşim, lenfositlerin yapışma molekülleri, kemokinler 2,3ve sphingosine-1-fosfat4dahil olmak üzereikincil lenfoid organlara (SLO' lar) girişini içerir; bu nedenle, beklenen birçok terapötik hedef vardır. Bu nedenle, PP'lerdeki lenfosit dinamiklerini gözlemlemek, iltihabın çok erken aşamasına bir göz atmamızı ve umut verici birkaç ilacın yararlılığını incelememizi sağlar.
Buradaki yöntem, PP'lerde lenfositlerin göçüne odaklanır, bu da çeşitli prosedürleri içerir (torasik kanal5'e öykünme ve lenfositlerin toplanması ve toplanan lenfositlere enjeksiyondan sonra uzun süreli gözlem). Bu prosedürler karmaşık olduğundan ve önceki raporlarda her prosedürün tam olarak nasıl yapıldığını görmek zor olduğundan, başarılı bir gözlem elde etmek için burada bazı ipuçlarından bahsettik. Örneğin, tüplerin torasik kanala girebilmesi çok zordu ve ilk başarı oranı% 50'den azdı. Bununla birlikte, yöntemi geliştirdik ve% 80'i aşan bir başarı oranı elde ettik. Bu yazıda, lenfositlerin transendotelit göçünün çeşitli koşullar altında nicel olarak değerlendirilmesini sağlamak için başarılı gözlem için gerekli olan diğer bazı ipuçlarından bahsetmiştir.
Önceki raporlarda, PPs6'nındamar yapısını leke etmek için Hindistan mürekkebinin intravenöz enjeksiyonu veya mikroskop monofokal7gibi zamandaki üç boyutlu değişiklikleri anlamak zordu. Son yıllarda, Kaede fareleri gibi bazı foto-dönüşümlü floresan protein transgenik hayvanlar kullanılarak gözlemsel bir yöntem, sistematik hücresel hareketleri netleştirdi vivo8. Diğer çalışma, CD69 lenfosit çıkışlarının PPs9'danbağımsız olarak kapatılmasını açıklığa kavuşturdu. Yüksek analitik özelliği nedeniyle konfokal lazer tarama mikroskopisi (CLSM) kullandık. Artık yüksek çözünürlüklü görüntüleri kolayca elde edebilir ve lenfosit dinamiklerini analiz etmek için kullanabiliriz.
Bu olguda PP'lerde lenfosit göçünün değerlendirilmesi için bir dizi yöntem gösterilmiştir. İlk olarak, lenfositleri toplamak için torasik kanal cannülasyonunun rafine yöntemlerini gösterdik. İkinci olarak, gözlemsel yöntemleri mikroskobik gözlem altında mümkün olduğunda objektif organları korumak için çeşitli şekillerde geliştirdik ve 3 saat boyunca yüksek kaliteli görüntüler elde etmemizi sağladık. Üçüncü olarak, bazı ilaçların etkilerini değerlendirmek için lenfosit göçünün hücresel hareketlerini ölçtük. Bu değiştirilmiş protokoller mukozal immünoloji değerlendirmelerinin geliştirilmesine katkıda bulunacaktır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneysel protokol, Ulusal Savunma Tıp Koleji Hayvan Araştırma Komitesi (no. 16058) tarafından onaylanmıştır. Hayvanlar standart laboratuvar yemeklerinde (CLEA Japan Inc, Tokyo, Japonya) muhafaza edildi. Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri yönergelerine uygun olarak tedavi edildi.
1. Lenfositlerin toplanması ve ayrılması
NOT: Lenfositler taze olması ve depolanamaması gerektiğinden, her deney için sıçanlardan toplanmalıdır. Ek olarak, bağırsak-tropik lenfositler doğrudan dolaştıkları torasik kanaldan toplanmalıdır. Tüm prosedürlerin 6 saat içinde tamamlanması beklenir ve tüm aletler, eldivenler ve yüzeyler temizdir. Hayvanları fizyolojik olarak stabil bir durumda tutmak için, deneyde kullanılan tüm tuzlu su ve diğer sıvılar sıcak tutulmalıdır.
- Sıcak suya (yaklaşık 80-90 °C) batırdıktan sonra heparin eğrisi (yaklaşık 5 mm yarıçapı) gibi bir kavis tüpü (1 mm çapında) oluşturur ve birkaç saat önceden yapışkan bant kullanarak plastik bir tahtaya sabitleyin.
- Midazolam (2mg/kg), Domitor (0.15mg/kg) ve Betulphar (2.5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile erkek bir Wistar sıçanını (8-12 hafta) uyuşturun ve bir saç kesme makinesi kullanarak karnın vücut kıllarını kesin. Tıraş olduktan sonra saçları sıkıca çıkarın, böylece saç karın boşluğuna girmez.
- İşlem için gerekli olan sabit anestezi derinliğinin parmak sıkışması ile elde edildiğini doğruladıktan sonra orta çizgiden sol altkozal bölgeye yatay olarak cerrahi makasla bir kesi yapın. Işık altındaki damarları izleyerek parietal peritondaki kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
- Mideyi ıslak gazlı bezle sarın ve retroperitoneal organları ortaya çıkarmak için mideyi hafifçe vücudun dışına doğru hareket ettirin. Cerrahi makas kullanarak omurganın erektör kasları ile yağ dokusu arasına bir çentik yerleştirin ve parmaklarla açıkça ayırın.
- Torasik kanalın etrafındaki bağ dokusunu dikkatlice çıkarın. Fazla bağ dokusu yaşla birlikte artar. Torasik kanalın 20 mm uzunluğu görünene kadar diyaframın sol haçlarının hemen altından kaudally olarak ortaya çıkın. Hassas cımbız veya ıslak pamuklu çubuklar kullanarak torasik kanal ve aort arasındaki yapışıklıkları hafifçe ayırın.
- Bu işlemi dikkatlice gerçekleştirin, çünkü bazı sıçanlar, lenf pleksusunun (örümcek ağları gibi yayılan küçük torasik kanallar) daha yüksek bir konumu nedeniyle torasik kanal veya kısa bir torasik kanal üzerinden geçen karın arterinden dallanma arteriküllerine sahiptir. Ödemi önlemek için torasik kanala gereksiz temastan kaçının.
- Diyaframın sol haçlarının hemen altındaki torasik kanala bir dize (3-0 ipek) ile bir bağ uygulayın. Kaudal torasik kanal distended olur.
- Cerrahi makasın kesme kenarını bıçaklayarak karın duvarında bir delik (5 mm çapında) yapın, saç tokası kavisli kavis tüpünü geçirin ve tüpü bir noktada iliopsoas kasında lige edin. Kanülasyon tüpünü 10 U/mL heparin içeren normal salin ile doldurun.
- Distended torasik kanalın altına bir ip (3-0 ipek) yerleştirdikten sonra, torasik kanalı bir kanülasyon tüpünün keskin bir şekilde kesilmiş kenarıyla bıçaklayın, kuyruğa doğru yaklaşık 5 mm'lik bir şekilde kanülasyona doğru kanülat ve sabitleme için torasik kanalı kanülasyon tüpü ile kesin.
- Dehidrasyonu önlemek için salin sağlamak için, hassas cımbız kullanarak mide karıncalanmasının ön duvarında bir delik (3 mm çapında) oluşturun ve silikon tüpü (2 mm çapında) pirorik halkadan duodenuma geçirin. Bir yarayı diktikten ve Bollman'ın kafeslerindeki hayvanların bakımını yaptıktan sonra, silikon tüpten her sıçanın duodenumuna 3 mL / s akış hızında şeker yüklü salin aşılamaya başlayın. Tüm kafesi sıcak tutmak için bir kağıt havlu ile örtün.
- Kanülasyon tüpünü, 6 U/mL heparin, %10 fetal sığır serumu ve RPMI 1640 ortamı (pH 7.4; malzeme tablosuna bakın) içeren buz üzerindeki 50 mL'lik konik tüpün kapağının ortasındaki deliğe sabitlayın ve buz üzerinde torasik kanal lenfositleri (TDL' ler) toplayın. Tüpün içindeki fibrin pıhtı oluşumuna bağlı olarak kanüle edilmiş tüp tıkanıklığını önlemek için tüpün ucunu konik tüpün duvarına temas etmemeye dikkat edin. Yaklaşık 1.0 x 10 8 ~109lenfosit içeren lenf sıvısı (yaklaşık20 mL) 6 saat içinde elde edilebilir. Lenfositleri tam anestezi altında elde etmek için anestezi düzlemi izlenir ve lenf akışı uygun şekilde gözlenir. Aynı anestezikler, sıçanlar Ballman'ın kafesine konduktan yaklaşık 3 saat sonra 6 saat boyunca sürekli derin anestezi elde etmek için aynı dozda eklenir.
2. Karboksifluorescein diasetat succinimidyl ester (CFDSE) ile lenfosit etiketleme
- CFDSE'yi(Malzeme Masası)dimetil sülfit (DMSO) ile 15,6 mM (60 μL DMSO'da çözünmüş 500 μg CFDSE) ile çözün.
- Daha önce açıklandığı gibi 37 °C'de 30 dakika boyunca50 μLCFDSE çözeltisi ile 50 mL RPMI 1640'ta inkübte lenfositler (1 x 108~10 9).
3. Mikrovasküler çalışmalar için deneysel kurulum
- Alıcı sıçanları (8-12 hafta) Midazolam (2mg/kg), Domitor (0,15mg/kg) ve Betulphar (2,5mg/kg) karışımının intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun ve anestezinin derinliğini parmak sıkışması ile onaylayın. Saç kirlenmesini en aza indirmek için kürkü tımar etmeden önce karnı ıslatın. Daha sonra alıcı Wister sıçanının karnını orta çizgi kesiğiyle açın.
- Merkezin etrafında cam bir slaytla (24 x 50 mm) kaplı dikdörtgen deliği olan taşınabilir paslanmaz çelik bir plakaya (yaklaşık 120 x 300 mm) bir sıçan koyun. Gözlem için PP'ler de dahil olmak üzere ileal segmentin yaklaşık 10 cm'sini seçin.
- Bağırsağı mümkün olduğunca sıcak tutun ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile 37 °C'ye ısıtılır. İnce bağırsağı PBS ile örtmek için kullanılan gazlı bezi ıslatın.
- % 2 izofluran ile sürekli anestezi verirken (bkz. malzeme tablosu), slaytı mikroskop sahnesine koyun ve bazı HEV'lerin serosadan geçtiği PP'lerde mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygun alanları seçin. PEN'lerin boyut aralığı; daha büyük olanlar CLSM kullanarak mikroskrkülasyonun gözlemlenmesi için uygundur. İnce bağırsak yerlerde düz değildir; herhangi bir gerginlik olmadan en az 2 cm uzunluğunda düz bir segment gözlem için uygundur.
- Bitişik bağırsak segmentini ve mezentery'yi PBS ile ıslatılmış emici pamukla örtün. Bağırsak segmentini iki yuvarlanmış pamuk topu arasına yerleştirin ve sıçanın kalp atışı ve solunumu tarafından titreşmesini önlemek için sıçanın vücudundan mümkün olduğunca uzağa yerleştirin.
- 1 mL şırıng kullanarak, alıcı sıçanların şahdamarına cfse etiketli TDL'leri (1 x10 8 hücre) yavaşça enjekte edin. Hızlı bir intravenöz enjeksiyon sistemik dolaşımı etkileyebilir.
4. Lenfositlerin mikrositülasyonu
- CLSM kullanarak PP'lerin mikrovaskülatındaki TDL'leri sürekli izleyin ve 30 s aralıklarla hızlandırılmış fotoğrafçılık kullanarak bir bilgisayarda 3 saat boyunca kayıt yaptırın. Serosadan PP'lerin HEV'sine kadar olan derinlik yaklaşık 25 μm'dir ve stroma ve kılcal lenf damarlarının 30 μm derinliğe kadar gözlemlenmesine olanak tanır.
- Kan dolaşımını lekelamak için her alıcı sıçanın şahdamarına Texas Red-dektran (25 mg/kg) ve hücre çekirdeğini lekelamak için Hoechest 33342 (5 mg/kg) enjekte edin.
- (İsteğe bağlı) Lenfosit dinamiklerini ölçmek için, HEV'lere bağlı kalan lenfositleri 30 saniyeden fazla "yapışkan lenfositler" ve HEV'lerden stroma'ya göç eden lenfositleri ''lenfositler' olarak tanımlayın. Daha sonra görme alanı başına ortalama göç yüzdesini (göç eden lenfositler / yapışkan lenfositler + göç eden lenfositler) hesaplayın (yaklaşık 0,3 mm2).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Lenfositlerin lenfositlerden toplanması
Sıçanı torasik kanal cannülasyonuna hazırlamak için, Şekil 1'de gösterildiği gibi gergin torasik kanala bir kesi yapın ve daha sonra sıçanı Şekil 2'degösterildiği gibi bir Bollman'ın kafesinde muhafaza edin.
Lenfositler iyi toplandığında, yaklaşık 107~ 10 8 / mL lenfosit içeren yaklaşık 20 mL /6h lenf sıvısı elde edebiliriz. TDL'lerin% 70'i CD4'ü, aralar...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada naif gut-tropik lenfositlerin toplanması ve sıçan PP'lerinde göçlerinin gözlemlenmesi için bir protokol tanımladık. Bu prosedürler, lenfositlerin PP'lerin mikrovaskülürinde nasıl hareket ettiğini ortaya getirebilir ve dinamiklerini normal veya ilaçlı bir durum altında görsel olarak karşılaştırmayı mümkün kılabilir. Gözlem süresi sadece birkaç saatle sınırlı olmasına rağmen, bu dinamiklerin doğrudan gözlemlenmesi, bazı ilaçlar tarafından immünolojik modifikasyon için bir ipucu elde etmek için çok değerlidir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma, Ulusal Savunma Tıp Koleji'nden ve Japonya Sağlık, Çalışma ve Refah Bakanlığı'nın inatçı hastalıklarla ilgili araştırmalar için sağlık ve çalışma bilimleri araştırma hibesi ile desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| A1R + | Nikon | Komfokal Lazer Tarama Mikroskobu | |
| Karboksifloresein diasetat süksinimidil ester | Thermo Fisher Scientific | C1157 | |
| Hoechest 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
| İzofluran | Wako Saf Kimya Endüstrileri | 099-06571 | |
| RPMI 1640 orta | GIBCO | 11875093 | |
| Teksas Kırmızısı– dekstran | Termo Balıkçı Bilimsel | D1863 |
Kaynaklar
- Miura, S., Hokari, R., Tsuzuki, Y. Mucosal immunity in gut and lymphoid cell trafficking. Annals of Vascular Diseases. 5, 275-281 (2012).
- Stein, J. V., Nombela-Arrieta, C. Chemokine control of lymphocyte trafficking: a general overview. Immunology. 116, 1-12 (2005).
- Yopp, A. C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptors regulate chemokine-driven transendothelial migration of lymph node but not splenic T cells. The Journal of Immunology. 175, 2913-2924 (2005).
- Lucke, S., Levkau, B. Endothelial functions of sphingosine-1-phosphate. Cellular Physiology and Biochemistry. 26, 87-96 (2010).
- Bollman, J. L., Cain, J. C., Grindlay, J. H. Techniques for the collection of lymph from the liver, small intestine, or thoracic duct of the rat. The Journal of Laboratory and Clinical. 333, 1349-1352 (1948).
- Bhalla, D. K., Murakami, T., Owen, R. L. Microcirculation of Intestinal Lymphoid Follicles in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 81, 481-491 (1981).
- Miura, S., et al. Intravital Demonstration of Sequential Migration Process of Lymphocyte Subpopulations in Rat Peyer's Patches. Gastroenterology. 109, 1113-1123 (1995).
- Tomura, M., et al. Monitoring cellular movement in vivo with photoconvertible fluorescence protein "Kaede" transgenic mice. Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 10871-10876 (2008).
- Schulz, O., et al. Hypertrophy of Infected Peyer's Patches Arises From Global, Interferon-Receptor, and CD69-independent Shutdown of Lymphocyte Egress. Mucosal Immunology. 7, 892-904 (2014).
- Higashiyama, M., et al. P-Selectin-Dependent Monocyte Recruitment Through Platelet Interaction in Intestinal Microvessels of LPS-Treated Mice. Microcirculation. 15, 441-450 (2008).
- Shirakabe, K., et al. Amelioration of colitis through blocking lymphopcytes entry to Peyer's patches by sphingosine-1-phosphate lyase inhibitor. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 33, 1608-1616 (2018).
- Cenk, S., Thorsten, R. M., Irina, B. M., Ulrich, H. A. Intravital Microscopy: Visualizing Immunity in Context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Alex, Y. C. H., Hai, Q., Ronald, N. G. Illuminating the Landscape of In Vivo Immunity: Insights from Dynamic In Situ Imaging of Secondary Lymphoid Tissues. Immunity. 21, 331-339 (2004).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
