Method Article

Serotip 1 Streptococcus pneumoniae suşunda Mutantların İnşası 519/43

DOI:

10.3791/61594

⸱

September 11th, 2020

 ,  ,  ,  , 
1Faculty of Infections and Tropical Diseases, Department of Infection Biology, London School of Hygiene and Tropical Medicine, 2Division of Medicine, University College London, 3Division of Infection and Immunity, University College London UCL

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, doğal olarak DNA ve intihar plazmidini elde etme kabiliyeti kullanılarak genetik olarak değiştirilebilen bir S. pneumoniae serotip 1 suşu 519/43'ü tanımlıyoruz. İlke kanıtı olarak, pnömolysin (kat) geninde izojenik bir mutant yapıldı.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae serotip 1, düşük ve orta gelirli ülkelerde, özellikle Sahra altı Afrika'da büyük bir sorun olmaya devam etmektedir. Önemine rağmen, bu serotipteki çalışmalar, onu değiştirmek için genetik araçların eksikliği nedeniyle engellenmiştir. Bu çalışmada, bir serotip 1 klinik izolatı genetik olarak değiştirmek için bir yöntem tarif edilmiştir (suş 519/43). İlginç bir şekilde, bu, Pnömokokların doğal olarak DNA elde etme yeteneğinden yararlanarak elde edildi. Bununla birlikte, çoğu pnömokoktan farklı olarak, lineer DNA kullanımı başarılı değildi; Bu önemli suşu mutasyona uğratmak için bir intihar plazmidinin kullanılması gerekiyordu. Bu metodoloji, hem biyolojisi hem de patojenitesi açısından bu zor serotipin daha derin bir şekilde anlaşılması için araçlar sağlamıştır. Yöntemi doğrulamak için, bilinen başlıca pnömokok toksini olan pnömolizin, iyi bilinen ve takip edilmesi kolay bir fenotipe sahip olduğu için mutasyona uğradı. Mutantın, beklendiği gibi, kırmızı kan hücrelerini lize etme yeteneğini kaybettiğini gösterdik. İlgilenilen serotipte önemli bir geni mutasyona uğratarak, intraperitoneal ve intranazal enfeksiyonlar üzerine fonksiyon kaybı mutantları için diğer serotipler için gözlenenlerden farklı fenotipler gözlemleyebildik. Özetle, bu çalışma 519/43 suşunun (serotip 1) genetik olarak değiştirilebileceğini kanıtlamaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae, pnömokok) tüm dünyada morbidite ve mortalitenin başlıca nedenlerinden biridir. Yakın zamana kadar, 100'e yakın S. pneumoniae serotipi 1,2,3,4,5,6,7 keşfedilmiştir. Yıllık, invaziv pnömokok hastalığı (IPD), 5 yaşından küçük çocukların yaklaşık 700.000 ölümünü iddiaetmektedir 8. S. pneumoniae, tüm dünyada bakteriyel pnömoni, otitis media, menenjit ve septiseminin başlıca nedenidir9.

Afrika menenjit kuşağında, serotip 1, son derece virülan bir sekans tipi olan sekans tipi (ST) ST217'nin baskın olduğu menenjit salgınlarından sorumludur10,11,12,13,14,15. Menenjit patolojisindeki önemi, Afrika menenjit kuşağı16'daki Neisseria meningitidis'inkine benzetilmiştir. Serotip 1 genellikle IPD'nin ana nedenidir; ancak, taşımacılıkta çok nadiren bulunur. Aslında, Gambiya'da, bu serotip tüm invaziv hastalıkların% 20'sinden sorumludur, ancak sağlıklı taşıyıcıların sadece% 0.5'inde bulunmuştur14,17,18,19. Yetkin pnömokoklarda genetik değişim ve rekombinasyon genellikle invaziv hastalıktan ziyade taşıyıcılıkta meydana gelir20. Ayrıca, serotip 1'in pnömokoklar arasında tarif edilen en kısa taşıma oranlarından birine sahip olduğu gösterilmiştir (sadece 9 gün). Bu nedenle, bu serotipin diğerlerinden çok daha düşük bir rekombinasyon oranına sahip olabileceği öne sürülmüştür21.

Serotip 1 suşlarının düşük taşıma hızının arkasındaki nedeni ve Sahra altı Afrika'daki invaziv hastalıklardaki önemini anlamak için derinlemesine çalışmalar gereklidir.

Burada, belirli bir serotip 1 suşunun genom çapında mutagenezine izin veren bir protokol sunuyoruz, 519/43. Bu suş, yeni DNA'yı kolayca elde edebilir ve genomuna yeniden birleştirebilir. Bu yöntem henüz gerginlikler arasında değildir, ancak 519/43 arka planında yapıldığında çok etkilidir (diğer hedefler mutasyona uğramıştır, el yazmaları hazırlanmaktadır). Sadece 519/43 suşunu kullanarak ve doğal yeterliliğinden yararlanarak ve ekzojen DNA'nın sağlanma şeklini değiştirerek, bu serotip 1 suşunda pnömolizin genini (kat) mutasyona uğratabildik. Bu yöntem, Harvey ve ark.22 tarafından sunulana göre bir gelişmeyi temsil eder, çünkü DNA'yı farklı bir serotipten geçirmeye gerek kalmadan tek adımda yapılır. Bununla birlikte, gerinimler arası değişkenlik nedeniyle, hiçbir yöntem tüm suşlar için standartlaştırılmamıştır. Belirli genleri mutasyona uğratma ve etkilerini gözlemleme yeteneği, serotip 1 S. pneumoniae suşlarının derinlemesine anlaşılmasını sağlayacak ve bu suşların Sahra altı Afrika'daki menenjitteki rolüne cevaplar sağlayacaktır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. SOE-PCR23 ile mutasyona uğrayan amplikonun üretilmesi ve spektinomisin kasetinin amplifikasyonu

  1. 519/43 suşundan kat geninin yan bölgelerinin homoloji kollarının (sırasıyla kat 5' (488 bp) ve ply3' (715 bp) amplifikasyonu için PCR uygulayarak başlayın. plyFw1_NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG), ply5'R1_BamHI (CGAAATATAGACCAAAGGACGC GGATCC AGAACCAAACTTGACCTTGA), ply3'F1_BamHI (TCAAGGTCAAGTTTGGTTCTCTGGATCC GCGTCCTTTGGTCTATATTTCG) ve plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTCTACCTCTCTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCCTCT) astarlarını kullanın.
  2. Ply5' için aşağıdaki PCR koşullarını kullanın: 60 sn için 94 °C'de denatür, adım 2: 30 s için 94 °C'de denatür, adım 3: 30 s için 58 °C'de tavlama, adım 4: 30 s için 72 °C'de uzatma, adım 5: adım 2'ye geri dönün ve 35 döngü için tekrarlayın, adım 6: 30 s için 72 °C'de son uzatma.
    1. 60 s olması gereken adım 4 ve adım 6'daki uzatma süresi hariç, kat3' için aynı PCR koşullarını kullanın.
  3. PCR ürünlerini jel elektroforezi ile analiz edin ve amplikonu jelden çıkarın.
  4. PCR amplikonlarını, üreticinin talimatlarında (Malzeme Tablosu) açıklanan protokolü izleyerek saflaştırın.
  5. Her iki homoloji kolunun equimolar miktarlarını SOE-PCR'de şablon olarak kullanın. İki amplikonu primerleri kullanarak birleştirin plyFw1_ NOTI (TTT GCGGCCGCCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATGTTATACTTATGTTATG) ve plyRv2_NotI (TTTGCGGCCGCCATTTTCTACCTCTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCTCCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTTCCC) iki amplikonu iki amplikonu birleştirin.
  6. Aşağıdaki SOE-PCR koşullarını kullanın (adım 1: 2 dakika boyunca 94 °C'de denatür, adım 2: 30 sn için 94 °C'de denatür, adım 3: 30 s için 58 °C'de tavlama, Adım 4: 60 s için 68 °C'de uzatma, adım 5: adım 2'ye geri dönün ve 25 döngü için tekrarlayın, adım 6: 90 s için 68 °C'de son uzatma).
  7. SOE-PCR ürününü jel elektroforezi ile analiz edin. Bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak jelden tüketin ve verilen talimatları izleyin.
  8. Aşağıdaki PCR koşullarını kullanarak spektinomisin kasetini plazmid pR412'den yükseltin: adım 1: 60 s için 94 °C'de denatür, adım 2: 30 s için 94 °C'de denatüre etme, adım 3: 30 s için 55 °C'de tavlama, adım 4: 60 s için 68 °C'de uzatma, adım 5: adım 2'ye geri dönün ve 25 döngü boyunca tekrarlayın, Adım 6: 60 s için 68 ° C'de son uzatma.
    1. Astarları BamHI_SP2F2 (GGATCC CTA GAA CTA GTG GAT CCC CC) ve BamHI_SP2R2 (GGATCC AAT TCT GCA GAT TTT AC ATG ATC) kullanın. Plazmid pR412, Dr. Marc PrudHomme'dan (CNRS-Universite Paul Sabatier Toulouse Fransa) satın alındı.
  9. PCR amplikonlarını jel elektroforezi ile analiz edin. Elde edilen PCR amplikonunu yukarıda açıklandığı gibi tüketin ve saflaştırın.

2. Plazmid pSD1 üretimi ve E. coli Dh5α'nın kimyasal dönüşümü

  1. pGEMT-easy system I üretici talimatlarını (Malzeme Tablosu) izleyerek bir ligasyon gerçekleştirin. Bir mikrosantrifüj tüpünde, 20 μL'lik toplam hacme 5 μL 2x ligasyon tamponu, 1 μL pGEMTeasy, 2 μL ply_SOE ürünü, 1 μL T4 DNA ligaz ve su ekleyin. Gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bu, plazmid pSD1 üretir.
  2. Kimyasal olarak yetkin E. coli Dh5α'yı pSD1 ile dönüştürün. 50 μL kimyasal olarak yetkin E. coli Dh5α'yı buz üzerinde 15 dakika boyunca 3 μL pSD1 ligasyon reaksiyonu ile inkübe ederek başlayın. Daha sonra hücreleri termik şoka maruz bırakarak devam edin (42 ° C, 30 s). Hücreleri 2 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin.
  3. Hücreleri buzdan çıkarın ve 350 μL S.O.C ortamı ekleyin. Kültürü 37 °C, 120 rpm'de 2 saat boyunca inkübe edin.
  4. Luria Bertani Agar (LBA) üzerindeki transformasyon, plakada büyüyen tüm kolonilerin plazmid omurgasına sahip olmasını sağlamak için mavi / beyaz seleksiyon için 0.4 mM IPTG, 0.24 mg / mL X-Gal ve 100 μg / mL ampisilin ile desteklenir. Beyaz koloniler pSD1 içerir.
  5. Üç beyaz koloni seçin ve 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş 10 mL LB'de gece boyunca büyüme sağlayın. Kültürleri gece boyunca 37 ° C'de sallayarak inkübe edin.
  6. Ertesi gün kültürleri 3.082 x g'de santrifüj edin ve plazmid ekstraksiyonu için peleti kullanın.

3. Plazmid DNA ekstraksiyonu, pSD1 ve spektinomisin geninin kısıtlanması sindirimi ve pSD2'nin montajı

  1. Plazmid DNA'sını, ticari kit (Malzeme Tablosu) ile birlikte verilen talimatları izleyerek çıkarın.
  2. Hem pSD1 plazmid hem de daha önce güçlendirilmiş ve saflaştırılmış spektinomisin kaseti için bir BamHI kısıtlama sindirimi ayarlayın. Tablo 1'de açıklanan aşağıdaki koşulları ve miktarları kullanın.
  3. Kısıtlama sindirim reaksiyonlarını ve kontrollerini 3 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
  4. Kısıtlama sindirimini elektroforez ile analiz edin, bandı tüketin ve ticari kit (Malzeme Tablosu) ile birlikte verilen talimatları izleyerek saflaştırın.
  5. Daha sonra, BamHI sindirilmiş pSD1 ve spektinomisin (adım 3.2'den itibaren) kullanarak üretici talimatlarını (Malzeme Tablosu) izleyerek bir ligasyon reaksiyonu hazırlayın. Bir mikrosantrifüj tüpüne, aşağıdaki reaksiyon bileşenlerini ekleyin: 5 μL 2x ligasyon tamponu, 2 μL pSD1, 2 μL spektinomisin kaseti, 1 μL T4 DNA ligaz ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe edin. Bu, plazmid pSD2 üretir.
  6. Plazmid pSD2'yi, adım 2.2'de açıklandığı gibi kimyasal olarak yetkin E. coli Dh5α'ya dönüştürün.
  7. Plazmid pSD2 taşıyan transformantları, 100 μg / mL spektinomisin ve ampisilin ile desteklenmiş LBA'da büyüme yeteneklerine göre seçin.
  8. Yukarıda açıklandığı gibi ve üreticinin talimatlarını (μL) izleyerek bir plazmid DNA ekstraksiyonu (pSD2) gerçekleştirin.

4. S. pneumoniae suşunun transformasyonu 519/43

  1. BHI'da bir gecede S. pneumoniae 519/43 kültürü hazırlayın ve 37 ° C'de,% 5 CO2'de statik olarak büyümesine izin verin.
  2. Ertesi gün kültürleri 1:50 ve 1:100 olarak 10 mL taze BHI suyunda seyreltin. OD595nm 0.05 ile 0.1 arasında olana kadar kültürleri statik olarak 37 ° C'de inkübe edin (0.1 OD'ye daha yakın DNA'nın optimal kazanımı).
  3. 0.1'lik bir OD'ye ulaşıldığında, 860 μL alın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Aynı mikrosantrifüj tüpünde şunları ekleyin: 100 μL 100 mM NaOH, 10 μL% 20 (w / v) BSA, 10 μL 100 mM CaCl 2,2 μL 50 ng / mL CSP124 ve 500 ng pSD2.
  4. Reaksiyonu 3 saat boyunca 37 °C'de statik olarak inkübe edin.
  5. Plaka 330 μL, 3 inkübasyon saati boyunca her saat başı 100 μg / mL spektinomisin ile desteklenen% 5 kan agar plakaları (BA) üzerine.
  6. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de,% 5 CO2'de inkübe edin. Yama spektinomisin'e dirençli koloniler, 100 μg / mL spektinomisin ile desteklenmiş başka bir BA plakasına ve ayrıca 100 μg / mL ampisilin ile desteklenmiş BA plakalarına yerleştirin. Her iki plaka setini de yukarıda belirtilen koşullar altında gece boyunca inkübe edin. Ampisilin plakaları, plazmid omurgasının varlığını test etmek içindir.
  7. NOTI (TTT GCGGCCGCAGTAAATGACTTTATACTAGCTATG) ve plyFw1_ (TAATTCCTCTAAGTCATAATTTCCG) primerlerini kullanarak spektinomisin kasetinin varlığını PCR SPEC_REV ile onaylayın. Mutasyona uğramış bölgenin dışına bağlanan primerler plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA) ve plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) kullanarak PCR ile mutasyonu onaylayın.
  8. Primerler plySCN1 (CCAATGGAAATCGCTAGGCAAGAGATAA), plySCN2 (ATTACTTAGTCCAACCACGGCTGAT) ve ayrıca spektinomisin kaset sqr1 (CCTGATCCAAACATGTAAGTACC) sqf2 (CGTAGTTATCTTGGAGAGAATA) spec_sqf1 (GGTACTTACATGTTTGGATCAGGCAGG) ve spec_sqr2 TATTCTCTCCAAGATAACTACG içindeki bağlanma bölgelerine sahip primerleri kullanarak genomun doğru konumundaki entegrasyonu onaylayın.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada açıklanan protokol, sol ve sağ homoloji kollarını yükseltmek için PCR kullanarak başlar ve aynı zamanda kat geninin orta bölgesinden 191 bp'yi siler. PCR yapılırken sol homoloji kolunun 3' ucunda ve sağ homoloji kolunun 5' ucunda bir BamHI bölgesi tanıtılır (Şekil 1A). Bunu, sol ve sağ homoloji kollarının bir amplikon halinde kaynaştırıldığı PCR-SOE izler (Şekil 1B). Bu SOE-PCR amplikonu daha sonra plazmid pSD1 üretmek için TA klonlaması kullanıl...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Streptococcus pneumoniae, özellikle serotip 1, invaziv pnömokok hastalığına ve menenjite neden olan küresel bir tehdit olmaya devam etmektedir. Serotip 1'e karşı koruyucu olması gereken çeşitli aşıların uygulanmasına rağmen, Afrika'da bu serotip hala yüksek morbidite ve mortaliteye yol açan salgınlara neden olabilir13. Bu serotipi genetik olarak manipüle etme yeteneği, klinik alaka düzeyi nedeniyle kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada açıklanan yöntem, bu serotip içindeki temsili bir suşun...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Menenjit Vakfı'na ve MRC'ye bu çalışmaya finansman sağladıkları için teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AccuPrime Pfx DNA polimerazInvitrogen12344024Fragmanların amplifikasyonu için kullanılır
Ampisilin sodyum tuzuSigma AldrichA9518Aşama 1'de bakteri seçimi için kullanılır (pSD1)
Kan Agar TabanıOksoitCM0055S. pneumoniae< / em> dönüştürücüleri kaplamak için kullanılır
Sığır Serumu Albüminsigması55470S. pneumoniae Dönüşüm
için kullanılır Beyin Kalp İnfüzyonuOxoidCM1135, S. pneumoniae hücrelerini büyütmek için kullanılır
Kalsiyum Klorür Cacl2Sigma449709S. pneumoniae Dönüşüm
Yeterliliği uyarıcı peptit 1AnaSpecAS-63779S. pneumoniae Dönüşüm
Luria Suyu AgarGibco22700025pSD1 ve pSD2'nin kaplanması ve seçimi için kullanılır
Luria Suyu Tabanı (Miller'ın formülasyonu)Gibco12795027pSD1 ve pSD2'nin kaplanması ve seçimi için kullanılır
Monarch Jel Ekstraksiyon KitiNEBT1020SDNA jeli Monarch Plasmid'den bantları çıkarmak için kullanılır
Miniprep KitiNEBT1010SHücrelerden plazmidi çıkarmak için kullanılır
pGEM T-easyPromegaA1360intihar plazmidi
S.O.C.Dönüşümden sonra hücrelerin geri kazanılması için kullanılaninvitrojen15544034
Sodyum Hidroksit (NaOH)SigmaS0899S.pneumoniae< / em> Dönüşüm
Spektinomisin HidroklorürSigmaAldrichPHR1426Bakteri seçimi için kullanılır
Alt klonlama verimliliği DH5 ve alfa; Yetkili HücrelerpSD1 ve pSD2'nin oluşturulması için kullanılaninvitrojen18265017
olarak kullanılır.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bentley, S. D., et al. Genetic Analysis of the Capsular Biosynthetic Locus from All 90 Pneumococcal Serotypes. PLoS Genetics. 2 (3), 31(2006).
  2. Calix, J. J., Nahm, M. H. A new pneumococcal serotype, 11E, has a variably inactivated wcjE gene. The Journal of Infectious Diseases. 202 (1), 29-38 (2010).
  3. Park, I. H., Pritchard, D. G., Cartee, R., Brandao, A., Brandileone, M. C. C., Nahm, M. H. Discovery of a New Capsular Serotype (6C) within Serogroup 6 of Streptococcus pneumoniae. Journal of Clinical Microbiology. 45 (4), 1225-1233 (2007).
  4. Jin, P., et al. First Report of Putative Streptococcus pneumoniae Serotype 6D among Nasopharyngeal Isolates from Fijian Children. The Journal of Infectious Diseases. 200 (9), 1375-1380 (2009).
  5. Oliver, M. B., vander Linden, M. P. G., Küntzel, S. A., Saad, J. S., Nahm, M. H. Discovery of Streptococcus pneumoniae Serotype 6 Variants with Glycosyltransferases Synthesizing Two Differing Repeating Units. Journal of Biological Chemistry. 288 (36), 25976-25985 (2013).
  6. Calix, J. J., et al. Serological Characterization of Two Capsule Subtypes among Streptococcus pneumoniae Serotype 20 Strains. Journal of Biological Chemistry. 287 (33), 27885-27894 (2012).
  7. Park, I. H., et al. and Serological Characterization of a New Pneumococcal Serotype, 6H, and Generation of a Pneumococcal Strain Producing Three Different Capsular Repeat Units. Clinical and Vaccine Immunology. 22 (3), 313-318 (2015).
  8. O'Brien, K. L., et al. Burden of disease caused by Streptococcus pneumoniae in children younger than 5 years: global estimates. The Lancet. 374 (9693), 893-902 (2009).
  9. Henriques-Normark, B., Tuomanen, E. I. The Pneumococcus: Epidemiology, Microbiology, and Pathogenesis. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 3 (7), 010215(2013).
  10. Leimkugel, J., et al. An Outbreak of Serotype 1 Streptococcus pneumoniae Meningitis in Northern Ghana with Features That Are Characteristic of Neisseria meningitidis Meningitis Epidemics. The Journal of Infectious Diseases. 192 (2), 192-199 (2005).
  11. Yaro, S., et al. Epidemiological and Molecular Characteristics of a Highly Lethal Pneumococcal Meningitis Epidemic in Burkina Faso. Clinical Infectious Diseases. 43 (6), 693-700 (2006).
  12. Antonio, M., et al. Molecular epidemiology of pneumococci obtained from Gambian children aged 2-29 months with invasive pneumococcal disease during a trial of a 9-valent pneumococcal conjugate vaccine. BMC Infectious Diseases. 8 (1), 81(2008).
  13. Kwambana-Adams, B. A., et al. An outbreak of pneumococcal meningitis among older children (≥5 years) and adults after the implementation of an infant vaccination programme with the 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Ghana. BMC Infectious Diseases. 16 (1), 575(2016).
  14. Antonio, M., et al. Seasonality and outbreak of a predominant Streptococcus pneumoniae serotype 1 clone from The Gambia: Expansion of ST217 hypervirulent clonal complex in West Africa. BMC Microbiology. 8 (1), 198(2008).
  15. Staples, M., et al. Molecular characterization of an Australian serotype 1 Streptococcus pneumoniae outbreak. Epidemiology and Infection. 143 (2), 325-333 (2015).
  16. Gessner, B. D., Mueller, J. E., Yaro, S. African meningitis belt pneumococcal disease epidemiology indicates a need for an effective serotype 1 containing vaccine, including for older children and adults. BMC Infectious Diseases. 10 (1), 22(2010).
  17. Hill, P. C., et al. Nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae in Gambian infants: a longitudinal study. Clinical Infectious Diseases. 46 (6), 807-814 (2008).
  18. Ebruke, C., et al. Temporal changes in nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae serotype 1 genotypes in healthy Gambians before and after the 7-valent pneumococcal conjugate vaccine. PeerJ. 3, 90(2015).
  19. Adegbola, R. A., et al. Serotype and antimicrobial susceptibility patterns of isolates of Streptococcus pneumoniae causing invasive disease in The Gambia 1996-2003. Tropical Medicine and International Health. 11 (7), 1128-1135 (2006).
  20. Marks, L. R., Reddinger, R. M., Hakansson, A. P. High Levels of Genetic Recombination during Nasopharyngeal Carriage and Biofilm Formation in Streptococcus pneumoniae. mBio. 3 (5), (2012).
  21. Ritchie, N. D., Mitchell, T. J., Evans, T. J. What is different about serotype 1 pneumococci. Future Microbiology. 7 (1), 33-46 (2012).
  22. Harvey, R. M., et al. The variable region of pneumococcal pathogenicity island 1 is responsible for unusually high virulence of a serotype 1 isolate. Infection and Immunity. 84 (3), 822-832 (2016).
  23. Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. BioTechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
  24. Alioing, G., Granadel, C., Morrison, D. A., Claverys, J. P. Competence pheromone, oligopeptide permease, and induction of competence in Streptococcus pneumoniae. Molecular Microbiology. 21 (3), 471-478 (1996).
  25. Lund, E. Enumeration and description of the strains belonging to the State Serum Institute, Copenhagen Denmark. , (1951).
  26. Barany, F., Tomasz, A. Genetic transformation of Streptococcus pneumoniae by heterologous plasmid deoxyribonucleic acid. Journal of Bacteriology. 144 (2), 698-709 (1980).
  27. Terra, V. S., Homer, K. A., Rao, S. G., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Characterization of novel β-galactosidase activity that contributes to glycoprotein degradation and virulence in Streptococcus pneumoniae. Infection and Immunity. 78 (1), (2010).
  28. Terra, V. S., Zhi, X., Kahya, H. F., Andrew, P. W., Yesilkaya, H. Pneumococcal 6-phospho-β-glucosidase (BglA3) is involved in virulence and nutrient metabolism. Infection and Immunity. 84 (1), (2015).
  29. Harvey, R. M., Ogunniyi, A. D., Chen, A. Y., Paton, J. C. Pneumolysin with Low Hemolytic Activity Confers an Early Growth Advantage to Streptococcus pneumoniae in the Blood. Infection and Immunity. 79 (10), 4122(2011).
  30. Terra, V. S., Plumptre, C. D., Wall, E. C., Brown, J. S., Wren, B. W. Construction of a pneumolysin deficient mutant in Streptococcus pneumoniae serotype 1 strain 519/43 and phenotypic characterisation. Microbial Pathogenesis. 141, 103999(2020).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Streptococcus pneumoniaeSerotype 1Genetic ModificationPlasmid ConstructionNatural TransformationSuicide PlasmidPneumolysin MutationHemolytic Activity AssayBlue White SelectionRestriction Digestion

Related Articles