Yöntem makalesi

Yüksek Çözünürlüklü Sağlam Tüm Retina ve Vitreus Görüntüleme için Mikrocerrahi Diseksiyon ve Doku Temizleme

DOI:

10.3791/61595

⸱

11 Mart 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Ophthalmology and Visual Neuroscience, University of Minnesota, 2Department of Neuroscience, Cell Biology, and Anatomy, University of Texas Medical Branch, 3Biomedical Engineering and Imaging Sciences Group, University of Texas Medical Branch, 4Department of Ophthalmology, University of Texas Medical Branch

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, göz küresinin dış opak/pigmentli katmanlarının cerrahi olarak çıkarıldığı ve retinayı saydam hale getirmek için optik temizlemenin uygulandığı, periferik retina ve hyaloid vaskülatür işlemlerinin ışık tabakası floresan mikroskobu kullanılarak sağlam retinada görüntülenmesini sağlayan sağlam tüm retina görüntüleme protokolü sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizyolojik ve patolojik durumlarda retinanın nöronal ve vasküler yapıları, konvansiyonel retinal flat mount preparatları ve kesitlerine kıyasla sağlam tüm retina görüntüleme teknikleri kullanılarak daha iyi görüntülenebilmekte ve karakterize edilebilmektedir. Bununla birlikte, sağlam tüm retinanın immünofloresan görüntülemesi, göz küresinin opak kaplamaları, yani sklera, koroid ve retina pigment epitelinin (RPE) ve retina tabakalarının tam kat yüksek çözünürlüklü optik görüntülemeyi engelleyen ışık saçılma özellikleri tarafından engellenir. Pigmentli tabakaların kimyasal ağartılması ve doku temizleme protokolleri bu engelleri ele almak için tarif edilmiştir; bununla birlikte, şu anda tarif edilen yöntemler, sağlam tüm retinada yeşil floresan proteini (GFP) gibi endojen floresan moleküllerin görüntülenmesi için uygun değildir. Diğer yaklaşımlar, pigmentli tabakaların ve göz küresinin ön segmentinin cerrahi olarak çıkarılmasıyla bu sınırlamayı atlayarak sağlam göz görüntülemesine izin verdi, ancak periferik retina ve hyaloid yapılar bozuldu. Burada, sklera/koroid/retina pigment epitel (RPE) tabakalarının cerrahi diseksiyonu ile modifiye doku temizleme yöntemi ve ışık tabakası floresan mikroskobu (LSFM) kombine edilen sağlam bir tam retina ve vitreus immünofloresan görüntüleme protokolü sunulmuştur. Yeni yaklaşım, patolojik durumlarda retinanın bozulmamış vasküler ve nöronal elemanlarının yanı sıra vitreus ve hyaloid vasküler sistemin eşi görülmemiş bir görünümünü sunmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sağlıklı ve hastalık durumlarında retinal, nöronal ve vasküler elemanlar arasındaki etkileşim, geleneksel olarak parafin veya kriyo-fikse retina dokusunun fiziksel bölümleri veya retina düz preparatları üzerinde immünofloresan çalışmalarla araştırılmaktadır1. Bununla birlikte, doku kesiti retina nöronal ve vasküler sürekliliğini bozar ve komşu retina bölümlerinin üç boyutlu rekonstrüksiyonu olası bir çözüm olarak önerilse de, yine de hatalara ve artefaktlara tabidir. Retina düz montaj preparatları ayrıca retinal, vasküler ve nöronal elemanların bütünlüğünü ve bitişik retina alanları arasındaki coğrafi bağlantıyı belirgin şekilde bozar2. Alternatif olarak, retinal, nöronal ve vasküler bileşenlerin üç boyutlu projeksiyonlarını doğal anatomik pozisyonlarındagörselleştirmek için yakın zamanda sağlam tüm retina görüntülemesi tanıtılmıştır 2,3,4,5.

Sağlam tüm retina görüntülemede, sağlam bir tüm retinanın bitişik retina alanlarının (döşemeleri) vasküler ve nöronal elemanlarından gelen floresan sinyaller, bir ışık tabakası mikroskobu kullanılarak yakalanır; Bu karolar daha sonra tüm retina 2,3,4,5,6'nın üç boyutlu bir görüntüsünü yeniden oluşturmak için bir araya getirilir. Bozulmamış tüm retina görüntüleme, retinal vasküler, dejeneratif ve inflamatuar hastalıkların patogenezini incelemek için retinanın benzeri görülmemiş bir görünümünü sağlar 2,3,4,5,6. Örneğin, Prahst ve ark. sağlam bir tüm retinanın canlı görüntülemesini kullanarak oksijen kaynaklı retinopati (OIR) modelinde patolojik vasküler tutamlara, anormal hücre motilitesine ve değişmiş filopodia dinamiklerine daha önce "takdir edilmemiş" bir düğümlü morfoloji ortaya çıkardı2. Benzer şekilde, Henning ve ark., Singh ve ark. ve Chang ve ark. sağlam tüm retinalarda karmaşık üç boyutlu retinal vasküler ağı göstermiştir 3,4,6. Vigouroux ve ark. perinatal dönemderetinanın organizasyonunu ve görsel projeksiyonları göstermek için sağlam bir tüm göz görüntüleme yöntemi kullanmışlardır 5. Retinanın bu tür benzersiz üç boyutlu görüntülerini oluşturabilmek için, sağlam tüm retina görüntüleme protokolleri iki ana sınırlamanın üstesinden gelmiştir: 1) göz küresinin opak ve pigmentli kaplamalarının varlığı (sklera, koroid ve RPE) ve 2) retinal nükleer ve pleksiform tabakaların ışık saçılma özelliklerinin neden olduğu ışığın tam retina kalınlığından sınırlı penetrasyonu. Henning ve ark. ve Vigouroux ve ark. sağlam bir retinayı görüntüleyebilmek için koroid/RPE pigmentlerinin H2O2 ağartmasını uyguladılar 3,5. Bununla birlikte, ağartma, yeşil floresan proteini (GFP) gibi endojen floroforlara sahip hayvan suşları için veya in vivo immünofloresan boyamalardansonra uygun değildir 3,5,7. Ek olarak, Henning ve ark.'nın H2O2 muamelesi yöntemi, retina dekolmanı ile sonuçlanan mikro kabarcıklar oluşturabilen sulu koşullarda gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, H2O2 tedavisi 55 ° C'de gerçekleştirildi, bu da doku antikor afinitesini daha da bozan bir durum. Ayrıca, ağartma, oksitlenmiş melanin8'den kaynaklanan ağır otofloresan uygulayabilir. Potasyum permanganat ve oksalik asit kullanan göz kesitleri için diğer depigmentasyon protokolleri, embriyonik kesitlerde RPE pigmentlerini çıkarabilmiştir, ancak bu depigmentasyon yönteminin aynı zamanda immünoetiketlemenin etkinliğini azalttığı gösterilmiştir 9,10. Beyazlatmaya alternatif olarak, Prahst ve ark., Singh ve ark. ve Chang ve ark. mikroskop ışığına ulaşılabilir hale getirmek için sklera ve koroid ve korneayı çıkardılar 2,4,6. Bununla birlikte, kornea, lens ve periferik retinanın çıkarılması, periferik retina ve hyaloid damarları bozabilir ve bozabilir, bu da bu yöntemleri periferik retina ve hyaloid vaskülatürü incelemek için uygun hale getirmeyebilir.

Şu anda mevcut olan tüm sağlam tüm göz görüntüleme protokolleri, retinakatmanları 2,3,4,5'in ışık saçılma özelliklerinin üstesinden gelmek için bir doku optik temizleme adımının kullanımını içerir. Doku optik temizleme, ışık saçılımını ve emilimini en aza indirmek için belirli bir dokunun, burada retinanın tüm hücresel ve hücreler arası elementleri boyunca kırılma indisini eşitleyerek retinayı mikroskop ışığına karşı şeffaf hale getirir11. Göz küresinin pigmentli kaplamaları (koroid ve RPE) yeterince temizlenemediği için retinaya doku optik temizleme uygulanmadan önce koroid ve RPE çıkarılmalı veya ağartılmalıdır6,12,13,14,15,16,17,18.

Prematüre retinopatisi (ROP), persistan fetal vasküler sistem (PFV), Norrie Hastalığı ve Stickler Hastalığı gibi patolojik durumlarda vitreus ve hyaloid vasküler sistemin katılımı ve katkıları en iyi retina ve hyaloid damarların doku hazırlığında bozulmadığı durumlarda çalışılır 19,20,21,22,23. Sağlam tüm retina görüntüleme için mevcut yöntemler ya vitreusu ve damar sistemini doğal olarak bozan gözün ön segmentini çıkarır ya da endojen floroforları uzaklaştırabilen ağartma ajanları uygular. Vitreus gövdesini ve damar sistemini sağlam, el değmemiş durumlarında görselleştirmek için yayınlanmış yöntemler eksiktir. Burada, göz küresinin pigmentli ve opak kaplamalarının cerrahi diseksiyonu, retina için optimize edilmiş modifiye doku optik temizliği ve ışık tabakası floresan mikroskobundan oluşan tüm retina ve vitreus görüntüleme yöntemini tarif ediyoruz. Numune hazırlama, doku optik temizleme, ışık tabakası mikroskobu ve görüntü işleme adımları aşağıda detaylandırılmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler Teksas Üniversitesi Tıp Şubesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Hayvan kullanımı ve bakımı, Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) oftalmik ve görme araştırmalarında hayvanların kullanımına ilişkin beyanına uygun olarak yapılmıştır. Bu prosedürü gerçekleştirmek için gerekli tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Her adımı gerçekleştirirken pudrasız eldiven giyin. 6. ve 7. adımlar için ayrıca resmi mikroskop kullanım kılavuzuna bakın.

1. Hayvanların hazırlanması

  1. Deney farelerini geçerli Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi onaylı protokole uygun olarak ötenazi yapın (burada Ketamin 60 mg / kg ve Deksmedetomidin 0.5 mg / kg kombinasyonu ile anestezi ve ardından servikal çıkık kullanıldı). Hemen hayvanı diseksiyon ve kalp perfüzyonu için bir platformda stabilize etmeye devam edin.
    NOT: Deney hayvanları, bireysel çalışma tasarımına göre seçilir.
  2. Kalbi ortaya çıkarmak için karın ve toraksı diseksiyon edin. Sol ventriküle yerleştirilen 27 G'lik bir iğne ile kalbi transfüze ederek kardiyak perfüzyon yapın ve kanın çıkışına izin vermek için sağ atriyumda küçük (~ 1 mm) bir kesi oluşturun24.
    1. İlk olarak, 30-50 mL buz gibi soğuk fosfat dengeli salin solüsyonu (PBS) ve ardından 30-50 mL taze hazırlanmış% 4 paraformaldehit (PFA) transfüzyonu.
    2. Başarılı bir PFA transfüzyonu olup olmadığını kontrol etmek için vücutta ve kuyrukta görünür kas seğirmeleri olup olmadığını kontrol edin. Enükleasyon adımına geçin.

2. Göz küresi enükleasyonu ve fiksasyonu

  1. Göz küresini yuvasından çıkmaya zorlamak için üst veya alt göz kapağını hafifçe itmek için kavisli bir kuyumcu forseps kullanın. Konjonktivayı yandan delmek ve küreyi optik sinir tarafından tutmak için başka bir kuyumcu veya benzeri forseps seti kullanın. Optik sinirden ayrılana kadar küreyi yavaşça yuvasından kaldırın.
  2. Küreyi taze hazırlanmış buz gibi %4 PFA içeren bir tüpe aktarın. Tüpü buna göre etiketleyin. Dünyanın 4 °C'lik bir buzdolabında 4 saat (gece boyunca) %12 PFA'da kalmasına izin verin.
    NOT: Küreyi aktarmak için kesik uçlu plastik bir transfer pipeti kullanın. Keskin kenarlı numuneye zarar vermemek için kesilen ucun açıklığını ikinci bir pipet ucuyla genişletin.

3. Numunenin diseksiyonu (Şekil 1 ve Şekil 2)

  1. Stereomikroskop altında, kornea-sklera bileşkesini bulun (Şekil 1A) ve kornea-sklera bileşkesinin yaklaşık 0,5-1 mm gerisinde sklerada çok yüzeysel bir kesim yapmak için 30 G'lık bir iğnenin keskin kesici ucunu kullanın (Şekil 1B).
  2. Keskin uçlu bir diseksiyon makasının bıçaklarından birini, sklera / koroid / RPE ile retina arasındaki potansiyel boşluğa yeni yapılan kesiden ilerletin (Şekil 1C). Makası ilerletin ve sklera/koroid/RPE retinanın dış yüzeyinden soyulabilene kadar çevresel olarak kesin (Şekil 1D,E).
    NOT: Retinanın delinmesini önlemek için bu adımı yavaş ve nazikçe gerçekleştirmek önemlidir. İlk birkaç kesi, retinayı kesmekten kaçınmak için özellikle kritiktir.
  3. Gerekirse, çevresel kesme işlemini ve ardından optik sinirin ve sklera/koroid/RPE'nin soyulmasını kolaylaştırmak için sklera/koroid/RPE üzerinde radyal rahatlatıcı kesimler yapın. PBS'ye batırılmış 1 numara bir boyama fırçası kullanarak küçük RPE lekelerini (Şekil 1F) çıkarın.
  4. Sağlam göz küresinin tamamını PBS içeren bir tüpe aktarın. Hemen bir sonraki adıma geçin veya immün etiketleme için 4 °C'de muhafaza edin.
    NOT: Enükleasyondan sonra göz küresine işaretler yerleştirilebilir ve ardından gerekirse gözün yönünü korumak için diseksiyondan sonra göz küresine yerleştirilebilir. Protokol burada duraklatılabilir ve numuneler sonraki adımlara geçmeden önce 4 °C'lik bir buzdolabında gece boyunca saklanabilir.

4. Vasküler boyama

  1. Dokuyu oda sıcaklığında 20 dakika boyunca %0.2 Tween-20 içeren PBS'ye daldırarak geçirgen hale getirin.
  2. Numuneyi PBS ile 10 dakika boyunca bir çalkalayıcı üzerinde 3 kez yıkayın.
  3. Numuneyi% 0.25 Triton X-100 içeren PBS'de% 5 normal keçi serumu (NGS) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
  4. Birincil antikor ile gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Burada, bir anti-fare Kollajen IV antikoru kullanıldı (nihai konsantrasyon% 0.2 Tween-20 içeren PBS'de hazırlandı).
  5. PBS ile 3 kez, yıkama başına 5 dakika yıkayın.
  6. Numuneyi floresan etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin. Burada, bir anti-tavşan Alexa Fluor 568, 4 ° C'de 12 saat boyunca kullanıldı (% 0.2 Tween-20 içeren PBS'de 1:200 seyreltme).
  7. PBS ile her biri 1 saat boyunca 3 kez yıkayın ve ardından doku temizleme adımlarına devam edin.

5. 2,2" -tiyodietanol (TDE) ile optik temizleme

  1. %10, %20, %30, %40, %50 ve %60 hacim-hacim (h/v) nihai konsantrasyon için PBS'li stok TDE solüsyonu kullanarak çalışma TDE konsantrasyonlarını hazırlayın. Dokuya nüfuz etmek için yeterli fazla hacim sağlamak için her göz örneği için en az 2 mL solüsyon hazırlayın.
  2. Numuneleri, artan TDE konsantrasyonunda 6 veya 12 oyuklu bir plaka kuyusunda inkübe edin. Sağlam bütün gözbebeklerini oda sıcaklığında bir çalkalayıcı üzerinde 2-4 saat boyunca %10 TDE solüsyonuna batırarak başlayın. Art arda numuneyi her TDE konsantrasyonunda 2-4 saat boyunca daha yüksek bir TDE konsantrasyonuna aktarın (Şekil 2C).
    NOT: Retina %40-50 konsantrasyonlarda temizlenmeye başlar, ancak maksimum temizleme% 60'lık bir çözelti içinde inkübasyondan sonra gerçekleşir. Retina %70 ve daha yüksek konsantrasyonlarda daha az saydam hale gelir (Şekil 2D).
  3. Gerekirse, birbirini izleyen takas borsası adımlarından herhangi birinde takas sürecini gece boyunca durdurun.

6. Işık tabakası mikroskobu kullanarak tüm göz görüntüleme

  1. Kullanılan ışık tabakası mikroskop platformunun konfigürasyonunu göz önünde bulundurarak sağlam tüm göz örneklerini monte edin. Işık tabakası hizalaması ve optik yolların aydınlatılması ve algılanması dahil olmak üzere toplama parametrelerini ayarlamak için mikroskop ve edinme yazılımı talimatlarını izleyin.
    NOT: Bu deneyde kullanılan örnekler, kornea tarafından hipodermik bir iğnenin ucuna bir insülin şırıngası üzerine yapıştırılmıştır (Şekil 2E). Numune daha sonra mikroskop odasının içinde askıya alındı.
  2. Mikroskop odasını temizleme çözeltisi olarak% 60 TDE ile doldurun.
  3. Numuneyi ışık tabakası mikroskop odasına %60 TDE çözeltisine (son temizleme konsantrasyonu) daldırın.
  4. Temizlenmiş gözü çeşitli ticari veya özel yapım konfokal ve ışık tabakası mikroskopları aracılığıyla görüntüleyin. Bu protokolde, çift taraflı aydınlatmalı ışık tabakası mikroskobu kullanılmaktadır.
  5. Özellikle döşeme ile birleştirildiğinde hücresel morfolojiyi ve hücresel süreç izlemeyi görüntülemek için düşük çözünürlüklü ve düşük büyütmeli görüntüleme (5x, NA 0.16) kullanın. Hem hücresel morfolojiyi hem de çekirdekler ve mitokondriyal kümeler gibi büyük hücre altı organelleri görüntülemek için yüksek çözünürlüklü ve büyütmeli görüntüleme (20x, NA 1.0) kullanın.

7. Edinme sonrası görüntü işleme

NOT: Edinme sonrası işlem, dosyanın türüne ve görüntülenen dosyalarla uyumlu yazılıma bağlıdır.

  1. Görüntülenen döşemeleri birleştirmeden önce ham görüntüleri daha da artırmak için bulanıklaştırma veya evrişim giderme uygulayın. Görüntülerin bulanıklığını gidermek için bir Weiner filtresi uygulanabilir. Alternatif olarak, Richardson-Lucy evrişim giderme ve ImageJ PSF jeneratör eklentisi25 gibi modelleme araçları kullanılarak teorik veya deneysel olarak ölçülen bir PSF ile gürültü giderme işleminden sonra görüntüler yinelemeli olarak dekonvolüsyon yapılabilir.
  2. Çeşitli ticari veya kamu malı yazılım paketlerini (ImageJ – BigStitcher eklentisi) kullanarak önceden işlenmiş z-yığınlarının birleştirilmesini ve afin ve rijit olmayan hacim dönüşümlerini ve ardından çoklu görünüm hacim kaydını ve füzyonunu gerçekleştirin26.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Peripapiller vasküler ağ ve mikroglia'nın sıfır açılı izdüşümü Şekil 3A'da gösterilmiştir. Ayrıca, bir CX3CR1-GFP faresindeki bozulmamış tüm retina mikroglia dağılımı Şekil 3B'de sunulmuştur. Burada sunulan yöntemin önemli bir avantajı, doğuştan gelen floroforları görüntüleme yeteneğidir. Şekil 3C,D, mevcut bozulmamış tüm göz görüntüleme yöntemi (Şekil 3C) ve düz montaj hazır...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Retina ve vitreus gelişimi ve patolojileri en iyi, retinanın kesitler veya düz montaj hazırlıkları için kesilmediği sağlam tüm retina görüntüleme teknikleriyle incelenir. Mevcut sağlam tüm göz görüntüleme yöntemleri ya doğuştan gelen floroforları ortadan kaldıran pigment ağartmayı içerir ya da periferik retina ve vitreus gövdesini bozabilecek gözün ön segmenti ile birlikte göz küresinin opak kaplamalarının (RPE, koroid ve sklera) fiziksel olarak çıkarılmasını içerir. Chang ve ark. ve Pra...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlgili ticari çıkar çatışması yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Texas Üniversitesi Tıp Şubesi'nde yapılmıştır. Yazarlar Harald'ı takdir ediyor
Junge, PhD, Debora Ferrington, PhD ve Heidi Roehrich, Minnesota Üniversitesi, Şekil 1 ve film 2'nin hazırlanmasındaki yardımları için. LO, NIEHS T32 Eğitim Hibe T32ES007254 tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Deney hayvanı< / güçlü >
CX3CR1-GFP FareJackson Laboratuvarı5582
< güçlü > anestezik< / güçlü >
DeksmedetomidinPar İlaç42023-146-25
KetaminFresenius Kabi
<> Doku toplama, fiksasyon ve numune diseksiyonu< / güçlü>
kardiyak perfüzyon pompasıFisher bilimselNC9069235
Siyanoakrilat süper yapıştırıcıamazon.com
İnce makas keskinliğindeGüzel Bilim Araçları14160-10
İnce cımbızGüzel Bilim Araçları11412-11
Paraformaldehit (PFA)Elektron mikroskobu bilimleri15710-S
Fosfat tamponlu salin (PBS)Gibco10010049
boyutu 1 boyama fırçasıdickblick.com
düz yaylı makasGüzel Bilim Araçları15000-03
şırınga, iğne ucu, 27 gauge x 1.25 "BD
Tüpler 1.5 ml, 15 ml, 50 mlThermo sceintific
Tween-20ThermoFisher85114
İmmünofloresan boyama
Fare karşıtı kollajen IV antikoruAbcamab198081:200 seyreltme
Anti-tavşan Alexa Fluor 568InvitreogenA-110111:200 seyreltme
Normal keçi serumThermoFisher50062Z% 10 konsantrasyon
Doku temizleme< / güçlü >
2,2 & prime; -tiyodietanol (TDE)Fluka analyticaSTBD7772V
Sallanan çalkalayıcıFisher scientific02-217-765
< güçlü > Mikroskopi< / güçlü>
Floresan mikrokürelerTetraSpeckT14792
Işık tabakası floresan mikroskobu (LSFM)ZeissZ1
Microglia sayımı
ImageJUlusal Sağlık
Enstitüsü

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Usui, Y., et al. Neurovascular crosstalk between interneurons and capillaries is required for vision. Journal of Clinical Investigation. 125, 2335-2346 (2015).
  2. Prahst, C., et al. Mouse retinal cell behaviour in space and time using light sheet fluorescence microscopy. eLife. 9, 49779(2020).
  3. Henning, Y., Osadnik, C., Malkemper, E. P. EyeCi: Optical clearing and imaging of immunolabeled mouse eyes using light-sheet fluorescence microscopy. Experimental Eye Research. 180, 137-145 (2019).
  4. Chang, C. C., et al. Selective Plane Illumination Microscopy and Computing Reveal Differential Obliteration of Retinal Vascular Plexuses. bioRxiv. , (2020).
  5. Vigouroux, R. J., César, Q., Chédotal, A., Nguyen-Ba-Charvet, K. T. Revisiting the role of DCC in visual system development with a novel eye clearing method. eLife. 9, 51275(2020).
  6. Singh, J. N., Nowlin, T. M., Seedorf, G. J., Abman, S. H., Shepherd, D. P. Quantifying three-dimensional rodent retina vascular development using optical tissue clearing and light-sheet microscopy. Journal of Biomedical Optics. 22, 076011(2017).
  7. Kim, S. Y., Assawachananont, J. A new method to visualize the intact subretina from retinal pigment epithelium to retinal tissue in whole mount of pigmented mouse eyes. Translational Vision Science and Technology. 5, 1-8 (2016).
  8. Kayatz, P., et al. Oxidation causes melanin fluorescence. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 42, 241-246 (2001).
  9. Iwai-Takekoshi, L., et al. Retinal pigment epithelial integrity is compromised in the developing albino mouse retina. Journal of Comparative Neurology. 524, 3696-3716 (2016).
  10. Alexander, R. A., Cree, I. A., Foss, A. J. The immunoalkaline phosphatase technique in immunohistochemistry: the effect of permanganate-oxalate melanin bleaching upon four final reaction products. British Journal of Biomedical Science. 53, 170-171 (1996).
  11. Ueda, H. R., et al. Whole-Brain Profiling of Cells and Circuits in Mammals by Tissue Clearing and Light-Sheet Microscopy. Neuron. 106, 369-387 (2020).
  12. Hillman, E. M. C., Voleti, V., Li, W., Yu, H. Light-Sheet Microscopy in Neuroscience. Annual Review of Neuroscience. 42, 295-313 (2019).
  13. Jing, D., et al. Tissue clearing of both hard and soft tissue organs with the pegasos method. Cell Research. 28, 803-818 (2018).
  14. Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159, 911-924 (2014).
  15. Hohberger, B., Baumgart, C., Bergua, A. Optical clearing of the eye using the See Deep Brain technique. Eye. 31, London, England. 1496-1502 (2017).
  16. Kuwajima, T., et al. ClearT: A detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development (Cambridge). 140, 1364-1368 (2013).
  17. Lee, H., Park, J. H., Seo, I., Park, S. H., Kim, S. Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine. BMC Developmental Biology. 14, 48(2014).
  18. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nature Methods. 13, 859-867 (2016).
  19. Hegde, S., Srivastava, O. Different gene knockout/transgenic mouse models manifesting persistent fetal vasculature: Are integrins to blame for this pathological condition. Life Sciences. 171 (15), 30-38 (2016).
  20. Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and Management of Retinopathy of Prematurity. New England Journal of Medicine. 367, 2515-2526 (2012).
  21. Pierce, E. A., Foley, E. D., Smith, L. E. H. Regulation of vascular endothelial growth factor by oxygen in a model of retinopathy of prematurity. Archives of Ophthalmology. 114, 1219-1228 (1996).
  22. Ash, J., McLeod, D. S., Lutty, G. A. Transgenic expression of leukemia inhibitory factor (LIF) blocks normal vascular development but not pathological neovascularization in the eye. Molecular Vision. 11, 298-308 (2005).
  23. Reichel, M. B., et al. High frequency of persistent hyperplastic primary vitreous and cataracts in p53-deficient mice. Cell Death and Differentiation. 5, 156-162 (1998).
  24. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 3564(2012).
  25. Kirshner, H., Aguet, F., Sage, D., Unser, M. 3-D PSF fitting for fluorescence microscopy: Implementation and localization application. Journal of Microscopy. 249, 13-25 (2013).
  26. Hörl, D., et al. BigStitcher: reconstructing high-resolution image datasets of cleared and expanded samples. Nature Methods. 16, 870-874 (2019).
  27. Susaki, E. A., Ueda, H. R. Whole-body and Whole-Organ Clearing and Imaging Techniques with Single-Cell Resolution: Toward Organism-Level Systems Biology in Mammals. Cell Chemical Biology. 23, 137-157 (2016).
  28. Tian, B., et al. Efficacy of novel highly specific bromodomain-containing protein 4 inhibitors in innate inflammation–driven airway remodeling. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 60, 68-83 (2019).
  29. Zaman, R. T., et al. Changes in morphology and optical properties of sclera and choroidal layers due to hyperosmotic agent. Journal of Biomedical Optics. 16, 077008(2011).
  30. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10, 508-513 (2013).
  31. Renier, N., et al. IDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging. Cell. 159, 896-910 (2014).
  32. Costantini, I., et al. A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging. Scientific Reports. 5, 9808(2015).
  33. Aoyagi, Y., Kawakami, R., Osanai, H., Hibi, T., Nemoto, T. A rapid optical clearing protocol using 2,2'-thiodiethanol for microscopic observation of fixed mouse brain. PLoS One. 10, 0116280(2015).
  34. Icha, J., et al. Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development. Journal of Visualized Experiments. (110), e53966(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Intact Whole RetinaTissue ClearingLight Sheet MicroscopySclera Choroid RPE DissectionVitreous ImagingRetinal Vascular ImagingNeuronal Structure ImagingEndogenous Fluorescent ImagingGFP Retina ImagingHigh Resolution Retina
Video yakında

İlgili makaleler