Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Bu protokol, X ışınları ile yüksek çözünürlükte görüntüleme için in vitro sığır eklem kıkırdağının hazırlanmasını açıklar. Bu eksplantlar aktif olarak doğum sonrası olgunlaşmaya uğrar. Burada biyopsiden 3D X-ışını faz kontrast görüntülemenin veri analizine, eksplant kültüründen geçerek, doku fiksasyonu ve senkrotron hazırlığına kadar gerekli adımları anlatıyoruz.
Eklem kıkırdağının doğum sonrası olgunlaşmasını destekleyen mekanizmaları anlamak, yeni nesil doku mühendisliği stratejilerini tasarlamak ve hastalıklı veya hasarlı kıkırdağı potansiyel olarak onarmak için çok önemlidir. Genel olarak, organizmanın büyümesine uyum sağlamak için dokunun kollajen yapısında ve işlevinde toptan bir değişiklik olan eklem kıkırdağının doğum sonrası olgunlaşması, aylar ila yıllar arasında değişen bir zaman ölçeğinde gerçekleşir. Tersine, uzun zaman ölçeklerinde de meydana gelen kıkırdağın yapısal organizasyonunun çözülmesi, doku dejenerasyonunun ayırt edici özelliğidir. Bu biyolojik süreçleri ayrıntılı olarak inceleme yeteneğimiz, büyüme faktörlerinin olgunlaşmamış eklem kıkırdağının erken in vitro olgunlaşmasını indükleyebileceği bulgularıyla geliştirilmiştir. Eklemde meydana gelen gelişimsel ve hastalıkla ilgili değişiklikler kemik ve kıkırdağı içerir ve bu dokuları birlikte görüntüleme yeteneği, iç içe geçmiş rolleri hakkındaki anlayışımızı önemli ölçüde artıracaktır.
Yumuşak doku, kıkırdak ve kemik değişikliklerinin eş zamanlı görüntülenmesi, günümüzde eklem hastalıklarının takibi için kullanılan geleneksel preklinik görüntüleme yöntemleri için üstesinden gelinmesi gereken bir zorluktur. Üç boyutlu X-ışını Faz-Kontrast Görüntüleme yöntemleri (PCI), düşük yoğunluklu nesnelerin görüntülenmesi için yüksek performans ve geleneksel X-ışını görüntülemeye kıyasla ek bilgi sağlama yetenekleri nedeniyle 20 yıldır sürekli olarak geliştirilmektedir.
Bu protokolde, kıkırdak biyopsisi, in vitro olgunlaşmış kıkırdak üretimi, X-ışını faz kontrast görüntüleme kullanılarak toplanan görüntünün veri analizine kadar deneylerimizde kullanılan prosedürü detaylandırıyoruz.
İmmatür eklem kıkırdağı, erişkin ekleme özgü bir fonksiyon elde etmek için morfolojik, yapısal ve biyomoleküler değişiklikleri1 başlatmak için yeterli bir destektir. Temel değişiklik, kollajen fibrillerinin olgunlaşmamış kıkırdakta yüzeye göre paralel bir yönelim gösteren bir kıkırdaktan, dokuda daha derin fibrillerin olgun kıkırdakta dik olduğu bir yere yeniden düzenlenmesidir. Yetişkin kıkırdağının yalancı tabakalaşması, yerleşik kondrositlerin kollajen fibril oryantasyon yönü boyunca yeniden düzenlenmesi, yüzeydeki hücrelerin disk benzeri ve yüzeye paralel olması ve daha derin bölgelerdeki hücrelerin giderek....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Burada açıklanan tüm yöntemler Swansea Üniversitesi Etik Araştırma Komitesi tarafından onaylanmıştır ve biyopsi materyalleri Birleşik Krallık Çevre, Gıda ve Köy İşleri Bakanlığı'ndan (DEFRA) lisans altında alınmıştır. Bu protokol, kurumlarımızın hayvan bakım yönergelerini takip eder.
1. Eksplant Kültürleri
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Şekil 3'te çizildiği gibi basit bir yayılım tabanlı görüntüleme düzeneği25 kullanıldı. Senkrotron yayılım tabanlı görüntülemede, tutarlı bir X-ışını demeti nesneyi aydınlatır ve uzamsal olarak değişen faz kaymalarınayol açar 19. X-ışını ışını numuneden sonra yayılırken, bozulmuş dalga cephesi karakteristik model oluşturur. Bu karakteristik kalıpları özel algoritmalar23 ile analiz ederek, numunenin neden olduğu faz kaymal.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
İn vitro hızlı olgunlaşan eklem kıkırdağı çalışması için numune hazırlamadan veri toplama protokolleri de dahil olmak üzere görüntü görselleştirmeye kadar eksiksiz bir çalışma sunduk. Bir senkrotron görüntüleme seansının sonuçları, modelin iyiliğini gösterdi.
Burada sunulan modelde bazı gözlem ve sınırlardan bahsetmek gerekir. Bu "hızlandırılmış olgunlaşma", kültürden sonraki 21 gün içinde gerçekleşir. Daha uzun kültür dönemleri için, eksplant tıkaçla.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Hiç kimse.
Yazarlar, kurum içi ışın süresi sağladığı için ESRF'ye teşekkür eder. Yazarlar bilimsel tartışmalar için Eric Ziegler'e teşekkür eder. Açıklanan PCI deneyi, Fransa'nın Grenoble kentindeki Avrupa Sinkrotron Radyasyon Tesisi'nin (ESRF) BM05 ışın hattında gerçekleştirildi. CB, bu çalışmanın bir bölümünü finanse ettiği için Explora'doc Auvergne Rhone Alpes'e ve Swansea Üniversitesi ve Université Grenoble Alpes'ten burslara teşekkür eder.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| < güçlü > Malzeme: Biyolojik ürünler< / güçlü > | |||
| DMEM / F-12 (1: 1) (1X) + GlutaMAX Dulbecco'nun Modifiye Eagle Orta F-12 Besin Karışımı (Jambon) 500mL | Gibco by life technologies | 31331-028 | |
| Gentamisin Reaktif Çözeltisi, 50 mg / mL | Gibco yaşam teknolojileri tarafından | 15750-060 | |
| HEPES, özel hazırlık, 1M, pH 7.5 filtrelenmiş | Sigma | H-3375 | |
| ITS, Yaşam teknolojileri tarafından İnsülin-Transferrin-Selenyum | Gibco | 51500-057 | |
| L-Askorbik Asit-2-Fosfat, seskimagnezyum salf hidrat, %95 | Sigma | A8960-5G | |
| Nötr Tampon Formalin (NBF) | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) pH 7.4 | Gibco yaşam teknolojileri tarafından | 10010023 | |
| < güçlü > Kültür ekipmanları: < / güçlü > | |||
| emici koruyucu, Benchkote | WhatmanTM | Cat No. 2300731, | Polyester Destekli, 460cm * 50m |
| Accurpette VWR | |||
| Otoklavlanabilir Bertaraf Torbası | Kirlenmiş plastik laboratuvar gereçlerinin atılması için buharın nüfuz etmesine izin vermek için boynu açık bırakılmalıdır, Tehlikeli Atık, STERILIN (beyaz torba) | ||
| biyopsi zımbaları | MILTEX by KAI | ref 33-36 | 4 & 6 mm çap |
| Alternatif tedavi için klinik atık Orta Hizmet | (BM onaylı ağırlık 5kg, Kapatma yöntemleri, UN-SH4 / Y5 / S / II / GB / 4/06 (turuncu çanta) | ||
| Eppendorf tüpleri | 0.5 mL ve 1.5 mL | ||
| Falcon tüpleri | 15 mL ve 50 mL | ||
| saptanabilir RNase, DNase, DNA ve Pirojenler 1000ul Eğimli Dereceli, filtre ucu | Starlab, TipOne (steril) | S1122-1830 | |
| tespit edilebilir RNase, DNase, DNA ve Pirojenler 20 ve mikro; l Eğimli Dereceli, filtre ucu | Starlab, TipOne (steril) | S1120-1810 | |
| tespit edilebilir RNase, DNase, DNA ve Pirojenler 200ul Eğimli Dereceli, filtre ucu | Starlab, TipOne (steril) | S1110-1810 | |
| Kuluçka | ; C,% 5 CO2 ile nemlendirilmiş atmosfer | ||
| Optik mikroskop | |||
| Pipet-boy | 25 mL-, 10 mL- ve 5 mL steril plastik pipetler | ||
| Pipetler (25-10-5 ml) | CellStar, Greiner Bio-one | ||
| Plastik cımbız | Oxford Instrument | AGT 5230 | |
| Neşter Uçları | |||
| P1000, P200 ve P10, P1000, P200 ve P10 uçlu (steril) | |||
| Doku kültürü başlığı | |||
| Vakum pompası | |||
| Su banyosu 37 derece; C | |||
| kuyulu plakalar | 12 ve 24 kuyulu plakalar | ||
| < güçlü > Koruma ekipmanı: < / güçlü > | |||
| yüz siperi | |||
| eldivenleri | |||
| laboratuvar önlüğü | |||
| güvenlik gözlükleri | |||
| < güçlü > Veri toplama ekipmanı: < / güçlü > | |||
| Fiji yazılımı | açık kaynaklı Yazılım | ||
| PyHST yeniden yapılandırma araç seti | açık kaynaklı Yazılım |
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Bu makale yayımlandı
Video yakında