Murin İntraabdominal Yağ Depolarından Adipojenik ve Fibroinflamatuar Stromal Hücre Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Beyaz yağ dokusu (WAT), memelilerde enerji depolamanın ana bölgesini temsil eder. Bu doku içinde, adipositler veya "yağ hücreleri", büyük tek gözlü lipid damlacıkları halinde paketlenmiş trigliserit formunda fazla kaloriyi depolar. Ayrıca, adipositler, enerji homeostazının^çeşitli yönlerini düzenleyen çok sayıda faktör salgılar ^1,2,3. Adipositler, WAT hacminin büyük kısmını oluşturur; bununla birlikte, adipositler, WAT ^4,5'te bulunan toplam hücrelerin yalnızca %50'sinden daha azını temsil eder. WAT'ın adiposit olmayan bölmesi veya stromal-vasküler fraksiyon (SVF) oldukça heterojendir ve vasküler endotel hücreleri, dokuda yerleşik bağışıklık hücreleri, fibroblastlar ve adiposit öncü hücre (APC) popülasyonlarını içerir.

WAT, enerji depolama talebi arttıkça boyut olarak genişleme konusundaki olağanüstü kapasitesi açısından olağanüstüdür. Bu doku plastisitesinin korunması önemlidir, çünkü lipitlerin WAT'ta yeterli depolanması, adipoz olmayan dokulara zararlı ektopik lipid birikimine karşı koruma sağlar⁶. Bireysel WAT depolarının kalori fazlalığına yanıt olarak bu genişlemeye maruz kalma şekli, obezite ortamında insülin duyarlılığının kritik bir belirleyicisidir⁷. Metabolik sendromlu obez bireylerde gözlenen patolojik WAT genişlemesi, metabolik olarak uygun deri altı yağ dokusu pahasına viseral WAT depolarının tercihli genişlemesi ile karakterizedir. Ayrıca, obezitede insülin direnci, WAT'ın patolojik yeniden şekillenmesi ile ilişkilidir. Bu, mevcut adipositlerin hipertrofik büyümesi (boyutta artış), yetersiz anjiyogenez, kronik metabolik inflamasyon, hücre dışı matris bileşenlerinin birikimi (fibroz) ve doku hipoksisi^ile karakterizedir ^8,9. Obezitenin bu WAT fenotipleri, lipodistrofi durumunda gözlenene benzer şekilde hepatik steatoz ve insülin direnci ile ilişkilidir (fonksiyonel WAT yokluğu). Buna karşılık, metabolik olarak sağlıklı obez popülasyonda sağlıklı WAT genişlemesi gözlenir ve koruyucu deri altı WAT'ın tercihli genişlemesi ve adiposit hiperplazisi¹⁰ yoluyla depo genişlemesi ile karakterize edilir. Yeni adipositlerin alımına, adiposit öncü hücrelerinden (APC'ler) ("adipogenez" olarak adlandırılır) de novo adiposit farklılaşması aracılık eder. Adiposit hiperplazisi, nispeten daha düşük derecelerde WAT fibrozu ve metabolik inflamasyon ile çakışır ^6,11. WAT mikro çevresindeki çok sayıda hücre tipi, obezitede WAT'ın sağlığını ve genişletilebilirliğini doğrudan etkiler¹². Bu nedenle, WAT'ta bulunan çeşitli hücre tiplerinin işlevini tanımlamak, alan için yüksek bir öncelik olmaya devam etmektedir.

Son on yılda, yerel APC'leri insan ve fare WAT SVF^13'ten tanımlamak ve izole etmek için çeşitli stratejiler kullanılmıştır. Bu tür stratejiler, antikor bazlı hücre ayırma teknikleri kullanarak ortak mezenkimal kök / progenitör hücre belirteçlerinin hücre yüzeyi ekspresyonuna dayalı olarak APC'leri izole eder. Bu yaklaşımlar, florofor işaretli antikorlar kullanılarak floresanla aktive edilen hücre sınıflandırmasını (FACS) veya immünomanyetik boncuk ayrımını (yani kimyasal olarak modifiye edilmiş antikorlar) içerir. APC'lerin izolasyonu için hedeflenen hücre yüzey proteinleri arasında PDGFRα, PDGFRβ, CD34 ve SCA-1 bulunur. Bu yaklaşımlar APC'ler için zenginleştirmeye yardımcı oldu; Bununla birlikte, bu belirteçlere dayalı olarak izole edilen hücre popülasyonları oldukça heterojendir. Çok yeni tek hücreli RNA dizileme (scRNA-dizilimi) çalışmaları, murin WAT^{14,15,16,17'nin} izole edilmiş stromal-vasküler fraksiyonu (SVF) içindeki stromal hücrelerin moleküler ve fonksiyonel heterojenliğini vurgulamıştır. Kendi scRNA-seq ve fonksiyonel analizlerimizden, yetişkin farelerde intraabdominal WAT'ın stromal bölmesinde fonksiyonel olarak farklı bağışıklık modüle edici ve adipojenik PDGFRβ+ perivasküler hücre alt popülasyonlarını tanımladık ve karakterize ettik¹⁵. Fibro-inflamatuar öncüler veya FIP'ler, PDGFRβ+ hücrelerinin belirgin bir alt popülasyonunu temsil eder ve LY6C ekspresyonuna (LY6C + PDGFRβ+ hücreleri) dayalı olarak izole ^edilebilir15. FIP'ler adipojenik kapasiteden yoksundur, çeşitli uyaranlara güçlü bir pro-inflamatuar yanıt verir, kollajen üretir ve anti-adipojenik faktörler salgılar¹⁵. Bu hücrelerin pro-enflamatuar ve fibrojenik aktivitesi, farelerde obezite ile ilişkili olarak artar ve bu hücreleri WAT yeniden şekillenmesinin düzenleyicileri olarak gösterir. LY6C- CD9- PDGFRβ+ alt popülasyonu, adiposit öncü hücrelerini (APC'ler) temsil eder. Bu APC'ler, Pparg ve diğer pro-adipojenik genlerin ekspresyonu ile zenginleştirilir ve in vitro ve in vivo¹⁵ olarak olgun adipositlere kolayca farklılaşır. Burada, bu farklı hücre popülasyonlarının FACS kullanılarak yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından izolasyonu ve biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayrımı için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Bu protokol, yetişkin erkek ve dişi farelerin birden fazla karın içi WAT deposundan fonksiyonel olarak farklı adipoz progenitör alt popülasyonları izole etmek için kullanılabilir¹⁵. Bu fonksiyonel olarak farklı hücre popülasyonlarını izole edilmiş olarak incelemek, sağlık ve hastalıkta adipogenezi ve intraabdominal yağ dokusunun yeniden şekillenmesini düzenleyen moleküler mekanizmalar hakkındaki mevcut anlayışımıza büyük katkı sağlayabilir.

Aşağıdaki protokol, murin epididimal WAT'tan adipoz progenitörlerin izolasyonunu detaylandırmaktadır; bununla birlikte, aynı prosedür, hem erkek hem de dişi farelerin mezenterik ve retroperitoneal WAT depolarından karşılık gelen hücreleri izole etmek için kullanılabilir¹⁵. Farelerde bu depoların nasıl tanımlanacağı ve izole edileceğine dair ayrıntılı bir protokol Bagchi ve ^ark.18'de bulunabilir. Bu protokol, 6-8 haftalık farelerin kullanımı için optimize edilmiştir. APC'lerin sıklığı ve farklılaşma kapasitesi yaşlanma ile ilişkili olarak azalabilir.

Tüm hayvan protokolleri ve prosedürleri, Texas Üniversitesi Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Kullanımı ve Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Gonadal beyaz yağ dokusundan stromal vasküler fraksiyonun (SVF) izolasyonu

1. 6-8 haftalık farelerden gonadal beyaz yağ dokusunu inceleyin ve yağ pedlerini 1x PBS çözeltisine yerleştirin.
2. 4 adede kadar yağ deposunu birleştirin (1-2 fareden 2-4 depo önerilir) ve dokuyu 200 μL sindirim tamponu (1x HBSS,% 1.5 BSA ve 1 mg / mL kollajenaz D) içeren 10 mL'lik bir beherde kıyın.
3. Kıyılmış dokuyu 10 mL sindirim tamponu içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
4. Karışımı 37 °C'de bir su banyosunda çalkalayarak 1 saat inkübe edin.
5. Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için sindirilmiş dokuyu 100 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
6. Filtrelenmiş numuneyi% 2 FBS içeren PBS ile 30 mL'ye seyreltin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Olgun adipositler içeren süpernatanı aspire edin.
7. Hemen tercih edilen hücre izolasyon yöntemine geçin.

2. FACS kullanarak APC'lerin ve FIP'lerin izolasyonu

1. Tüpü hafifçe sallayarak peleti 1 mL 1x RBC lizis tamponunda çözün.
2. RT'de 1-2 dakika inkübe edin.
3. 10 mL %2 FBS/PBS ekleyin ve 40 μm'lik bir hücre süzgecinden temiz bir 50 mL santrifüj tüpüne geçirin.
4. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Ortamı aspire edin ve peleti Fc bloğu (1:200) içeren 400-800 μL %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.
6. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
7. mL'de ≤10⁶ hücre içeren 400 μL-800 μL hücre süspansiyonlarını 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosu bölümünde listelenmiştir.
   1. 1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO (floresan eksi bir) kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.
   2. Örnekleri PDGFRβ, CD45, CD31, CD9, LY6C antikorları ile boyayın.
8. Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
9. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
10. Ortamı aspire edin ve hücreleri 400 μL'lik %2 FBS/PBS'de yeniden süspanse edin.
11. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
12. Ortamı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra 40 μm filtre kapaklarından FACS için 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere geçirin.
13. Geçit için aşağıdaki adımları izleyin.
    1. Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.
    2. Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.
    3. APC'leri ve FIP'leri elde etmek için Şekil 1'de gösterilen geçit stratejisini kullanın. Kapı APC'leri CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C^- CD9^- ve FIP'leri CD45^- CD31^- PDGFRβ⁺ LY6C⁺ hücreleri olarak kullanın.
14. Sıralanmış hücreleri 500 μL% 100 serum içeren tüplerde toplayın ve hücreleri buz üzerinde tutun.
15. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin. Hücreleri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da tekrar santrifüjleyerek yıkamak için% 2 FBS / PBS ekleyin. Süpernatanı atın, peletlenmiş hücreleri kullanın.
16. Peletlenmiş hücreleri, sonraki analiz için uygun hacimde gonadal APC kültür ortamında (hücre kültürü için) veya uygun tamponda yeniden süspanse edin.

3. Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların immünomanyetik ayrımı

1. 1.1-1.7 adımlarını izleyerek SVF'yi gonadal beyaz yağ dokusundan izole edin.
2. Süpernatanı aspire edin ve SVF peletini 10 mL 1x ticari olarak temin edilebilen MS Tamponunda yeniden süspanse edin.
3. Hücre süspansiyonunu 40 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
4. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
5. Süpernatanı aspire edin ve peletlenmiş hücreleri 100 μL 1x MS Tamponunda yeniden süspanse edin.
6. Aşağıda tartışıldığı gibi CD31 ⁺ ve CD45 ⁺ hücre tükenmesini gerçekleştirin (Şekil 2A, Adım 1). Bu, endotelyal ve hematopoietik soy hücrelerini çıkarmak için yapılır.
   1. Bir hücre sayacı kullanarak hücreleri sayın ve konsantrasyonu ≤ 1 x 10⁸ hücre / mL'ye ayarlayın.
   2. Biyotin konjuge CD31 ve CD45 antikorlarını, her biri 10⁶ hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda hücre süspansiyonuna ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   3. 4 mL 1x MS Tampon ekleyerek hücreleri yıkayın.
   4. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
   5. Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponu ile yeniden süspanse edin.
   6. 10 μL streptavidin nanoboncuk ekleyin ve hücreleri buz üzerinde 15 dakika inkübe edin.
   7. 4 mL 1x MS tamponu ekleyerek hücreleri yıkayın.
   8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 600 x g'da santrifüjleyin, ardından süpernatanı aspire edin.
   9. Hücreleri 2.5 mL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin ve 5 mL'lik bir polipropilen tüpe aktarın.
   10. Tüpü 5 dakika boyunca mıknatıs rafına yerleştirin.
   11. Hücre süspansiyonunu temiz bir 15 mL santrifüj tüpüne dökerek etiketlenmemiş hücreleri toplayın.
       NOT: İstenmeyen hücre fraksiyonundan kontaminasyona yol açtığından, asılı damlacıkları sallamaktan veya lekelemekten kaçının.
   12. Tüpü mıknatıstan çıkarın ve 3.6.9 adımlarını tekrarlayın. 3.6.11'e kadar. toplam 3 yıkama için iki kez daha.
7. Adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların ayrılması (Şekil 2A, Adım 2)
   1. Etiketlenmemiş kesir (yani, CD45^- CD31^- kesir) ile çalışmaya devam edin.
   2. Etiketlenmemiş hücreler içeren 15 mL'lik tüpü 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
   3. Süpernatanı aspire edin ve peleti 100 μL 1x MS tamponunda yeniden süspanse edin.
   4. Biyotin konjuge LY6C ve CD9 antikorlarını, sırasıyla, 10⁶ hücre başına ≤ 0.25 μg konsantrasyonda ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
   5. 3.6.3 adımlarını takip edin. 3.6.12'ye kadar. ikinci ayrımı tamamlamak için.
   6. İlişkilendirilmemiş kesirleri toplayın. Etiketlenmemiş hücreler (LY6C-CD9^-), APC'leri içeren adipojenik fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).
   7. Tüpü mıknatıstan çıkarın, yeniden süspanse edin ve bağlı hücreleri 1x MS tamponunda elüte edin. Elüatlar veya etiketli fraksiyon (LY6C ⁺ CD9 ⁺), FIP içeren adipojenik olmayan fraksiyonu temsil eder (Şekil 2A, Adım 3).
   8. Etiketli ve etiketsiz fraksiyonları 600 x g'da 5 dakika boyunca 4 °C'de pelet hücrelerine santrifüjleyin.
8. Hemen hücre kültürüne geçin (adım 6) veya tercih edilen analizler için farklılaşmamış öncüler kullanın (adım 4 ve/veya adım 5).

4. Akış sitometrisi ile adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonların saflığını değerlendirin

1. Fc bloğu (1:200) içeren 200-400 μL'lik %2 FBS/PBS'de boncuk izole hücre fraksiyonlarını yeniden süspanse edin.
2. 4 °C'de 10 dakika inkübe edin.
3. Hücre süspansiyonunu 1.5 mL'lik tüplere aktarın ve antikorlar ekleyin. Antikor konsantrasyonları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.
   1. 1) boyanmamış hücreler, 2) tek renk kontrolleri ve 3) FMO kontrolleri için ayrı kontrol tüpleri hazırlayın.
   2. Örneklere CD45, CD31, CD9 ve LY6C antikorları ekleyin.
4. Işıktan koruyarak 4 °C'de 15 dakika inkübe edin.
5. 600 x g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
6. Süpernatan aspire edin ve hücreleri 400 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin.
7. Süspansiyonu 600 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjleyin.
8. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 400-800 μL% 2 FBS / PBS'de yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi ile analiz için 40 μm filtre kapaklarından 5 mL polistiren yuvarlak tabanlı tüplere süzün.
9. Saflığı değerlendirmek için akış sitometrisi analizi
   1. Telafi için lekesiz ve tek renkli kontroller kullanın.
   2. Deneysel kapıları ayarlamak için FMO kontrollerini kullanın.
   3. Şekil 2B'de gösterildiği gibi canlı ve tek hücreler için geçit stratejisini kullanın.
   4. CD2, CD45, LY31C ve CD6 için Şekil 9B'de gösterildiği gibi geçitleme işlemini gerçekleştirin.
   5. İzole fraksiyonlar içinde CD45^- CD31^- LY6C^- CD9^- hücrelerinin (APC'ler) ve CD45^- CD31^- LY6C ⁺ hücrelerinin (FIP'ler) frekanslarını değerlendirmek için akış sitometrisi yazılımını kullanın.

5. FIP'lerin ve APC'lerin saflığını değerlendirmek için kantitatif PCR kullanarak gen ekspresyonu analizi

1. Üreticinin talimatlarını izleyerek ticari olarak temin edilebilen ekstraksiyon kitini ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak manyetik veya FACS izole hücrelerden mRNA'yı çıkarın.
2. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir cDNA Ters Transkriptaz kiti ( Malzeme Tablosuna bakın) kullanarak cDNA'yı sentezlemek için 1 μg RNA kullanın.
3. SYBR yeşil PCR ana karışımı kullanarak kantitatif PCR ile APC ve FIP'leri seçici genlerin (Tablo 1) nispi mRNA seviyelerini belirleyin.
   1. PCR için numune reaksiyonunu aşağıdaki gibi ayarlayın: 5 μL 2x SYBR yeşil boya, 1 μL cDNA (~50 ng/ μL), her bir ileri ve geri astardan 0.5 μL (10 μM) ve 3 μL su.
   2. Kantitatif PCR çalıştırması için aşağıdaki standart PCR koşullarını kullanın: tutma aşaması: 50 °C 2 dakika, 95 °C 10 dakika; PCR aşaması (40 döngü): 15 saniye boyunca 95 °C, 1 dakika boyunca 60 °C.
4. ΔΔ-Ct'yi hesaplayarak değerleri temizlik geni (Rps18) seviyelerine normalleştirin.
5. İstatistiksel anlamlılığı değerlendirmek için, eşleştirilmemiş Öğrenci t-testini gerçekleştirin.

6. Hücre kültürü ve farklılaşması

1. Manyetik olarak veya FACS ile izole edilmiş hücreleri 600 x g'da 4 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
2. Peletleri 500 μL gonadal APC kültür ortamında yeniden süspanse edin ve 48 oyuklu bir kültür plakasındaki her fraksiyondan 40K hücre / kuyu plakalayın.
3. Ortamı her 1-2 günde bir değiştirin. APC'ler, birleşmeye yaklaştıkça adipositlere farklılaşmaya başlayacaktır. Aynı ortamda tutulan FIP'ler, adipogenez geçirmeye dirençlidir.

Bu protokol, yetişkin farelerin karın içi WAT depolarından farklı stromal hücre popülasyonlarının izolasyonuna izin veren iki stratejiyi tanımlar. APC'ler ve FIP'ler, FACS (Şekil 1) veya biyotinile antikorlarla immünomanyetik boncuk ayırma (Şekil 2) ile izole edilebilir. Her iki yaklaşım da ticari olarak temin edilebilen reaktifleri ve antikorları kullanır. İmmünomanyetik boncuk ayrımı, gWAT SVF'den adipojenik olmayan hücrelerden adipojenik hücrelerin ayrılmasına yol açar. Akış sitometri analizi, adipojenik fraksiyon içindeki hücrelerin u'inin LY6C-CD9-APC'leri temsil ettiğini gösterdi. Adipojenik olmayan fraksiyonun% >75'i FIP'leri (LY6C + hücreleri) temsil etti.

Şekil 1: PDGFR β + stromal hücre alt popülasyonlarının gonadal WAT'tan FACS ile izolasyonu. (A) Prosedürün şematik genel bakışı: Stromal vasküler fraksiyon (adiposit olmayan hücreler), enzimatik doku sindirimi ve santrifüjleme ile olgun adipositlerden ayrıldı. Floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) daha sonra endotelyal (CD31+) ve hematopoietik (CD45+) soy hücrelerini çıkarmak ve LY6C+ PDGFRβ+ hücrelerini (FIP'ler) ve LY6C-CD9-PDGFRβ+ hücrelerini (APC'ler) izole etmek için kullanıldı. (B) Temsili FACS toplama kapıları. Panel A, ref.11'den izin alınarak çoğaltılmıştır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Adipojenik ve adipojenik olmayan stromal hücrelerin immünomanyetik boncuk ayırma ile ayrılması. (A) Prosedürün şematik genel bakışı: Adım 1: CD31 + ve CD45 + hücreleri mıknatısa bağlanır. Bu, hem endotelyal hem de hematopoietik soy hücrelerini ortadan kaldırır. CD31- ve CD45- hücreleri içeren elüat toplandı ve daha sonra sırasıyla LY6C ve CD9'u tanıyan antikorlarla inkübe edildi. Adım 2: CD9 + ve LY6C + hücreleri mıknatısa bağlanır. Adım 3: CD9- ve LY6C- hücrelerini içeren süpernatan (bağlanmamış fraksiyon), adipojenik fraksiyonu (APC'ler) temsil ettiği için toplandı. Nanosferlere bağlı adipojenik olmayan CD9 + ve LY6C + hücreleri, FIP'leri içeren APC olmayan fraksiyon olarak ayrıştırıldı. (B) Sırasıyla adipojenik ve adipojenik olmayan fraksiyonlar içinde APC'lerin (LY6C-CD9-) ve FIP'lerin (LY6C +) sıklığını değerlendirmek için akış sitometrisi analizi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Işık mikroskobu ve gen ekspresyon analizi, 6-8 haftalık farelerin FAC'leri veya gWAT'tan manyetik boncuk ayrılması yoluyla izole edilen APC'lerin, Gonadal APC Kültür ortamında hücrelerin ilk kaplamasını takip eden 7-10 gün içinde lipid içeren adipositlere yüksek derecede farklılaştığını göstermektedir (Şekil 3). Buna karşılık, adipojenik olmayan öncüller (fibro-inflamatuar öncüler veya FIP'ler gibi) fibroblast benzeri kaldı ve aynı kültür ortamında (Gonadal APC Kültür Ortamı) tutulduğunda adiposithaline gelmedi (Şekil 3). APC olmayan kültürlerdeki az sayıda hücrenin bir miktar lipid birikimi gösterdiğine dikkat edilmelidir (Şekil 3D). Bunlar muhtemelen hücre izolasyonu sırasında APC kontaminasyonundan kaynaklanmaktadır. Ek yıkamalar bu fraksiyonun saflığını artırabilir.

Şekil 3: Yetişkin farelerin gWAT'ından izole edilen PDGFR β + stromal hücre popülasyonlarının in vitro farklılaşması. (İ.Ö.) 6-8 haftalık fare gWAT SVF'den immünomanyetik boncuk ayırma (AB) veya FACS (CD) ile izole edilen farklılaşmış stromal hücre alt popülasyonlarının temsili parlak alan görüntüleri. Görüntüler, hücrelerin Gonadal APC Kültür Ortamında kaplanmasından yedi gün sonra çekildi. Kaplamadan sonraki 7-10 gün içinde APC'ler spontan adiposit farklılaşmasına uğrar. Büyütme 10X. Ölçek = 250 μM. (E-F) A-D'de gösterilen diferansiye kültürlerde adiposit seçici genlerin mRNA seviyeleri. Çubuk grafikler ortalama + SEM'i temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: FIP'lerin ve APC'lerin izolasyonunu doğrulamak için kullanılan qPCR primer dizileri

T.A.P., Novo Nordisk A/S'nin bir çalışanı ve hissedarıdır