Sıçan Medial Gastroknemius KasTek Motor Üniteleri Fonksiyonel İzolasyon

Motor üniteleri (MUs) iskelet kaslarının en küçük fonksiyonel birimleridir. Bu nedenle, onların fonksiyonu, plastisite ve kontraktil özellikleri yanı sıra kuvvet düzenleme mekanizmaları anlamak, kas fizyolojisi ilerleme için çok önemlidir. MUs'un temel kontraktil özellikleri ve fizyolojik türlerinin oranları deneysel hayvanlarda ağırlıklı olarak arka bacak kasları olmak üzere çok sayıda kas için belgelenmiştir. Ancak, HEM MU özelliklerinin plastisite ve MU kuvvet düzenleme mekanizmaları hala tam olarak anlaşılamamıştır.

Açıklanan yöntemin prensibi ince ventral kökleri hazırlamak için lomber vertebra da araştırılmış ve laminektomi dışında arka bacak kaslarının geniş denervasyon, her biri tek bir "fonksiyonel" motor akson içeren, MU kuvvet ve eylem potansiyelini kaydetmek için elektriksel olarak uyarılır. Bu yazıda açıklanan tekniği kullanarak, başarılı bir deneyde medial gastroknemius kasının MM'lerinin yarısından fazlasını izole etmek mümkündür. Sıçan medial gastroknemius ortalama oluşur 52 MUs (kadın) veya 57 MM (erkek) üç fizyolojik türleri: S (yavaş), FR (hızlı dirençli) ve FF (hızlı yağlanabilir)^1,2, ve değişken kontraktil özelliklere sahip³. Kontrol ve deney gruplarındaki MA'ların ortalama değerlerini karşılaştıran deneyleriçin, bu grupların her biri için 10-30 MUs'un izolasyonu ve kaydı gereklidir. Kritik olarak, tek tek MUs'lar bir saati aşan süreler için uyarılma için erişilebilir olabilir. Ayrıca, bu teknik hem MU kuvvet hem de eylem potansiyellerinin kaydedilmesine olanak sağladığından, bu yöntem kuvvet üretimiyle ilişkili olguları incelemek, yorgunluğun etkisini değerlendirmek ve kuvvet ve eylem potansiyelleri arasındaki ilişkiyi gözlemlemek için uygundur.

Önceki çalışmalar MU kontraktil özellikleri plastik olduğunu doğruladı ve çok sayıda müdahaleler ile modüle edilebilir. Burada açıklanan tekniği kullanarak deneyler sıçan medial gastroknemius⁴ veya sıçan diğer arka bacak kasları üzerinde yapılmıştır^5,6 yanı sıra kedi kasları üzerinde⁷, tek MU izolasyon benzer bir yöntem kullanılarak. Değişken inter-nabız aralıklarında teslim uyaranların trenler kullanarak deneylerbaşka bir dizi motor kontrol süreçleri ile ilgili gözlemler sağlanan, ve uyarılma tarihine genel dönüş sonuçları, hatta bir uyarıcı zaman ölçeğinde bir kayma önemli etkileri de dahil olmak üzere, kuvvet üretimi için çok önemli^8,9.

MUs da alternatif yöntemler kullanılarak incelenebilir. İlk olarak, bir yöntem motoneurons doğrudan stimülasyon olduğunu. Burke kedi medial gastroknemius motoneurons hücre içi stimülasyon kullanılan ve cam mikroelektrotlar ile soleus bu nöronların elektrofizyolojik özelliklerini belirlemek için kullanılan^1,10. Diğer yöntemler insan kaslarında MUs çalışma önerilmiştir, hangi önemli ölçüde daha düşük müdahale gerektiren. Tüm bu yöntemler için, uyarıcı ve kayıtları elektrotlar kas veya sinir içine yerleştirilir, ve kuvvet parmak veya ayak kaydedilir. Bu yöntemlerden ilki ilk dorsal interosseous kas da MUs çalışma için kullanılmıştır. Bu kas için, düşük bir kuvvet ile sözleşme, sadece bir aktif motor biriminin eylem potansiyelleri tespit iğne elektrot ile kaydedilen elektromiyogram. Daha sonra paralel olarak kaydedilen ve her eylem potansiyelini takip eden bir kas kuvvetinin parçaları ortalamaya (başak tetiklenen ortalama) idi. Bu yöntem, bir motor biriminin kuvvetinin kas kuvvetinden çıkarılmasını sağlar^11. Ancak bu işlemin metodolojik zayıflığı tek bir seğirme kuvveti değil, tetanik kasılmalar parçalarının ortalamasının saptanabı olmasıdır. İnsan MUs da kas içine yerleştirilen bir elektrot kullanılarak intramüsküler elektrik mikrostimülasyon ikinci yöntemi kullanılarak incelenebilir¹², hangi bir aksonal ağacın bir parçası uyarır, tek bir motor biriminaktivasyonu yol açan. Üçüncü yöntem sinir içine yerleştirilen bir elektrot ile mikrostimülasyon olduğunu. Elektrot sinirde sadece bir motor akson aktive ettiğinde, sadece bir motor ünitesi¹³sözleşme. Bu son yöntemlerin, kaydın stabilitesi ve kalitesi, etik kısıtlamalar ve deneysel materyale erişim gibi bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol yaygın 70's ve 80's¹⁴kedilerde kullanılmıştır.

Tüm prosedürlerin yerel etik komitesi tarafından onaylanması ve hayvanların bakımıyla ilgili Avrupa Birliği yönergelerine ve hayvanların korunmasına ilişkin ulusal yasaya uyulması gerekmektedir.

NOT: Bu prosedürde yer alan her deneyci temel cerrahi işlemler konusunda eğitilmeli ve hayvan deneyleri yapmak için geçerli bir lisans almalıdır.

1. Anestezi

1. Sodyum pentobarbital intraperitoneal enjeksiyon (60 mg·kg^-1başlangıç dozu) ile sıçan anestezik.
2. Yaklaşık 5 dakika sonra, künt forseps ile sıçan kulağı veya ön bacak çimdikleme tarafından anestezi derinliğini kontrol edin. Yalnızca refleks eylemi gözlenmediğinde protokolün sonraki adımlarına gidin.
3. Ameliyat sırasında, hayvanın her 10-15 dakikada bir refleks hareketleri olup olmadığını kontrol edin ve hayvan hareketle bir tutam yanıt verirse anesteziyi tamamlayın (genellikle 10 mg·kg^-1·h^-1 sodyum pentobarbital, IP).

2. Cerrahi

1. Topuktan kalçaya (ilk segment, kas ve sinir izolasyonu), topuktan kalçaya sağ arka bacak (ikinci segment, yer elektrodu) ve kuyruktan torasik segmentlere (üçüncü segment, laminektomi) kadar olan arka kısmı tıraş ederek hayvanı cerrahi işlem için hazırlayın. Deneyin akut doğası nedeniyle antiseptik gerekli değildir.
   1. Fareyi karnına ısıtma yastığı (37 °C ± 1 °C) yerleştirin.
2. Laminektomi
   1. Keskin-künt makas kullanarak, sakrum dan torasik vertebra kadar spinal kolon boyunca deri kesti.
   2. Altta yatan kaslardan cildi ayırın.
   3. Künt uç makası kullanarak, sakrum ve lomber spinous süreçlerin her iki tarafında longissimus kas kesip.
   4. S1 omurunu en düşük segment olarak tanımlayın. Keskin künt makas kullanarak, L6'dan L2 omurlarına kadar spinous prosesleri kesin ve çıkarın. Daha sonra, ince rongeurs kullanarak, l6-L2 enine süreçleri kaldırmak ve L6 üzerinde bir laminektomi gerçekleştirmek - L2 segmentleri (ilk enine süreçler, sonra lamina, L6 vertebrasegment ile başlar) dura mater kaplı omurilik lomber segmentleri ortaya çıkarmak için. Hayvan immobilizasyonu için bir fiksasyon noktası olarak kullanılacak sakral kemik ve L1 spinous süreci, kesmek için dikkatli olun.
   5. Keskin makas kullanarak, laminaektomi üst sınırında, omurilik (kaudal parçası) ve L2 vertebra segment düzeyinde dorsal ve ventral kökleri kesti. Kanamayı durdurmak için kurutulmuş jel köpük küçük parçalar yerleştirin. Sonra, maruz kalan omurilik segmentleri üzerinde ince, tuzlu batırılmış pamuk yerleştirin.
3. Medial gastroknemius kas ve sinir izolasyonu
   1. Keskin künt makas kullanarak, sol arka ekstremitenin arka tarafında uzunlamasına bir kesik yapın, Aşil tendonundan kalçaya kadar.
   2. Forseps ile cildi kavramak ve kesi her iki tarafında altta yatan kaslardan cildi ayırın.
   3. Pazı femoris kas ile kaplıdır diz ekleminin arkasında popliteal fossa bulun. Makas kullanarak, bu kasın ön ve arka kısmı arasında bir kesim yapmak.
   4. Yukarı doğru hareket, siyatik sinir ortaya çıkarmak için kalça ya kadar pazı femoris iki baş kesti.
   5. Künt forceps ve makas kullanarak, gastroknemius kas medial başkanı lateral ayırın ve medial gastroknemius kas distal ekleme (Aşil tendonu) kesti. Kuvvet dönüştürücübağlanmak için kullanmak için mümkün olduğunca aşil tendonu parçası korumak.
   6. Medial gastroknemius (MG) sinirini tanımlayın. Forceps ve makas kullanarak, arka pazı ve semitendinosus için teminatlar da dahil olmak üzere siyatik sinir, kalan tüm teminatları kesti. Medial gastroknemius bozulmamış kaynağı kan damarları bırakın.
   7. Aşil tendonu ile iplik olmayan bir elastik ligatür ve üç düğüm yapmak.
   8. Maruz kalan sinir ve kas altında tuzlu batırılmış pamuk parçası yerleştirin.
   9. Tırtıklı forceps kullanarak, işletilen alan üzerinde cildi kapatın.
   10. Keskin-künt makas kullanarak, metal bir kelepçe (3.1.6.) ile immobilizasyon için sol arka ekstremitenin ön tarafında deri ve altta yatan bağ dokusu 2 cm kesi yapmak.

3. Kayıt ve uyarılma için hazırlık

1. Vertebral kolon ve bacak fiksasyonu ve kas düzeni
   1. Çelik bir kelepçe kullanarak, kaval kemiğine kelepçe koyarak sol arka ekstremite düzeltmek.
   2. Fareyi özel yapım ayarlanabilir çerçeveye (izole bakır tel, 1 mm) yerleştirin, dört ligatür kullanarak laminektomi etrafındaki deri kapaklarını yukarı çekin ve açıkta kalan omurilik üzerinde parafin yağı (yaklaşık 50 mm x 50 mm) için bir havuz oluşturmak için cildi çerçeveye dikin.
   3. Dumont #55 forseps kullanarak, omuriliğin kesiştiği yerde dura mater kaldırın, sakral kemiğe kadar caudally kesip ve geri çekmek.
   4. Bir künt cam çubuk kullanarak, ayrı sol ve sağ dorsal ve ventral kökleri ardışık seviyelerde, onlara zarar vermemeye özen.
   5. Omuriliğin üzerindeki havuzu, maruz kalan ventral ve sırt köklerini kaplayan sıcak (37 °C) parafin yağı ile doldurun.
   6. Fareyi, kapalı devre ısıtma sistemine bağlı arka ayakları için havuzlu (uzunluk 135 mm, genişlik 100 mm, derinlik 45 mm) özel yapım alüminyum plakaya (uzunluk 260 mm, genişlik 120 mm, yükseklik 80 mm) yerleştirin. Plaka, hayvanın hareketsiz hale getirileceği ve deney yapılacağı yerdir.
   7. Hindimb hareketsizleştirmek için metal çubuk ile sol arka bacak koymak kelepçe düzeltin.
   8. Hayvan vücudunu hareketsiz hale getirmek ve solunum hareketleri ile ilgili kuvvet kayıtlarında bulunan eserleri ortadan kaldırmak için sakral kemik ve L1 omurlarına çelik kelepçeler koyarak vertebra kolonunu düzeltin.
   9. Sol medial gastroknemius kasını elastik olmayan ligatür ile kuvvet transdüserine (50 μm/250 mN, ölçüm aralığı 0-1000 mN) aşil tendonu ile bağlayın.
   10. Medial gastroknemius kasını kapsayacak şekilde arka bacaklar için hazneyi sıcak (37 °C) parafin yağı ile doldurun ve sıcaklık probu ve otomatik sistemi kullanarak 37 °C ± 1 °C'de yağ sıcaklığını koruyun.
2. Eylem potansiyelleri kayıt ve stimülasyon için elektrotların yerleştirilmesi
   1. Medial gastroknemius kasının orta kısmına, uzun eksenine dik bipolar gümüş telli elektrot yerleştirin. Kasın uzun bir ekseni boyunca bulunan iki elektrot arasında yaklaşık 5 mm mesafe koruyun. Bu elektrotlar motor birim eylem potansiyellerini (MUAP) kaydetmek için kullanılacaktır. Elektrotları düşük gürültülü amplifikatörüne bağlayın.
   2. İşletilen kası 100 mN'lik pasif bir gerilime kadar uzatın, kuvvet transdüseri tarafından kontrol edin. Bu streç sıçan medial gastroknemius için üç tip MM'ler en yüksek seğirme kuvveti geliştirmek¹⁵.
   3. Keskin künt makas kullanarak, sağ arka ekstremitenin derisinde 2 cm'lik bir kesi yapın ve referans elektrot olarak kullanılmak üzere gümüş telli bir elektrot takın.
   4. Açıkta kalan spinal köklerin üzerine özel yapım yalıtımlı metal plakayı (boyut 30 mm x 13 mm) yerleştirin ve tamir edin. Sol daki ventral ve sırt kökleri (L4, L5 ve L6) çiftlerini plakaya koyun.
   5. Laminektomi etrafında deri tarafından oluşturulan havuza tuzlu ekleyin. Tuzlu seviye yalıtımlı plakanın altında olmalıdır.
   6. Elektrot uyarıcı elektrot (iki gümüş tel, 0,5 mm çapında, uzunluğu 50 mm) maruz kalan spinal köklerin üzerine yerleştirin, yağda plakanın 3 mm üzerine pozitif bir kutup yerleştirin, tuzlu daki negatif kutup ise (plakanın altında havuza eklenir) ve uyarıcıya bağlanın.

4. Motor ünitesi kayıtları

1. Elektriksel dikdörtgen darbeler (0,1 ms süre, genlik 0,5 V'a kadar) ile uyarıcı, ventral kökleri seçin (L4, L5 ve L6); ventral kök stimülasyonu dorsal kökler için böyle bir etkisi yoktur ise kasların kasılması çağrıştırıyor. Plakadan dorsal kökleri ortadan kaldırın. Medial gastroknemius için, en aksonlar L5 ventral kökü bulunmaktadır.
2. Dumont #55 forseps ve büyüteç bir çift kullanarak, akson çok ince demetleri halinde L5 veya L4 ventral kökleri bölünmüş (her iki forseps ile ventral rootlet kesme ucunu kavramak ve ayrı kök soyma); gümüş bir tel elektrot üzerine bu demetleri yerleştirin ve tek bir MU aktivitesini elde etmek için (0,5 V'a kadar genlik 0,1 ms dikdörtgen darbeler) uyarmak. Sağlam bir destek (metal çubuk) forseps kullanmak için bir el desteği olarak kullanılabilir akson, ince demetleri işlemek için çok yararlıdır. Ayrıca ek bir ışık kaynağı gerekli olduğunu unutmayın.
3. Uyarıcının yoğunluğunu kademeli olarak artırarak, seğirme daralması ve eylem potansiyeli uyarıcının uyarılmış "all-or-none" karakterine dayanarak tek bir MU tanımlayın. Uyarılmı eşiğin etrafındaki bir uyarımda dikkatlice test edin.
   1. Birden fazla MU incelenen kas sözleşme ve kuvvet artan düzeyi yanı sıra artan genlik veya eylem potansiyelinin değişen şekli görünür olduğunda, adım 4.2 geri gidin ve akson demeti tekrar bölün. Sıçan medial gastroknemius en güçlü MM zayıf olanlardan yaklaşık 70 kat daha büyük seğirme kuvvete sahip olduğunu unutmayın ve çok güçlü MU ikinci seğirme olduğunda, zayıf MU belirgin olmayabilir. Ayrıca bazı MUs'ların elektrotun kayıt alanıdışında bulunan kas liflerine sahip olduğunu ve elektromiyogramda görünmediğini unutmayın; böyle bir durumda uyarıcı genlik değişiklikleri kuvvet etkisi olabilir ama eylem potansiyeli.
4. Deney amacıyla gerekli bir uyarım protokolü ile bir motor ünitesi teşvik. Tüm temel motor ünitesi kontraktil ve eylem potansiyelleri özellikleri hesaplamak için gerekli temel bir stimülasyon protokolü için, aşağıdakileri içerir.
   1. 1 Hz'de 5 uyaran ekleyin (kaydedilen ve ortalama 5 tek anahtar; ortalama gürültüyü ortadan kaldırmaktır, bu da özellikle en zayıf MUs'lar için önemlidir).
   2. 500 ms'lik bir süre ile 10, 20, 30, 40, 50, 60, 75, 100 ve 150 Hz frekanslarında bir dizi uyaran ekleyin (bu kayıtlar kuvvet frekansı ilişkisinin hesaplanmasını, 150 Hz'de maksimum tetanik kuvvetin ve 20-40 Hz stimülasyonda sarkıntının hesaplanmasını sağlar).
   3. Yorulma testi (tetani 40 Hz frekansında 14 uyaran trenler tarafından uyarılmış, 4 dakika boyunca her saniye tekrarlanan) ekleyin.
   4. Yukarıdaki protokolün tüm öğeleri arasında en az 10 s zaman aralıkları ekleyin.
   5. Ardışık izole motor üniteleri ile işlemi tekrarlayın.
5. Deneyi sonlandırın ve öldürücü dozda pentobarbital sodyum (180 mg·kg^-1)intraperitoneal uygulama kullanarak hayvanı ötenazi edin.

5. Elektronik cihazlar

NOT: Özel yapım bilgisayar programı uyarıcıyı kontrol ederek, adım 4.4'te belirtilenler de dahil olmak üzere değişken uyarım kalıpları oluşturma olanağı sağlar. Program analog-to-dijital dönüştürücü (MUAP ve kuvvet kayıtları için en az 10 kHz) ile işbirliği yapmaktadır.

1. AC amplifikatörü analogdan dijitale dönüştürücü ile bilgisayara bağlayın ve osiloskopa paralel olarak.
2. Kuvvet dönüştürücüsünü analogdan dijitale dönüştürücü ile bilgisayara bağlayın ve osiloskopa paralel olarak. Deney sırasında pasif kas kuvvetini kontrol etmek için kuvvet dönüştürücü kullanın. Deney sırasında pasif kuvvetin azalabileceğini unutmayın; bu nedenle, pasif kas kuvveti sabit tutmak için kas uzunluğunu artırmak için gereklidir.

Motor ünitesi kasılmaları ve eylem potansiyellerinin parametreleri, kayıtların sabit koşulları sağlandığında kayıtlar bazında hesaplanabilir. Şekil 1 hızlı bir MU tek seğirme temsili bir kayıt sunar. Üst izleme motor birimi eylem potansiyelini gösterir. Uyarıcı nın doğumu ile motor ünitesi eylem potansiyelinin başlangıcı arasındaki gecikme ventral kökten kaslara iletim süresinden kaynaklanmaktadır. Şekil 2, hızlı bir MU'nun aşınmamış tetanoz kuvveti ve motor birim eylem potansiyellerinden oluşan bir trenin temsili bir kaydını gösterir.

Şekil 1: Hızlı bir MU tek seğirme temsili bir kayıt. Kuvvet yolu üzerinde, motor birim eylem potansiyeli vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Hızlı bir MU (orta kayıt), motor birim eylem potansiyelleri (üst kayıt) ve uygulamalı uyaranların bir tren bir zaman konumu (aşağıda) bir tren unfused tetanoz kuvveti temsili bir kayıt. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların ifşa etmesi gereken bir çıkar çatışması yoktur.