Yeniden programlanmış periferik kan hücrelerinden nöronal fenotip içeren hücreler elde etmek için genetiği değiştirilmiş (GM içermeyen) bir yöntem sunuyoruz. Yeni insan GPI bağlantılı proteine bağlı bir sinyal yolunun aktivasyonu, insan pluripotent kök hücrelerini elde etmek için verimli bir GM içermeyen yöntem ortaya koymaktadır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kan Türevi Nöronal Hücrelerin GM'den Arındırılmış Üretimi
Bu makalede
Özet
Özet
Birçok insan nörolojik bozukluğu, beyindeki nöronların ve glial hücrelerin dejenerasyonundan kaynaklanır. Farmakolojik ve diğer terapötik stratejilerdeki sınırlamalar nedeniyle, şu anda yaralı veya hastalıklı beyin için mevcut bir tedavi yoktur. Hücre replasmanı nörodejeneratif durumlar için umut verici bir terapötik strateji olarak ortaya çıkar. Bu güne kadar fetal dokulardan, insan embriyonik hücrelerinden (ES) veya indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC) nöral kök hücreler (NSC) başarıyla oluşturulmuştur. Pluripotent kök hücrelerin üretilmesine yol açan yeni insan GPI bağlantılı glikoproteinin aktivasyonu ile bir adanmışlık süreci başlatılmıştır. Bu kan türevli pluripotent kök hücreler (BD-PSC'ler) in vitroyu brightfield ve immünofluoresans mikroskopisinde gösterildiği gibi nöral fenotipli hücrelere ayırır. Bu hücrelerin elektron mikroskopisi ile ultrayapısal analizi, ilkel yapılarının yanı sıra nöronal benzeri morfoloji ve hücre altı özelliklerini doğrular.
Giriş
Temel ve klinik öncesi kök hücre araştırma yöntemlerinin geliştirilmesi, nörolojik hastalıklar için kök hücre temelli tedavilerin klinik olarak uygulanmasını teşvik eder. Bu tür potansiyel tedavi kritik fonksiyonel iyileşmeye yol açan insan sinir hücrelerinin üretimi için yönteme bağlıdır1.
Nöral kök hücreler (NSC'ler) yetişkin nörogenez adı verilen bir süreçte yaşam boyunca kendini yeniler ve yeni nöronlara ayırır. Sadece çok kısıtlı beyin bölgeleri, yetişkinlikte yenidoğan nöronları üretmeye yetkin NSC'leri barındırır. Bu tür NSC'ler, öğrenme ve hafızada yer alan olgun nöronlara yol açabilir, böylece kayıp veya hasarlı nöronların yerini alabilir. Ne yazık ki, bu NSC'ler sınırlı miktarlarda bulunur ve bu sınırlı nörogenez çocuk gelişimi sırasında hızla azalır2. Bu nedenle, diğer sinirsel hücre kaynakları bir hücre tedavisi hedefinde düşünülmelidir.
Dejeneratif nörolojik hastalıkların standart farmakolojik yaklaşımlar kullanılarak tedavisi zordur. Birçok eskiyen nörolojik bozukluğu kucaklamak için yeni terapötik stratejiler, hastalıklı ve yaralı dokunun hücre protezi tedavilerine dayanmaktadır. NSC transplantasyonu hasarlı hücrelerin yerini alabilir ve yararlı etkiler sağlayabilir. Nöral hücre değişimi için diğer kaynaklar arasında memeli blastosistler3'üniç hücre kütlesinden elde edilen insan embriyonik kök hücreleri (ESC) veESC'lergibi geniş kendini yenileme kapasitesine sahip ve çeşitli hücre soylarına farklılaşabilen iPSC 4 bulunur. NSC'ler ayrıca pluripotent durumdan kaçınarak insan fibroblastlarından doğrudan yeniden programlama ile de oluşturulabilir5.
Hücre replasman tedavisi hala zorlu bir konudur. ESC, fetal veya iPS birçok tedavi edilemez nörolojik hastalığın tedavisi için nöronal hücrelerin üretimi için bir kaynak olsa da, hasarlı dokuların otolog yetişkin SCS hücre değişimi, immünolojik, etik ve güvenlik endişelerini atlatan daha iyi bir alternatiftir.
İnsan GPI bağlantılı proteinin PLCφ/PI3K/Akt/mTor/PTEN fosforilasyonu yoluyla antikor-çapraz bağlama ile aktivasyonu, kan progenitör hücrelerinin ve kan türevli pluripotent kök hücrelerin (BD-PSC' ler) üretimine adanmışlık başlatır6. Bu hücreler, parlak alan, immünofluoresans ve iletim elektron mikroskopisi (TEM) analizi ile doğrulanan nöronal hücrelere doğru in vitro farklılaşmaz.
Bu çalışmada, BD-PSC'lerin GM'den arındırılmış neslini ve nöronal fenotipli hücrelere başarılı bir şekilde yeniden ayırt etmelerini anlatıyoruz.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Deneyler yapılırken etik onaylar alındı.
1. İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu (PBMNC'ler)
- Tüm bağışçıların kurumsal yönergelere uygun olarak kan çekmeden önce bilgilendirilmiş onay imzaladığını sağlayın.
- Standart protokole göre eğitimli sağlık personeli tarafından sağlıklı donörlerden 30 mL kan alın.
- PBMNC'leri yoğunluk degrade ortamları tarafından yalıtın. Fosfat tampon salin (PBS) ile seyreltilmiş 25 mL 1:1 kan ile 10 mL ortam ve 30 dakika boyunca 300 x g'da santrifüj kullanın.
- Plazma ile yoğunluk gradyan ortamı arasındaki ara faz tabakasını pipetleme ile izole edin. İzole edilmiş hücreleri 5 mL steril PBS ve santrifüj ile 300 x g'da 10 dakika yıkayın.
- Sayım odası kullanarak standart yöntemlerle hücre sayısını sayın.
2. PBMNC'lerin yüzeyinde antikor çapraz bağlantısı ile insan GPI bağlantılı glikoproteinin aktivasyonu
- 6 x 106 mononükleer hücreyi (MNC) 15 mL tüplere yerleştirin ve hücreleri insan GPI bağlantılı membran proteine özgü antikor (30 μg/mL) ile PBS'de 37 °C'de % 1 sığır serum albümini (BSA) ile 30 dakika kuluçkaya yatırarak antikor çapraz bağlama işlemi gerçekleştirin.
- Kuluçka ortamını Iscove'un modifiye Dulbecco's medium'u ile %10 fetal sığır serumu (FBS) ile değiştirin.
- 15 mL polistiren tüplerde hücreleri büyütün, tüpleri 8-10 gün boyunca (titremeden) 37 ° C ve% 5 CO2'de bir inkübatöre koyun. D5'te, her 15 mL tüpe% 10 FBS ile desteklenmiş iscove'un ortamına ek bir 1-2 mL ekleyin.
3. Yeni oluşturulan farklılaştırılmış hücrelerin sıralanması
- Otomatik hücre sayacı (18 μL hücre süspansiyonu + 2 μL floresan boyası) veya bir sayım odasındaki hücreleri sayın.
- Santrifüj kültürlü hücre süspansiyonu (5-7 x10 6) 10dakika boyunca 300 x g'da ve elde edilen süpernatantı steril bir Pasteur pipetle aspire edin.
- Hücre peletini önceden soğutulmuş PBS pH 7.2, %0.5 BSA ve 2 mM EDTA'da 90 μL'de yeniden askıya alın.
- Hücre süspansiyonu içine CD45 pozitif nano boyutlu manyetik boncuklar (80 μL) ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde kuluçkaya yatırın.
- 10 dakika boyunca 300 x g'da 2 mL PBS tampon ve santrifüj ekleyerek hücreleri yıkayın.
- Hücreleri 500 μL PBS tamponunda yeniden askıya alın.
- Kolonu 500 μL önceden soğutulmuş PBS tamponu ile yıkayın ve manyetik alana yerleştirin.
- Hücre süspansiyonunu kolona yerleştirin ve 500 μL PBS tamponu (iki kez) ve CD45 negatif hücreler içeren santrifüj akışı ile yıkayın. Bunları Iscove'un %1 BSA ile desteklenmiş ortamında toplayın.
- Sayım odasındaki hücreleri say.
4. Yeni oluşturulan kök hücrelerin nöronal farklılaşması için hücre kültürü yemeklerinin hazırlanması
- Nöronal hücrelerin büyümesi için kültür damarlarını poli-L-ornitin ve laminin ile kapla.
- Cam kapakları 4 kuyulu plakalara yerleştirin ve ddH 2 O'da 1:5 seyreltilmiş poli-L-ornitin (ddH2O'da 0,1 mg/mL) ile kaplayın. Daha sonra ddH2O ile yıkayın.
- Laminin 'i (0.5-2.0 mg/mL) yavaşça çözün ve kapakların üstüne ekleyin. 2 saat boyunca 37 °C'de kuluçkaya yatırın.
- 49 mL D-MEM/F12, 500 μL N2 takviyesi, 400 μL esansiyel olmayan amino asit (NEAA), 20 ng/mL son konsantrasyonda temel FGF çözeltisi (100 μg/mL stok çözeltisinden hazırlanan) ve 2 ng/mL son konsantrasyonda heparinden oluşan sinirsel indüksiyon ortamı N2 hazırlayın.
- Pipetleme ile fazla lamininleri çıkarın ve kültür yemeklerine nöronal orta N2 ekleyin.
5. Nöronal adanmış kan hücrelerinin kült örünttürme
- Kültür BD türevli CD45 negatif hücreler laminin/ornitin kaplı cam kapaklar üzerinde 2 gün boyunca 37 °C'de bir inkübatörde ve N2 ortamında% 5 CO2 yeni BD tarafından oluşturulan hücrelerin nöronal farklılaşması başlatmak için.
- 48 mL Nörobasal ortam, 500 μL L-glutamin, 1 mL B27 Takviyesi, 500 μL NEAA'dan oluşan nöronal farklılaşma ortamında daha fazla kültür hücreleri, PBS/%0,1 BSA'da 5 μg/250 μL'de 50 μL rekombinant insan glial türevli nörotrofik faktör (GDNF) ve 50 μL rekombinant insan beyni PBS/%0.1 BSA'da 5 μg/200 μL'de türetilmiş nörotrofik faktör (BDNF) ve PBS'de 2.9 g/50 mL askorbik asit çözeltisi 50 μL. Plakaları 37 °C ve%5 CO 2'de bir inkübatöreyerleştirin.
6. Kan türevi nöral hücrelerin immünofluoresans mikroskopi analizi
- Hücreleri yukarıda açıklandığı gibi 16 gün boyunca kültüre edin ve ortamı kaldırın.
- 75 mL steril su, 4 g paraformaldehit içeren önceden ısıtılmış fiksatif ile kuluçkaya yatırın. Gerektiğinde 10 N NaOH ekleyin ve çözelti temizleninceye kadar karıştırın. Ardından 10 mL 10x PBS, 0,5 mL MgCl2, 2 mL 0,5 M EGTA ve 4 g sakkaroz ekleyin. 6 N HCl ile pH 7.4'e titrat ve Marchenko ve ark.7'yegöre 15 dakika boyunca 100 mL steril suya getirin.
- Fiksatifi atın ve hücreleri her seferinde 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Hemen yeni yapılmış% 0.3 Triton X çözeltisi ekleyin ve hücreleri 5 dakika boyunca permeabilize edin. PBS ile 3 kez yıkayın ve PBS ve% 5 BSA tarafından yapılan bir engelleme çözümü ekleyin.
- Hücreleri oda sıcaklığında bir rocker plakasında 1 saat boyunca engelleyin.
- %1 BSA/PBS'de antikorların uygun seyreltilmesini hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca rocker plakasında antikor seyreltmeleri ile kuluçkaya yatırın. Hücreleri PBS ile her biri 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın, hücreleri DAPI ile kuluçkaya yatırın ve kapakları mikroskopta görselleştirme için montaj ortamı ile monte edin.
NOT: Bu deneyde kullanılan doğrudan etiketli antikorlar Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir.
7. Yeni oluşturulan hücrelerin iletim elektron mikroskopisi analizi
- TEM için hücreleri 8 kuyulu hazneli kaydıraklara tohumleyin.
- Hücreleri 37 °C'de 1 saat boyunca % 3,5 glutaraldehitte sabitlayın, oda sıcaklığında ek bir saat için% 2 OsO4'te sabitleme sonrası ve 2 saat 30 dakika boyunca 4 °C'de karanlıkta% 2 uranil asetat lekesi.
- Son olarak, hücreleri damıtılmış suda durulayın, etanolde susuz bırakın ve bir gecede epoksi reçineye gömün. Ertesi gün numuneleri reçine sertleştirme için 72 saat boyunca 70 °C fırına aktarın.
- Gömülü hücre kültürlerini oda kaydıraktan ve tutkaldan araldite bloklarına ayırın.
- Seri yarı ince kesitleri (1,5 μm) bir makineyle kesin, cam slaytlara monte edin ve% 1 toluidin mavisi ile hafifçe lekeleyin.
- Seçilen yarı ince bölümleri araldite bloklarına yapıştırın ve tekrarlanan dondurma (sıvı nitrojende) ve çözülme ile cam kaydıraktan ayırın.
- Ultra ince bölümleri (0,06-0,08 μm) bir makineyle hazırlayın ve kurşun sitrat ile daha fazla kontrasta sahip olun.
- Dijital kamera ile elektron tarama mikroskobu kullanarak mikrografiler elde edin.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Sonuçlar, bu yeni GM içermeyen yöntemin, kan progenitör hücrelerini doğrudan insan genomuna göre hareket etmeden en ilkel durumlarına döndürebildiğine dair kanıtlar sürmüştir.
Daha önce GPI bağlantılı proteine özgü antikor çapraz bağlantısının, WNT, NOTCH ve C-Kit gibi yüksek oranda korunmuş gelişimsel olarak ilgili genlerin PLCφ/IP3K/Akt/mTOR/PTEN ile yukarı doğrulması yoluyla başlatıldığını, böylece HSC'lerin üretimine ilk adıma ve BD-PSC'lerin6,
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu çalışmada açıklanan insan hücrelerini yeniden programlamanın GM olmayan yöntemi, manipüle edilmemiş insan periferik kanından elde edilen ex vivo üretimine ve kendi kendini yenileyen PSC'lerin genişlemesine yol açan adanmışlık sürecini başlatan GPI bağlantılı insan membranı glikoproteinin arkasındaki sinyalizasyon (lar) makinelerinin çekirdek aktivasyonuna membran dayanmaktadır. Bu hücreler uygun ortamda kültürlendiğinde, farklı mikrop katmanlarına ait hücrelere yeniden ayırt edilebilir6
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
İlgili yazar, Novel Human GPI bağlantılı Protein ile ilgili bir patent sahibi olduğunu ve ACA CELL Biotech'i kurucu ve bu şirket için çalıştığını beyan eder. Diğer yazarlar herhangi bir çıkar çatışması yaşamadıklarını beyan ederler.
Teşekkürler
Dr. Rainer Saffrich'in anısına adanmış.
Yazarlar özellikle Prometeo Grant for Excellence Research Groups PROMETEO/2019/075 araştırma finansmanı ile desteklenen Karşılaştırmalı Nörobiyoloji Laboratuvarı, Cavanilles Biyoçeşitlilik ve Evrimsel Biyoloji Enstitüsü, Valencia Üniversitesi, CIBERNED, Valencia, İspanya'da EM deneyleri ve analizleri yaptıkları için José Manuel García-Verdugo ve Vicente Herranz-Pérez'e minnettardır. Bu çalışmanın geri kalanı ACA CELL Biotech GmbH Heidelberg, Almanya tarafından desteklendi.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Albümin Fraksiyonu V | Roth | T8444.4 | |
| Anti-GFAP Cy3 konjugatı | Merck Millipore MAB3402C3 | ||
| Anti-MAP2 Alexa Fluor 555 | Merck Millipore | MAB3418A5 | |
| Anti-Nestin Alexa Fluor 488 | Merck Millipore | MAB5326A4 | |
| Anti-Tuj1 Alexa Fluor 488 | BD Pharmingen | 560381 | |
| AO/PI Hücre Canlılık kiti | Biozym | 872045 | Biozym durduruldu. Logos Biosystems tarafından üretilen ürün. |
| Askorbik asit 2-fosfat sequimagnes | Sigma Aldrich | A8960-5G | |
| B27 Serum içermeyen 50x | Fisher Scientific (Gibco) | 11530536 | |
| Temel FGF çözeltisi | Fisher Scientific (Gibco) | 10647225 | |
| Biocoll | Merck Millipore | L6115-BC | yoğunluk gradyan ortamı |
| BSA Frac V %7,5 | Gibco | 15260037 | |
| CD45 MicroBeads | Miltenyi | 130-045-801 | nano boyutlu manyetik boncuklar |
| Hücre sayma slaytları Luna | Biozym | 872010 | Biozym durduruldu. Logos Biosystems tarafından üretilen ürün. |
| Oda Slaytları Lab-Tek | Fisher Scientific | 10234121 | |
| D-MEM/F12 | Merck Millipore | FG4815-BC | |
| Durcupan | Sigma Aldrich | 44610 | epoksi reçine |
| FBS | Merck Millipore | S0115/1030B | Durduruldu. Altında mevcut: TMS-013-B |
| GDNF rekombinant insan | Fisher Scientific (Gibco) | 10679963 | |
| GlutaMax 100x | Gibco | 35050038 | L-glutamin |
| Gluteraldehit sınıfı | Sigma-Aldrich | G5882-50ML | |
| Heparin sodyum hücresi | Sigma-Aldrich | H3149-50KU | |
| İnsan BDNF | Fisher Scientific (Gibco) | 11588836 | |
| Iscove (IMDM) | Biochrom | FG0465 | |
| Laminin fare | Fisher Scientific (Gibco) | 10267092 | |
| Kurşun sitrat | Sigma-Aldrich | 15326-25G | |
| Luna FL Otomatik Hücre Sayacı | Biozym | 872040 | Biozym durduruldu. Logos Biosystems tarafından üretilen ürün. |
| MACS Tampon | Miltenyi | 130-091-221 | |
| MEM NEAA 100x | Gibco | 11140035 | |
| MiniMACS Trenns & auml; ulen | Miltenyi | 130-042-201 | |
| Morada dijital kamera | Olympus | ||
| Multiplatte Nunclon 4 kuyu | Fisher Scientific | 10507591 | |
| N2 Takviyesi 100x | Fisher Scientific (Gibco) | 11520536 | |
| Nörobazal Orta | Gibco | 10888022 | |
| PBS steril | Roth | 9143.2 | |
| Poli-L-ornitin | Sigma-Aldrich | P4957-50ML | |
| Süper Yapıştırıcı-3 Loctite | Henkel | ||
| TEM FEI Technai G2 Spirit | FEI Europe | ||
| Ultracut UC-6 | Leica | ||
| Uranil asetat C | EMS | 22400 |
Kaynaklar
- Peng, J., Zeng, X. The Role of Induced Pluripotent Stem Cells in Regenerative Medicine: Neurodegenerative Diseases. Stem Cell Research and Therapy. 2 (4), 32(2011).
- Sorells, S. F., et al. Human hippocampal neurogenesis drops sharply in children to undetectable levels in adults. Nature. 555 (7696), 377-381 (2018).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblast by Defined Factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Liu, G. -H., Yi, F., Suzuki, K., Qu, J., Izpisua Belmonte, J. C. Induced neural stem cells: a new tool for studying neural development and neurological disorders. Cell Research. 22 (7), 1087-1091 (2012).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. Activation by ACA Induces Pluripotency in Human Blood Progenitor Cells. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 85-101 (2013).
- Marchenko, S., Flanagan, L. Immunocytochemistry: Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. , e267(2007).
- Becker-Kojić, Z. A., et al. A novel glycoprotein ACA is upstream regulator of human heamtopoiesis. Cell Technologies in Biology and Medicine. 2, 69-84 (2013).
- Li, D., et al. Neurochemical Regulation of the Expression and Function of Glial Fibrillary Acidic Protein in Astrocytes. Glial. 68 (5), 878-897 (2020).
- Melková, K., et al. Structure and Functions of Microtubule Associated Proteins Tau and MAP2c: Similarities and Differences. Biomolecules. 9 (3), 105(2019).
- Menezes, J. R., Luskin, M. B. Expression of neuron-specific tubulin defines a novel population in the proliferative layers of the developing telencephalon. Journal of Neuroscience. 14 (9), 5399-5416 (1994).
- Bernal, A., Arranz, L. Nestin-expressing progenitor cells: function, identity and therapeutic implications. Cellular and Molecular Life Sciences. 75 (12), 2177-2195 (2018).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
Daha fazla makale keşfet
