Yöntem makalesi

Kapak Bağımlı Çeviri Kinetiğinin Analizi için Bir In Vitro Tek Moleküllü Görüntüleme Tahlili

DOI:

10.3791/61648

⸱

15 Eylül 2020

 ,  , 
1Molecular Biology Program, Memorial Sloan Kettering Cancer Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bireysel çeviri olaylarını izlemek, kap bağımlı çeviri mekanizmalarının yüksek çözünürlüklü kinetik çalışmalarına izin verir. Burada floresan etiketli antikorlar ve epitop etiketli nascent peptitler arasındaki görüntüleme etkileşimlerine dayanan bir in vitro tek moleküllü test gösteriyoruz. Bu yöntem, aktif in vitro kap bağımlı çeviri sırasında başlatma ve peptit uzama kinetiğinin tek moleküllü karakterizasyonunu sağlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kap bağımlı protein sentezi ökaryotik hücrelerde baskın çeviri yoludur. Çeşitli biyokimyasal ve genetik yaklaşımlar, kap bağımlı çeviri ve düzenlemesinin kapsamlı çalışmalarına izin vermiş olsa da, bu çeviri yolunun yüksek çözünürlüklü kinetik karakterizasyonu hala eksiktir. Son zamanlarda, kap bağımlı çeviri kinetiğini tek molekül çözünürlüğü ile ölçmek için bir in vitro test geliştirdik. Test, floresan etiketli antikorun nascent epitop etiketli polipeptide bağlanmasına dayanmaktadır. Antikorların nascent peptid–ribozom-mRNA komplekslerine bağlanması ve ayrışması görüntülenerek, bireysel mRNA'lardaki çeviri ilerlemesi izlenebilir. Burada, mRNA ve PEGylated slayt preparatları, çevirinin gerçek zamanlı görüntülenmesi ve tek molekül yörüngelerinin analizi de dahil olmak üzere bu tahlilin oluşturulması için bir protokol sunuyoruz. Bu tahlil, kapak bağımlı çeviri olaylarının izlenmesini sağlar ve başlatma ve uzama oranları gibi anahtar çeviri kinetiğini çözümler. Test, farklı çeviri sistemlerine yaygın olarak uygulanabilir ve kap bağımlı çeviri kinetiği ve çeviri kontrol mekanizmalarının in vitro çalışmalarına geniş ölçüde fayda sağlamalıdır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ökaryotik sistemlerde çeviri ağırlıklı olarak 7-metilguanosin (m7G) kap bağımlı yollar1yoluyla gerçekleşir. Çalışmalar, ökaryotik çevirinin başlangıç adımının hız sınırlayıcı ve yönetmelik2, 3,4için ortak bir hedef olduğunu göstermektedir. Kapak bağımlı çeviri mekanizmaları genetik5, biyokimyasal6, 7 ,8,yapısal9ve genomik10 toplu yaklaşımlar kullanılarak kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. Bu yöntemler kap bağımlı başlatmayı düzenleyen çeşitli mekanizmalar tanımlamış olsa da, çözünürlükleri onları heterojen ve zaman uyumsuz başlatma olaylarından gelen sinyallerin ortalamasıyla sınırlar. Daha yakın zamanda, bireysel in vivo çeviri olayları, nascent polipeptidleri 11 , 12 , 13,14üzerindeki epitoplara floresan antikor bağlanmasını ölçen yöntemlerle görselleştirilmiştir. Bununla birlikte, bu yeni yaklaşımların bireysel başlatma olaylarını çözme yetenekleri de sınırlıdır, çünkü çoklu floresan antikorların, tek çeviri olaylarının yüksek hücre içi floresan arka plandan çözülmesine izin vermek için bir nascent peptid bağlaması gerekir. Birçok biyolojik etkileşimde, çözülen bireysel kinetik olaylar, moleküler düzeyde senkronize olması mümkün olmayan karmaşık çok noktalı ve tekrarlayan biyolojik süreçleri anlamak için kritik içgörüler sağlamıştır. Kap'a bağımlı başlatma ve düzenlemenin daha iyi anlaşılması için bireysel çeviri olaylarının dinamiklerini izleyebilecek yeni yöntemlere ihtiyaç vardır.

Yakın zamanda tek moleküllü çözünürlük15ile kap bağımlı başlatma kinetiğini ölçen bir in vitro test geliştirdik. Bu başlangıç yolu3,16'da yer alan çok sayıda bilinen ve bilinmeyen protein faktörü göz önünealındığında,tek moleküllü test, hücresel faktörlerin korunmasından ve sağlam çeviri aktivitesinden yararlanmak için mevcut in vitro hücresiz çeviri sistemleriyle uyumlu olacak şekilde geliştirilmiştir17,18,19,20,21,22,23,24,25. Ayrıca, hücresiz çeviri sistemlerinin kullanımı, tek moleküllü gözlemler ve önceki toplu sonuçlar arasında daha uyumlu karşılaştırmalar sağlar. Bu yaklaşım, yeni tek moleküllü kinetik içgörülerin, kap bağımlı başlatmanın mevcut mekanistik çerçevesine doğrudan entegrasyonunu sağlar. Tek moleküllü tahlil oluşturmak için, geleneksel hücresiz çeviri sistemi üç şekilde değiştirilir: bir muhabir mRNA'nın açık okuma çerçevesinin (ORF) başına bir epitop kodlama dizisi eklenir; muhabir mRNA'nın 3′ ucu, mRNA'nın tek moleküllü algılama yüzeyine uç bağlamasını kolaylaştırmak için biyotinillenmiştir; ve floresan etiketli antikorlar çeviri özüne desteklenir. Bu değişiklikler sadece temel moleküler biyoloji tekniklerini ve yaygın olarak bulunan reaktifleri gerektirir. Ayrıca, bu değişiklikler ve tek moleküllü görüntüleme koşulları, toplu hücre içermeyen çeviri reaksiyonlarının çeviri kinetiğini korur15.

Bu tahlilde (Şekil 1), 5′-end kapaklı ve 3′-uç biyotiniled muhabir mRNA bir akış odasında streptavidin kaplı bir algılama yüzeyine hareketsiz hale getirilir. Akış odası daha sonra floresan etiketli antikorlarla desteklenmiş hücresiz bir çeviri karışımı ile doldurulur. MRNA çevirisi epitop dizisi 26 , 27'nin aşağı akışında yaklaşık30-40kodon meydana geldiktensonra,epitop ribozom çıkış tünelinden çıkar ve floresan etiketli antikorla etkileşime girmek için erişilebilir hale gelir. Bu etkileşim hızlıdır ve tek moleküllü floresan görüntüleme teknikleri ile algılanmasını, aktif hücresiz çeviri sırasında tek moleküllü çözünürlükle çeviri kinetiğinin izlenmesini sağlar. Bu tahlil, özellikle çalışan toplu in vitro teste sahip sistemler için, kap bağımlı çeviri kinetiğinin in vitro çalışmalarına ve düzenlenmesine geniş ölçüde fayda sağlamalıdır.

Bu tek moleküllü tahlilin kurulmasının bir ön koşulu, ticari olarak mevcut olan veya daha önce açıklanan yöntemleri izleyerek hazırlanan çeviri özü kullanılarak elde edilebilen çalışan bir toplu hücre içermeyen çeviri tahlilidir28. Ökaryotik çeviri özü mantar, memeli ve bitki28dahil olmak üzere çeşitli hücrelerden elde edilebilir. Görüntüleme için, bu test ayarlanabilir lazer yoğunluğu ve olay açısı ile donatılmış bir TIRF mikroskobu, motorlu bir numune aşaması, motorlu akışkanlar sistemi ve numune sıcaklık kontrol cihazı gerektirir. Bu gereksinimler modern in vitro tek moleküllü TIRF deneyleri için geneldir ve farklı şekilde elde edilebilir. Burada sunulan deney, malzeme tablosundalistelenen ticari olarak kullanılabilen mikroskop, yazılım ve aksesuarlardan oluşan objektif tip bir TIRF sistemi kullanır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Muhabir mRNA'nın nesli

  1. "Etiketli" bir muhabir mRNA için DNA transkripsiyon şablonu oluşturmak için bir N-terminus epitope etiket kodlama dizisi ekleyerek toplu test "etiketsiz" muhabir mRNA'yı kodlayan bir DNA transkripsiyon şablonunu değiştirin (Şekil 2A).
    NOT: Üstün hassasiyeti ve kısa 3xFLAG etiket uzunluğu nedeniyle bu test için 3xFLAG/bayrak karşıtı etkileşim önerilir. Bununla birlikte, test diğer epitop /antikor çiftleri ile uyumludur.
  2. Doğrusallaştırılmış DNA şablonları ve in vitro transkripsiyon kiti kullanarak etiketlenmemiş ve etiketli RNA'ları sentezleyin (bkz. Malzeme Tablosu). Tipik olarak, 10-20 pmol in vitro transkript RNA, sistematik bir tek moleküllü çalışmaya izin vermek için sonraki RNA işleme için yeterlidir.
  3. Üreticinin tavsiyesine uyarak RNA 5′ ucini (Şekil 2B) bir m7G kapak kiti (bkz. Malzeme Tablosu)ile kapla.
  4. RNA 3′ ucu (Şekil 2B) ile sağlanan protokole göre bir biyotinilasyon kiti kullanarak biyotinilasyon kiti (bkz. Malzeme Tablosu). RNA'ları fenol-kloroform ekstraksiyonu ile saflaştırın ve ardından bir spin sütunu ile saflaştırın. 10-20 μL RNase içermeyen suda Elute RNA. Kırılmamış giriş RNA'sının yaklaşık %40-50'si kurtarılır.
  5. Daha önce açıklandığı gibi akrilamid jel elektroforezi ve RNA boyama denatüre ederek RNA bütünlüğünü ve konsantrasyonu değerlendirin29.
  6. Modifiye mRNA'nın ilgi çekici çeviri özelliklerini koruduğunu onaylamak için 3′-end-biotinylated etiketli muhabir mRNA ile toplu hücresiz çeviri30 gerçekleştirin. Örnek olarak, kapak bağımlı çeviri, toplu hücresiz çeviri tepkilerindeki muhabir faaliyetlerinin uncapped ve capped reporter mRNA'ları ile ölçülüp karşılaştırılarak doğrulanabilir (bkz. Temsili Sonuçlar).

2. Akış odası hazırlığı

  1. Mikroskop nesnel belirtimi sayfasında belirtildiği gibi uygun bir kapak kılıf kalınlığı seçin. Sırasıyla objektif veya prizma tipi toplam iç yansıma floresan (TIRF) görüntüleme sistemleri31için bir cam veya kuvars slayt seçin.
  2. Aşağıdaki değişikliklerle Chandradoss ve ark.32 tarafından açıklanan protokolü izleyerek kapak ve slaytın temizlik, tuzlulaştırma, pegylation ve oda montajını gerçekleştirin.
    1. %10 alkali sıvı deterjanda (v/v) delinmiş delikler içeren slaytları sonikasyonla 20 dakika boyunca yıkayın. Kalan tüm temizleme adımları için slaytları ve kapakları birleştirin.
    2. Aseton yıkama adımını atlayın. Piranha gravür inkübasyon süresini 20 dakikadan 1 saate uzatın. İlk tur PEGylation'ı 3 saat kuluçkaya yatırın. İkinci tur PEGylation'ı MS(PEG)4 ile 3 saat kuluçkaya yatırın.

3. Ekipman hazırlama

  1. Tek moleküllü bir deney yapmadan önce en az 3 saat, mikroskop inkübatörüyü açın ve deneylerin aşırı akustik bozulmasını önlemek için hava akışını düşük bir hıza düşürün. İnkübatör sıcaklığını hücresiz çeviri sistemi için en uygun sıcaklığa ayarlayın.
    NOT: Çeviri sıcaklığa karşı son derece hassastır. En uygun reaksiyon sıcaklığı her hücre ekstrakt sistemi için özeldir. Reaksiyon sıcaklığı karakterizasyonu, toplu hücresiz çeviri sisteminin geliştirilmesinde hayati bir adımdır. Bu tek moleküllü test, ilgili toplu çeviri koşuluyla aynı optimum sıcaklıkta yapılmalıdır.
  2. Tek moleküllü bir deney yapmadan önce en az 1 saat önce lazer kutusunun arkasındaki lazer güç düğmesine basarak lazeri açın, lazer güvenlik tuşunu çevirin ve başlat düğmesine basın; mikroskobu açın ve görüntüleme modunu, hedef ve filtre kümesini seçmek için dokunmatik ekran kontrol paneline dokunun.
  3. EMCCD kamerayı, Önceki sahne kumandasını ve şırınna pompasını güç düğmelerine basarak açın. EMCCD kamerayı kontrol etmek için bilgisayarı açın andor Solis (yazılım 1), lazeri kontrol etmek için TirfCtrl (yazılım 2), motorlu sahneyi kontrol etmek için PriorTest (yazılım 3) ve şırıngar pompasını kontrol etmek için Coolterm. Veri toplama başlamadan önce kameranın kendi belirlediği çalışma sıcaklığına soğumasını ve stabilize olmasını bekleyin.
  4. Yazılım 2'de, lazer dalga boyu, nesnel tip ve kırılma indeksi cam ve numune için doğru parametrelerin ayarlı olduğunu onaylayın. Bağlan düğmesini tıklatın. Lazer yoğunluğunu ayarlamak için lazer dalga boylarının yanındaki Kontrol düğmesini tıklatın, sonra lazer kontrolü açılır penceresinde yoğunluk slayt çubuğunu sürükleyin. Fiber konum slayt çubuğunu sürükleyerek veya ilgili penetrasyon derinliğini girerek lazeri istediğiniz açıya ayarlayın. Görüntüleme olmadığında lazeri Kapalı modda tutmak için Deklanşör kutusunun işaretlendiğinden emin olun.
    NOT: Deklanşör kutusunu işaretleyerek lazer deklanşörü açın ve kapatın. Test başlangıçta kurulurken, optimum tek molekül tespiti için farklı lazer yoğunlukları ve olay açıları test edilmelidir. Optimum lazer yoğunluğu, parlak tek moleküllü floresan ve floroforların hızlı fotobleachingini dengeler. Olay açısı, mRNA'ya bağlı antikorlar net bir şekilde çözülene kadar difüzör etiketli antikorlardan yüksek floresan arka planı azaltmak için kritik açının ötesine artırılmalıdır. Referans olarak, 532 nm lazer, antikor başına 2-7 boya etiketleme oranına sahip Cy3 etiketli anti-FLAG kullanılarak yapılan bir çalışmada71,5° olarak ayarlanmış lazer olay açısı ile hedefte 10 μW'a ayarlandı.
  5. Yazılım 1'de, Alma Modualtında Kinetik 'i seçin, pozlama süresi, kinetik seri uzunluğu ve EM kazanç değeri parametrelerini girin. Dizini seçin ve veri yansıma dosyasını kaydetmek için dosya adları atayın.
  6. Şırınna pompasını, sonraki boru yıkama adımı için mütevazı ve hızlı debiye ayarlayın.
    Pipet bir mikrofuge tüpüne% 70 etanol bir aliquot, etanol çözeltisine şırınga pompası boru ucunu yerleştirin ve boruyu yıkamak için şırınga pompasını çekme ve dağıtma modları arasında üç kez geçirmek için Coolterm'i kullanın. RNase içermeyen su kullanarak tekrarlayın.
    NOT: Boru uzunluğu, çeviri karışımının şırınna değil, sadece boruya temas etmesi için 5. Buradaki durulama hacmi, adım 5'teki çeviri karışımının sterilize edilmiş borularla temas halinde kalmasını sağlamak için dağıtılmış çeviri karışımının hacminden daha büyük olmalıdır.
  7. Son su durulama yapıldıktan sonra, boru ucunu temiz bir doku silme işlemine dabbing yaparak borunun içinden kalan suyu çıkarın. Boru ucunu temiz bir mikroyakıt tüpüne ayarlayarak kurutun.

4. 3′-end biyotinillenmiş mRNA'nın hareketsizleştirilmesi

  1. Hücre özü ve çeviri karışımını kuru buz üzerinde kullanımdan hemen önceye kadar saklayın. Kalan donmuş reaktifleri çözün ve buzda muhafaza edin.
  2. Akış odasını kapak tarafı aşağı bakacak şekilde mikroskop numune tutucusuna yerleştirin ve bantla yerine sabitleyin. Kullanılmayan akış kanallarının giriş ve çıkışlarını kapatmak için teyp kullanın.
  3. Pipet 1,5x hacim (kanal hacmine göre; adım 4 ve adım 5'teki diğer adımlar için de geçerlidir) 0,2 mg/ mL streptavidin akış kanalına ve oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yaslayın.
  4. İlişkisiz streptavidin çıkarmak için, kanalı yıkama başına 3x hacimli T50 yıkama tamponunda (20 mM Tris HCl, pH 7.0, 50 mM NaCl, 0.2 U/μL RNaz inhibitör reaktifi) pipetleme ile üç kez yıkayın.
    NOT: Sıvı atıkların kanala geri akmasını önlemek önemlidir. Akış kanalının çıkışı bir atık toplama tüpüne bağlı değilse, kanaldan akan sıvıyı emmek için çıkışın yanına katlanmış bir kağıt mendil yerleştirin.
  5. Çeviri ekstresini aktarın ve kuru buzdan buza karıştırın ve çözülmelerine izin verin.
  6. Hedefe bir damla daldırma yağı koyun. Akış odası ile mikroskop numune tutucusuna mikroskop aşamasına yerleştirin. Nesnel bağlantılarda daldırma yağı kapak kapağına temas edene kadar hedefi kapak kapağına yaklaştırın. Akış kanalının konumu doğrudan objektif lensin üzerinde olacak şekilde örnek aşamayı hareket ettinin.
  7. Yazılım 2'de lazer deklanşörini açın ve lazer yoğunluk seviyesini ayarlayın.
  8. Mikroskop kontrolü dokunmatik ekranında, Netleme sekmesini seçin ve Odak Arama ve Başlat düğmesini tıklatın. Bir odak düzlemi başarıyla elde edildiğinde bir bip sesi duyulur.
  9. Yazılım 1'de akış kanalı yüzeyini Canlı modda görüntüleyin. Dokunmatik ekrandaki ince adım kontrolüyle objektif konumu ayarlayarak odağı daha keskin bir görüntü için optimize edin.
  10. Yazılım 3'te, akış kanalı algılama yüzeyinin çeşitli alanlarında floresan arka plan düzeyini değerlendirmek için sahne alanını hareket ettinin. Floresan düşükse, deneye devam edin. Floresan arka planı aşırı yüksekse, akış kanalını atmayı düşünün.
  11. Yazılım 2'de lazer deklanşöre kapatın.
  12. T50 yıkama tamponu akış kanalından pipet ve hemen pipet akış kanalına biyotinillenmiş mRNA çözeltisinin 2x hacminde. 15 dakika kuluçkaya yaslanın.
    NOT: Her bir mRNA hazırlama grubu için, tek moleküllü algılama için gerekli mRNA yüzey yoğunluğunu elde etmek için mRNA konsantrasyonları ve kuluçka süreleri test edilmelidir. Uygun mRNA yüzey yoğunluğu, ~%5'ten fazla örtüş olmayan floresan lekeler gösteren antikor bağlamasına aracılık eder (bkz. Temsili Sonuçlar). Başlangıç noktası olarak, 2-20 nM konsantrasyonda biyotinillenmiş mRNA önerilir.
  13. Yıkama başına 3x hacimli çeviri uyumlu arabellek pipetleme yaparak kanalı üç kez yıkayın.

5. Tek molekül tespiti için çeviri karışımı montajı ve bir akış kanalına teslimi

  1. Buzda, mRNA'yı atlamak ve floresan etiketli antikorların optimize edilmiş konsantrasyonu ile takviye dışında, 1.7 adımından toplu çeviri protokolünü izleyerek çeviri karışımının3x hacmini bir mikrosantrifüj tüpünde birleştirin. Çeviri karışımını tüpün dibinde toplamak için mikrosantrifüj tüpünü kısaca döndürün.
    NOT: Tahlil kurulurken farklı antikor konsantrasyonları test edilir. Optimal konsantrasyon, algılama yüzeyine düşük miktarda nonspesifik antikor bağlama ve nascent peptide hızlı antikor bağlama gösterir (tahlil kalibrasyon ayrıntıları için sırasıyla 7.1. ve 7.2. adımlara bakın).
  2. Çeviri karışımını 0,7 mL mikrobuge tüp kapağının içine aktarın. Şırınd pompasını çekme moduna ayarlayın. Pompa boru ucunu çeviri karışımına yerleştirin. Çeviri karışımını pompa tüpüne toplamak için şırınna çekmeyi başlatın. Şırınd pompası ayarını dağıtım moduna ters çevirin ve akışı çeviri karışımı teslimatı için en uygun fiyata ayarlayın.
    NOT: Pompa tüpüne aktarırken çeviri karışımında kabarcıklar oluşturmaktan kaçının. Çeviri karışımını borunun 3.6 adımında sterilize edilmemiş ve durulamamış kısmına çok derine çekmekten kaçının. Testi kurarken, en uygun oranı belirlemek için farklı teslimat akış hızları test edilir (tahlil kalibrasyonu ile ilgili ayrıntılar için adım 6.2'ye bakın).
  3. Boru ucu ve çeviri karışımı arasında bir boşluk varsa, şırınna pompasını başlatın ve çeviri karışımının boru ucuna ulaşmasına izin verin, ardından şırınna pompasını durdurun.
  4. Pompa boru ucunu akış kanalının girişine yerleştirin. Bağlantıyı gerçekleştirirken çeviri karışımına hava kabarcıkları sokmaktan kaçının. Özel yapım metal braketi mikroskop numune tutucu plakasına vidalayarak bağlantıyı stabilize edin. Mikroskop odağını ve görüntüleme alanı floresanını değerlendirin.
    NOT: Boru, daha önce açıklandığı gibi özel bir parça ile akış odasına sıkıştırılabilir33. Bu test için diğer akışkan sistemleri de kullanılabilir34. Görüş alanı, boruyu bağlamadan önce ve bağladıktan sonra benzer görünmelidir. Bağlantıdan sonra daha fazla floresan leke ortaya çıkarsa, çeviri karışımı muhtemelen teslimat tüpünden sızıyor olabilir. Uygulamaya bağlı olarak, sızan çeviri karışımına sahip kanalın atılması gerekebilir.
  5. Film alma parametrelerinin doğru olduğunu ve dosyaları kaydetmek için uygun dosya adının ve dizininin girildiğini onaylayın.
  6. Akış kanalı algılama yüzeyinin ortasındaki bir alanı görüntüleyemek için sahne alanını hareket ettinin. Mikroskop kontrolü dokunmatik ekranında, Sürekli AF sekmesini seçin ve deneme sırasında odak konumunu korumak için Odak Arama ve Başlat düğmesini tıklatın. Bir odak düzlemi başarıyla elde edildiğinde bir bip sesi duyulur.
  7. Yazılım 2'de lazer deklanşöre açın. Yazılım 1'de, kaydetmeye başlamak için Sinyal Al düğmesini tıklatın. Yaklaşık 5 s kayıt olduktan sonra, çeviri karışımını akış kanalına teslim etmek için Coolterm'deki Çalıştır komutunu girin. 0,5–2 s/kare zaman çözünürlüğü ile 2 saate kadar kayıt.
    NOT: Veri toplamanın maksimum süresi, çeviri ekstresinin zaman içinde aktiviteyi ne kadar hızlı kaybettiğine bağlıdır, bu da luciferaz reporter mRNA ile toplu hücre içermeyen çeviri yapmak ve farklı zaman noktalarındaki çeviri reaksiyonlarında luciferaz aktivitesini ölçmekle rahatça karakterize edilebilir35.
  8. Veri toplama tamamlandığında, lazeri kapatın, mikroskop kontrol dokunmatik ekranındaki Sürekli AF'yi kapatın ve boruyu akış odasından sökün.
  9. Çeviri karışımını akış kanalı girişinden pipetleyin, bir mikrofuge tüpüne aktarın ve tüpü sıvı nitrojene yerleştirerek çözeltiyi çıtlatın. Daha sonra -80 °C'de saklayın.
  10. Şırınna pompası borularını RNase içermeyen suyla üç kez, ardından% 70 etanol ile üç kez yıkayın. Depolama için şırınna pompası tüpüne% 70 etanol çekin.
  11. Mikroskobu ve tüm aksesuarları kapatın. Temizlemek.

6. Veri analizi

NOT: Bu test için veri analizi, tek moleküllü biyofiziksel çalışmalarda yaygın yöntemler gerektirir. Hesaplama açısından yoğun tüm adımlar mevcut algoritmalar ve yazılımlar kullanılarak elde edilebilir (referanslar aşağıda ilgili adımlarında yer almaktadır).

  1. İsteğe bağlı: Varsa, alınan görüntü serisi dosyasını seçilen görüntü işleme yazılımı veya programlama diliyle uyumlu bir biçime dönüştürün.
  2. Çeviri reaksiyon başlangıç noktasını ve reaktif değişim süresini belirleyin.
    NOT: Çeviri karışımındaki floresan antikorların yayılması nedeniyle, çeviri uyumlu tampondan çeviri karışımına kanal içi reaktif değişimi sırasında görüntülenmiş bir alanın arka plan floresan yoğunluğu artacaktır. Çeviri reaksiyon başlangıç noktası, reaktif değişiminin tamamlanmış olduğu zaman noktası olarak ayarlanır. Bu tamamlama noktası, çeviri karışımı teslimatı sırasında arka plan floresan yoğunluğunun ölçülmesi ve artan floresan yoğunluğu platolarının15, aşağıda açıklandığı gibi zaman noktasını belirleyerek bulunur.
    1. Görüntü çerçevesi başına toplam floresan sayısını hesaplayın ve ilgili zaman profilini çizin. Zaman profili çiziminde toplam floresandaki ani artışı tanımlayın.
      NOT: Toplam floresan artışı, reaktif değişimi sırasında floresan etiketli antikor konsantrasyonunun artmasından kaynaklanmaktadır.
    2. Toplam floresan artış aşamasının bitiş noktasını tanımlayın ve bu zaman noktasını çeviri reaksiyonunun başlangıç noktası (yani zaman 0) olarak ayarlayın. Toplam floresan artış aşamasının hem başlangıç hem de bitiş noktalarını tanımlayın ve zaman farkını reaktif değişim süresi olarak ayarlayın.
      NOT: Reaktif değişiminin toplam zaman aralığı akış kanalı boyutlarına ve seçilen akış hızına bağlıdır. Reaktif değişimi tamamlanmadan önce bazı çeviri faktörlerinin mRNA'ya bağlanmaya başlaması mümkündür, bu da belirlenen ilk tur başlatma süresinin çözünürlüğünü azaltabilir. Bu nedenle, 0,5–2 s/kare veri toplama hızları için 3–4 s içinde reaktif değişiminin tamamlanmasına izin veren test ve akış hızlarını seçerken farklı akış hızlarının test etmesi önerilir.
  3. İsteğe bağlı: Film sürüklenme düzeltmesi gerçekleştirin.
    NOT: Mikroskop parçalarının ve aksesuarlarının sürüklenmesi nedeniyle veri görüntüsündeki bağlı antikorların konumları zamanla değişebilir. Bir filmde görsel olarak fark edilen sürüklenme, veri analizine devam etmeden önce düzeltme gerektirir. Çeşitli uzamsal sürüklenme düzeltme algoritmaları ve komut dosyaları mevcuttur36,37,38.
    1. Her görüntüde, her karedeki bağlı antikorların konumlarını piksel düzeyinde doğrulukla belirlemek için piksel sayılarındaki yerel maxima'yı bulun. Piksel sayısı için yalnızca arka plan gürültüsünün üzerinde açıkça görünen noktalar seçilecek şekilde bir eşik ayarlayın.
    2. Ardışık iki görüntü çerçevesi arasındaki her yöndeki bireysel antikor konumlarının değişikliklerini hesaplayın.
    3. Ardışık iki kare arasında antikor konum değişiklikleri histogramını çizin ve bunu her yön için ayrı ayrı yapın. Gauss her histograma uyar ve tepelerin merkez konumunu ardışık iki kare arasında yön kayması olarak ayarlar.
    4. Gözlemlenen sürüklenmeyi önlemek için, her görüntü karesini hesaplanan sürüklenme miktarına göre ters yönde kaydırın.
  4. Tek moleküllü yörüngeler oluşturun.
    NOT: Parlak noktaları tanımlamak ve yoğunluklarını veri görüntü serisi39,40'tançıkarmak için algılama / izleme yazılımı mevcuttur.
    1. Adım 6.3.1'de açıklandığı gibi antikor pozisyonlarını tanımlayın.
      NOT: Seçilen eşiğin parçacıkların aşırı aşırı veya az toplanmasına yol açmamasını sağlamak için görsel inceleme önerilir. Görsel inceleme, tanımlanan centroid konumlarının her görüntü çerçevesinin üzerine bindirilmesi ve sözleşmelerinin görsel olarak değerlendirilmesi ile elde edilebilir (bkz. Temsili Sonuçlar).
    2. Tüm çerçevelerden toplanan parçacıkları birleştirin ve gereksiz parçacık konumlarını çıkarın.
    3. Bağlı antikorların görüntülerini görsel olarak inceleyin ve pikselleri arka planın üzerinde ve ayrı ayrı bağlı antikorun temsilcisi olan sayımlarla kaplayan kare bir alan seçin.
      NOT: Nokta yayma işlevi (yani, tek bir molekül için karenin boyutu) optik kurulum ve dedektör piksel boyutu ile belirlenir.
    4. Her parçacık konumu için, parçacık konumunun etrafındaki kare alandaki tüm piksellerin toplam yoğunluğunu hesaplayarak tek moleküllü bir yörünge oluşturun. Yörüngeler her konum, kare kare ve tüm veri filmi için oluşturulur.
  5. İsteğe bağlı: Tek moleküllü yörüngelerde arka plan gürültüsünü azaltmak için doğrusal olmayan bir ileri-geri filtresi41 uygulayın.
  6. İsteğe bağlı: Mevcut adım algılama algoritmaları42 , 43,44,45ile yörüngeleri dijitalleştirin.
    NOT: Adım algılama algoritmasının seçimi, tek moleküllü dinamiklerin karmaşıklığına bağlıdır. Sadece izole ribozom çevirisinin en basit senaryosu (yani polisome oluşumu yok) ve gürültü oranına iyi sinyal için, tek moleküllü yörüngelerde antikor bağlama ve ayrışma olaylarının zamanlamasını belirlemek için floresan sayılarına bir eşik uygulaması yeterlidir. Yörünge adımlarının bir adım algılama stratejisi tarafından uygun şekilde seçildiğinden emin olmak için her koşul için en az 100 yörüngenin görsel olarak incelenmesi önerilir.
  7. Dijitalleştirilmiş yörüngeler kullanarak veya düzensiz yörüngelere bir eşik uygulayarak, her yörünge için ilk antikor bağlama olayının zamanını belirleyin (yani, ilk varış saati, t1).
    NOT: İlk varış saati dağılımının ortanca değeri farklı çeviri koşulları arasında karşılaştırılabilir. Alternatif olarak, ilk varış saati dağılımı, ortalama değer 15 <t1>belirlemek için kaydırılmış(3 parametreli) günlük normal işlevine takılabilir. İlk varış saati dağılımı genellikle eğriltilmiş ve uzun bir kuyruğa sahip olduğundan, gözlemlenen ilk varış zamanları üzerinden doğrudan ortalama alarak ortalamayı hesaplamayın.
  8. İsteğe bağlı: Ortalama peptit sentez oranının süresi analizi ve hesaplanması.
    1. Her yörüngede monozomlu (tek ribozom) çeviri olaylarını tanımlamak ve tek bağlama olay bekleme sürelerini karşılık gelen antikor bağlama ve ayrışma olayları arasındaki zaman farkı olarak hesaplamak için dijitalleştirilmiş yörüngeleri kullanın.
      NOT: Yörüngeleri dijitalleştirmek için adım algılama algoritmaları, birden fazla moleküler olay zamanla çakıştığında genellikle daha az güvenilirdir. Bu nedenle, polizom olaylarının durma süresi analizinden hariç tutulması önerilir. Polizom olaylarla zenginleştirilmiş ve nadiren monozomlu olaylar gösteren son derece aktif çeviri sistemleri için, tek moleküllü yörüngelerde izole çeviri olaylarını gözlemleme şansını artırmak için etiketli ve etiketsiz antikorların bir karışımı kullanılabilir.
    2. Dağılımı günlük normal işlevine sığdırın ve ortalama oturma süresini hesaplamak için takılı işlevi kullanın.
      NOT: Bekleme süresi dağılımları genellikle uzun kuyruklarla eğriltildiği için, ortalamanın doğrudan gözlemlenen bekleme sürelerinin ortalamasını alarak hesaplanması önerilmez.
    3. Toplam ORF kodon sayısından epitop amino asit uzunluğunun toplamını ve 35'ini (ribozom çıkış tüneli içindeki nascent peptidin ortalama amino asit uzunluğu) çıkararak antikor bağlama uzunluk süresi boyunca çevrilen amino asitlerin sayısını belirleyin.
    4. Ortalama peptit sentez oranını belirlemek için, çevrilen amino asitlerin sayısını ortalama durma süresine bölün.
  9. İsteğe bağlı: Ortalama ilk tur başlatma süresinin hesaplanması (<t1_I>).
    NOT: Başlatma yeri sırası bağlamı ve kodlama sırası gibi başlatma ve uzama koşulları, başlatma kinetiği çalışmaları için genellikle kasıtlı olarak korunur. Bu nedenle, adım6.7'denitibaren ortalama ilk varış saati <t1 > . farklı koşullar arasındaki ilk tur başlatma kinetiğindeki değişimi hesaplamak için doğrudan kullanılabilir. Aşağıdaki düzeltme yalnızca ilk tur başlatma süresinin gerçek değerini belirlemek için gereklidir.
    1. Bu N-terminal bölgesinin ortalama peptit uzama süresini hesaplamak için epitop uzunluğunun toplamını ve 35'i (ribozom çıkış tüneli içindeki nascent peptid'in ortalama amino asit uzunluğu) ortalama peptit sentez hızına (adım 6.8.4.) bölün (<t1_tag>).
    2. İlk varış saati ilk tur başlatma süresi ve t1_tagtoplamı olduğundan, ortalama ilk varış saatinden <t1_tag> çıkarın <t1> ortalama ilk tur başlatma süresini hesaplamak için <t1_I>: <t1_I> = <t1> - <t1_tag> >

7. Tahlil kalibrasyonu

NOT: Tahlil ilk kurulurken aşağıdaki kalibrasyon adımlarını uygulayın.

  1. Antikor bağlama özgüllüğünü incelemek için, etiketlenmemiş ve etiketli mRNA'lar için 4 ve 5 bölümlerindeki protokol adımlarını ayrı ayrı gerçekleştirin (Şekil 2). Bu ilgili mRNA'lara sahip kanallardaki antikor bağlama düzeyleri, algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlanmasının ve nascent peptide özgül antikor bağlanmasının kapsamını temsil eder.
    NOT: Spesifik olmayan bağlama oranının >10 olması önerilir ve farklı yüzey pasivasyon stratejileri, daha düşük antikor konsantrasyonu veya daha yüksek mRNA yüzey yoğunluğu ile arttırılabilir.
  2. Antikor bağlama oranını ölçmek için, protokolü adım 4 ile adım 5 arasında ekstra bir adımla gerçekleştirin.
    1. 4. adımdan sonra, kanalı önceden mRNA/ribozom/peptit kompleksleri oluşturmak için antikordan yoksun çeviri karışımı ile kuluçkaya yatırın.
    2. Ardından 5.
    3. önceden oluşturulmuş nascent peptide karşı ortalama antikor bağlama oranını ilk varış zamanı histogramına üstel montaj ile ölçün.
      NOT: Önceden oluşturulmuş peptide antikor bağlanması saniyeler sırasına göre hızlı olmalı ve çeviri kinetiğinden daha hızlı olmalıdır. Antikor bağlama oranını artırmak için daha yüksek bir antikor konsantrasyonu kullanılabilir.
  3. Florofor etiketli antikorun fotostability.
    1. Adım 2'deki protokole göre bir slayt hazırlayın, ancak PEGylation adımını atlayın. Salinizasyon adımından sonra akış odasını birleştirin. Silane kaplama, algılama yüzeyine verimli spesifik olmayan antikor bağlanmasına izin verir.
    2. Algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlamanın tek moleküllü yoğunluğunu elde etmek için floresan etiketli antikorları kanala ekleyin. T50 yıkama tamponunda yüksek oranda seyreltilmiş floresan etiketli antikor ekleyerek başlayın ve istenen tek molekül yoğunluğu elde edilene kadar antikor konsantrasyonu kademeli olarak artırın.
    3. Antikor floresanının çoğu artık tespit edilemeyene kadar algılama yüzeyini görüntüleyin.
    4. Florofor fotobleachinge bağlı antikor floresan kaybı oranını değerlendirmek için zaman içinde toplam görünür antikor sayısını çizin.
      NOT: Antikor etiketlemesi tipik olarak antikor başına birden fazla florofor verir. Tüm konjuge floroforlar fotobleach olana kadar bireysel antikorlar tespit edilebilir kalır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan protokolün ardından, 3' son bağlı muhabir mRNA'nın aktif hücresiz çevirisi sırasında tek molekül çözünürlüğü ile nascent N-terminal etiketli polipeptitlerle bireysel antikor etkileşimlerinin görüntülenmesini sağlar (Şekil 1). Üç sentetik mRNA'nın kullanımıyla minimum bir gösteri deneyi rapor edilir: LUC (etiketlenmemiş lucifeaz kodlama), LUCFLAG (3xFLAG etiketli lucifease kodlaması) ve hp-LUCFLAG (5' lider ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tipik in vitro TIRF tek moleküllü deneylere kıyasla, burada açıklanan test ile tek moleküllü görüntüleme, hücre ekstresi ve floresan etiketli antikorun yüksek konsantrasyonu nedeniyle ek olarak karmaşıktır. Bir tur yüzey PEGylation'ın daha yaygın uygulaması ile karşılaştırıldığında, ikinci bir PEGylation turu (adım 2), algılama yüzeyine spesifik olmayan antikor bağlanmasını büyük ölçüde azaltır15. Difüzör floresan antikorların yüksek konsantrasyonu, antikor bağlamanın tek moleküllü algıla...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri [R01GM121847] tarafından desteklendi; Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi (MSKCC) Destek Hibesi/Çekirdek Hibesi (P30 CA008748); ve MSKCC Fonksiyonel Genomik İnisiyatifi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
100X yağ hedefi, NA 1.49OlympusUAPON 100XOTIRF
Akriyamid/bis (%40, 19:1)Bio-Rad161-0144
Alkali sıvı deterjanDecon5332
Aminosilan (N- (2-Aminoetil) -3-Aminopropiltrimetoksisilan)UCT Spesiyaliteleri, LLCA0700
Andor ixon Ultra DU 897V EMCCDAndorDU-897U-CSO-#BV
Andor Solis yazılımıAndorEMCCD'yi kontrol etmek için
Bant geçiren filtreChroma532/640/25
Bant geçiren filtreChromaNF03-405/488/532/635E-25
Biotin-PEG-SVALaysan Bio IncBiotin-PEG-SVA
Koenzim A serbest asitProlume309-250
Coolterm yazılımıŞırınga pompasını kontrol etmek için
Masaüstü bilgisayarDellMikroskobu, kamerayı, sahneyi ve pompayı kontrol etmek için.
Dikroik aynaSemrockR405/488/532/635
Direct-zol RNA microprep 50RNXFisher ScientificNC1139450
Çift Lusiferaz Raportör Test SistemiPromegaE1910
Epoksi Devcon14250
Ateşböceği lusiferin D-Luciferin serbest asitProlume306-250
Buzlu asetik asitFisher ScientificBP1185500
Hidrojen perioksitSigma-Aldrich216763-500ML
Daldırma yağıOlympusZ-81226ADüşük otomatik floresan
Lusiferaz Test SistemiPromegaE1500
MEGASCRIPT T7 Transkripsiyon KitiThermo fisherAM1334
MetanolFisher BilimselMMX04751
MikroskobuOlympusIX83
Mikroskop lamıThermo Scientific3048
Monoklonal anti-FLAG M2-Cy3Sigma-AldrichA9594
mPEG-SVALaysan Bio IncmPEG-SVA-5000
MS(PEG)4Thermo Scientific22341
NaCl (5M)Thermo ScientificAM9760G
No 1.5 mikroskop Kapak camıFisherband12-544-C
Olympus Lazer, 532nm 100mMOlympus dijital Lazer sistemiCMR-LAS 532nm 100mW
Olympus TirfCtrl yazılımıOlympusLazer yoğunluğunu ve geliş açısını kontrol etmek için
Optik tabloTMC titreşim kontrolü63-563Titreşim izolasyonlu
Fenol kloroform izoamil alkol karışımıSigma-Aldrich77617-100ml
Pierce RNA 3 'Uç Biyotinilasyon KitiThermo Scientific20160
Potasyum hidroksit peletleriSigma-AldrichP1767-500G
Önceki motorlu XY çeviri aşamasıÖncekiPS3J100
Önceki PriorTest yazılımıÖncekimotorlu aşamayı kontrol etmek için
Rekombinant RNasin RNase İnhibitörüPromegaN2515
Sahne üstü İnkübatörIn vivo bilimsel (dünya hassas Aletleri)98710-1Özel yapım akrilik kafesli
Boyama kavanozuFisher Scientific08-817
StreptavidinThermo Scientific43-4301
Sülfürik asitFisher ScientificA300212
SYBR green IIFisher ScientificS7564
ŞırıngaHamilton1725RN
Şırınga pompasıHarvard cihazı55-3333
Tris (1M), pH = 7.0Thermo ScientificAM9850G
Ultrasonik BanyoBranson
ÜreSigma-AldrichU5378-500G
Vaccinia Kapatma sistemiNew England BiolabsM2080S
Zymo AraştırmaC1004
CPX1800H Zymo-Spin IC Sütunları

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hinnebusch, A. G. The scanning mechanism of eukaryotic translation initiation. Annual Review of Biochemistry. 83, 779-812 (2014).
  2. Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5, 827-835 (2004).
  3. Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 113-127 (2010).
  4. Silvera, D., Formenti, S. C., Schneider, R. J. Translational control in cancer. Nature Reviews Cancer. 10, 254-266 (2010).
  5. Saini, A. K., Nanda, J. S., Lorsch, J. R., Hinnebusch, A. G. Regulatory elements in eIF1A control the fidelity of start codon selection by modulating tRNA(i)(Met) binding to the ribosome. Genes and Development. 24, 97-110 (2010).
  6. Algire, M. A., et al. Development and characterization of a reconstituted yeast translation initiation system. RNA. 8, 382-397 (2002).
  7. Amrani, N., Ghosh, S., Mangus, D. A., Jacobson, A. Translation factors promote the formation of two states of the closed-loop mRNP. Nature. 453, 1276-1280 (2008).
  8. Pisarev, A. V., Unbehaun, A., Hellen, C. U., Pestova, T. V. Assembly and analysis of eukaryotic translation initiation complexes. Methods in Enzymology. 430, 147-177 (2007).
  9. Hinnebusch, A. G. Structural insights into the mechanism of scanning and start codon recognition in eukaryotic translation initiation. Trends in Biochemical Sciences. 42, 589-611 (2017).
  10. Iwasaki, S., Ingolia, N. T. The growing toolbox for protein synthesis studies. Trends in Biochemical Sciences. 42, 612-624 (2017).
  11. Morisaki, T., et al. Real-time quantification of single RNA translation dynamics in living cells. Science. 352, 1425-1429 (2016).
  12. Wang, C., Han, B., Zhou, R., Zhuang, X. Real-time imaging of translation on single mRNA transcripts in live cells. Cell. 165, 990-1001 (2016).
  13. Wu, B., Eliscovich, C., Yoon, Y. J., Singer, R. H. Translation dynamics of single mRNAs in live cells and neurons. Science. 352, 1430-1435 (2016).
  14. Yan, X., Hoek, T. A., Vale, R. D., Tanenbaum, M. E. Dynamics of translation of single mRNA molecules in vivo. Cell. 165, 976-989 (2016).
  15. Wang, H., Sun, L., Gaba, A., Qu, X. An in vitro single-molecule assay for eukaryotic cap-dependent translation initiation kinetics. Nucleic Acids Research. 48, 6(2020).
  16. Aitken, C. E., Lorsch, J. R. A mechanistic overview of translation initiation in eukaryotes. Nature Structural & Molecular Biology. 19, 568-576 (2012).
  17. Anderson, C. W., Straus, J. W., Dudock, B. S. Preparation of a cell-free protein-synthesizing system from wheat germ. Methods in Enzymology. 101, 635-644 (1983).
  18. Erickson, A. H., Blobel, G. Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods in Enzymology. 96, 38-50 (1983).
  19. Iizuka, N., Najita, L., Franzusoff, A., Sarnow, P. Cap-dependent and cap-independent translation by internal initiation of mRNAs in cell extracts prepared from Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 14, 7322-7330 (1994).
  20. Iizuka, N., Sarnow, P. Translation-competent extracts from Saccharomyces cerevisiae: effects of L-A RNA, 5' cap, and 3' poly(A) tail on translational efficiency of mRNAs. Methods. 11, 353-360 (1997).
  21. Jackson, R. J., Hunt, T. Preparation and use of nuclease-treated rabbit reticulocyte lysates for the translation of eukaryotic messenger RNA. Methods in Enzymology. 96, 50-74 (1983).
  22. Sachs, M. S., et al. Toeprint analysis of the positioning of translation apparatus components at initiation and termination codons of fungal mRNAs. Methods. 26, 105-114 (2002).
  23. Tarun, S. Z., Sachs, A. B. A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes and Development. 9, 2997-3007 (1995).
  24. Wang, Z., Sachs, M. S. Ribosome stalling is responsible for arginine-specific translational attenuation in Neurospora crassa. Molecular and Cellular Biology. 17, 4904-4913 (1997).
  25. Wang, Z., Sachs, M. S. Arginine-specific regulation mediated by the Neurospora crassa arg-2 upstream open reading frame in a homologous, cell-free in vitro translation system. Journal of Biological Chemistry. 272, 255-261 (1997).
  26. Fedyukina, D. V., Cavagnero, S. Protein folding at the exit tunnel. Annual Review of Biophysics. 40, 337-359 (2011).
  27. Jha, S., Komar, A. A. Birth, life and death of nascent polypeptide chains. Biotechnology Journal. 6, 623-640 (2011).
  28. Gregorio, N. E., Levine, M. Z., Oza, J. P. A user's guide to cell-free protein synthesis. Methods and Protocols. 2, 24(2019).
  29. Zhovmer, A., Qu, X. Proximal disruptor aided ligation (ProDAL) of kilobase-long RNAs. RNA Biology. 13, 613-621 (2016).
  30. Wu, C., Sachs, M. S. Preparation of a Saccharomyces cerevisiae cell-free extract for in vitro translation. Methods in Enzymology. 539, 17-28 (2014).
  31. Zhao, R., Rueda, D. RNA folding dynamics by single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 49, 112-117 (2009).
  32. Chandradoss, S. D., et al. Surface passivation for single-molecule protein studies. Journal of Visualized Experiments. (86), e50549(2014).
  33. Deindl, S., Zhuang, X. Monitoring conformational dynamics with single-molecule fluorescence energy transfer: applications in nucleosome remodeling. Methods in Enzymology. 513, 59-86 (2012).
  34. Greene, E. C., Wind, S., Fazio, T., Gorman, J., Visnapuu, M. L. DNA curtains for high-throughput single-molecule optical imaging. Methods in Enzymology. 472, 293-315 (2010).
  35. Gaba, A., Wang, Z., Krishnamoorthy, T., Hinnebusch, A. G., Sachs, M. S. Physical evidence for distinct mechanisms of translational control by upstream open reading frames. The EMBO Journal. 20, 6453-6463 (2001).
  36. Schaffer, B., Grogger, W., Kothleitner, G. Automated spatial drift correction for EFTEM image series. Ultramicroscopy. 102, 27-36 (2004).
  37. Wang, Y., et al. Localization events-based sample drift correction for localization microscopy with redundant cross-correlation algorithm. Optics Express. 22, 15982-15991 (2014).
  38. Sugar, J. D., Cummings, A. W., Jacobs, B. W., Robinson, B. D. A free Matlab script for spacial drift correction. Microscopy Today. 22, 40-47 (2014).
  39. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nature Methods. 11, 281-289 (2014).
  40. Meijering, E., Dzyubachyk, O., Smal, I. Methods for cell and particle tracking. Methods in Enzymology. 504, 183-200 (2012).
  41. Chung, S. H., Kennedy, R. A. Forward-backward non-linear filtering technique for extracting small biological signals from noise. Journal of Neuroscience Methods. 40, 71-86 (1991).
  42. Ensign, D. L., Pande, V. S. Bayesian detection of intensity changes in single molecule and molecular dynamics trajectories. Journal of Physical Chemistry B. 114, 280-292 (2010).
  43. Blanco, M., Walter, N. G. Analysis of complex single-molecule FRET time trajectories. Methods in Enzymology. 472, 153-178 (2010).
  44. Shuang, B., et al. Fast step transition and state identification (STaSI) for discrete single-molecule data analysis. The Journal of Physical Chemistry Letters. 5, 3157-3161 (2014).
  45. White, D. S., Goldschen-Ohm, M. P., Goldsmith, R. H., Chanda, B. Top-down machine learning approach for high-throughput single-molecule analysis. Elife. 9, 53357(2020).
  46. Vassilenko, K. S., Alekhina, O. M., Dmitriev, S. E., Shatsky, I. N., Spirin, A. S. Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Research. 39, 5555-5567 (2011).
  47. Zheng, Q., et al. Ultra-stable organic fluorophores for single-molecule research. Chemical Society Review. 43, 1044-1056 (2014).
  48. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94, 1826-1835 (2008).
  49. Shi, X., Lim, J., Ha, T. Acidification of the oxygen scavenging system in single-molecule fluorescence studies: in situ sensing with a ratiometric dual-emission probe. Analytical Chemistry. 82, 6132-6138 (2010).
  50. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J., McCarthy, J. E. Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Molecular Microbiology. 51, 987-1001 (2004).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Floresan Antikor Ba lanmasYeni Sentezlenen Polipeptit TakibiGer ek Zamanl G r nt lemeTek Molek l Y r ngeleriH cre D Translasyon SistemimRNA mmobilizasyonuAk Kanal Haz rlama

İlgili makaleler