Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot

5.8K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61657

⸱

26 Eylül 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Developmental Neurobiology, Cell and Developmental Biology Center, National Heart, Lung, and Blood Institute, National Institutes of Health, 2United Graduate School of Drug Discovery and Medical Information Sciences, Gifu University

Bu makalede

Özet

Ultra yüksek hızlı batı şişkinlik tekniği, bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile birlikte döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) teknolojisi ile antijen-antikor bağlama kinetiğinin iyileştirilmesi ile geliştirilmiştir.

Özet

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir) biyomedikal araştırmalar için kurallı bir yöntemdir. Genellikle belirli proteinlerin bağıl boyutunu ve bolluğunu ve çeviri sonrası protein modifikasyonlarını belirlemek için kullanılır. Bu teknik zengin bir geçmişe sahiptir ve sadeliği nedeniyle yaygın kullanımda kalır. Bununla birlikte, batı şişkinlik prosedürünün tamamlanması saatler, hatta günler alır ve kritik bir darboğaz, verimini sınırlayan uzun kuluçka süreleridir. Bu inkübasyon adımları, antikorların toplu çözeltiden membran üzerindeki hareketsiz antijenlere kadar yavaşça yayılması nedeniyle gereklidir: zarın yakınındaki antikor konsantrasyonu, toplu konsantrasyondan çok daha düşüktür. Burada, antikor çözeltisinin döngüsel drenajı ve yenilenmesi (CDR) yoluyla antijen bağlanmasını iyileştirerek bu kuluçka aralıklarını önemli ölçüde azaltan bir yenilik sunuyoruz. Ayrıca tahlil hassasiyetini korumak için bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık. CDR yönteminin ticari bir immünoreaksiyon arttırıcı madde ile kombinasyonu çıkış sinyalini artırdı ve antikor inkübasyon süresini önemli ölçüde azalttı. Elde edilen ultra yüksek hızlı batı lekesi, hassasiyet kaybı olmadan 20 dakikada gerçekleştirilebilir. Bu yöntem hem chemiluminescent hem de floresan tespiti kullanılarak batı lekelerine uygulanabilir. Bu basit protokol, araştırmacıların birçok örnekte protein ekspresyonunun analizini daha iyi keşfetmelerini sağlar.

Giriş

Batı lekesi (immünoblot olarak da bilinir), çok çeşitli bilimsel ve klinik disiplinlerde güçlü ve temel bir tekniktir. Bu teknik, proteinlerin varlığını, bağıl bolluğunu, bağıl moleküler kütlesini ve çeviri sonrası modifikasyonlarını incelemek için kullanılır1. Dijital görüntü analizi ile birlikte, bu yöntem proteinlerin bolluğunu ve protein modifikasyonlarını güvenilir bir şekilde analiz edebilir2. Batı lekesi rutin olarak yapılsa da zaman alan ve emek yoğun bir yöntemdir. Antikorun membranlarla uzun inkübasyonları gereklidir. Burada, duyarlılıktan ödün vermeden bu sınırlamanın üstesinden gelen kuluçka yönteminin bir değişikliğini açıklıyoruz.

Membran inkübasyonu sırasında, antikorlar çözelti içinde yüzerken, antijenler membran üzerinde hareketsiz hale getirilir. Yüksek benzeşimleri nedeniyle, antijene antikor bağlanma hızı, antikorların dökme çözeltiden zara yayılmasından daha hızlıdır. Bu, düşük konsantrasyonda bir "tükenme katmanı" oluşturur (Şekil 1). Bu teknikte uzun kuluçka sürelerinin ana faktörü olan pasif difüzyon yoluyla daha uzak antikorların zara ulaşması saatler alabilir. Bu etkiye toplu taşıma sınırlaması (MTL)3denir. Antikor içeren çözeltinin tekrar tekrar boşaltılması ve yenilenmesinin tükenme tabakasını bozabileceği ve MTL4'ünüstesinden gelebileceği önerilmiştir. Burada, geleneksel bir batı blotting protokolünde MTL'nin etkisini azaltmak ve gerekli kuluçka süresini kısaltmak için bu döngüsel drenaj ve ikmal (CDR) kavramını uygulayan benzersiz bir teknik tasarladık.

Algılama hassasiyetini kısa bir kuluçka süresiyle korumak için, antijen-antikor reaksiyonunu hızlandıran ve böylece sinyal-gürültü oranını artıran bir immünoreaksiyon arttırıcı teknoloji kullandık5. Piyasada bulunan birçok immünoreaksiyon arttırıcı madde (IRE) 2 bileşenden oluşur (Çözüm 1 ve 2, bkz. Malzeme Tablosu). IRE'nin tescilli bileşimi veya etki mekanizması açıklanmadı, ancak daha önce IRE'nin katı faz bağlama testlerinde antijen ve antikor arasındaki ayrışma sabitini azalttığını bulduk, bu da artan benzeşimin en azından kısmen IRE6'nınarttırıcı etkisinden sorumlu olduğunu gösteriyor. CDR'nin IRE ile kombinasyonu, hassasiyettan ödün vermeden tüm prosedür süresini azaltan ultra yüksek hızlı bir batı blotting protokolü verir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. SDS-PAGE ve bir PVDF membran aktarın

  1. Proteinleri göreli boyuta göre ayırmak için SDS-PAGE gerçekleştirin.
    NOT: Herhangi bir ticari veya ev yapımı jel sistemi iyidir. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.
  2. Ayrılmış proteinleri bir jelden PVDF zarına aktarın.
    NOT: Yaygın transfer yöntemleri (yarı kuru veya ıslak transfer) uygundur. Lütfen üreticinin protokolüne uyun.

2. PVDF membranlarının engellenmesi

  1. Membranları oda sıcaklığında ajitasyon ile 1 saat boyunca uygun engelleme tamponlarında kuluçkaya yatırın.
    NOT: Birincil antikor ve algılama sistemine bağlı olarak uygun bir blokaj tamponu seçilmelidir. Örneğin, en tipik blokerler BSA, yağsız kuru süt, kazein ve ticari sentetik polimerlerdir. %0,1 Ara20 ile PBS ve/veya TBS en sık kullanılan arabelleklerdir. Bu engelleme adımı 4 °C'de bir gecede yapılabilir.

3. Primer antikor ile inkübasyon

  1. Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-1 çözeltisi (IRE-1) hazırlayın. Girdap iyi.
  2. Seyreltilmiş primer antikoru% 10 IRE-1 ile hazırlayın. Hafifçe ve iyice karıştırın.
  3. Daha büyük bir membran (4 cm x 8 cm – 8 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 50 mL konik santrifüj tüplerine 8 mL antikor çözeltisi ekleyin. Daha küçük bir membran (2 cm x 8 cm – 4 cm x 8 cm) kullanıyorsanız, 14 mL yuvarlak tabanlı polipropilen tüpe(Malzeme Tablası)3 mL antikor çözeltisi ekleyin.
  4. PVDF membranını cımbızla alın ve engelleme solüsyonunu kısa bir süre boşaltın. PVDF zarını eldivenli parmaklarla bu tüpe yerleştirin ve tüm zarın tüpün duvarına yapıştığından emin olun. PVDF membran bir tüpe yerleştirildiğinde, başlangıçta jel ile içe doğru temas eden zarın "protein tarafı" ile yüzleşin. Kapağı sıkıca kapatın.
  5. 50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.
    NOT: Bu inkübasyon için 14 mL tüp kullanıldığında, iç tüpü 50 mL tüpün ortasında tutmak için bir çift plastik halka tutucu kullanarak 50 mL'lik tüpe 14 mL'lik bir tüp yerleştirin.
  6. Hibridizasyon fırınını açın.
  7. Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın.
    NOT: Membranın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun. Gerçek deneyden önce antikorun seyreltilmesini ve kuluçka süresini kalibre edin.

4. Membran yıkama

  1. Dönüşü durdurun.
  2. PVDF membranını cımbızla tüpten dikkatlice çıkarın ve membranı 50 mL PBS-T içeren bir kaba yerleştirin.
  3. Membranı PBS-T ile kısa bir süre durulayın.
  4. Zarı kabarmış su ile kabarcık görününe kadar durulayın. Bu antikorun çoğunluğunu çıkarmaktır.
  5. PVDF membranını kaptan 250 mL PBS-T içeren salata spinner'a aktarın.
  6. Süzgeç sepetini spinner'a yerleştirin. Kapağın güvenli bir şekilde takıldığından emin olun.
  7. Spinner'ı etkinleştirin ve yaklaşık 20-30 s boyunca çalıştırın.
  8. Çözeltiyi atın ve spinner'ın içini damıtılmış suyla kısa bir süre durulayın.
  9. Spinner'a tekrar 250 mL PBS-T ekleyin.
  10. 4.6 ve 4.7 adımlarını yineleyin.

5. İkincil antikor ile inkübasyon

  1. Damıtılmış su ile %10 immünoreaksiyon arttırıcı ajan-2 çözeltisi (IRE-2) hazırlayın. Girdap iyi.
  2. Seyreltilmiş ikincil antikorun %10 IRE-2 ile hazırlanması. Hafifçe ve iyice karıştırın.
  3. Adım 3.3'te belirtildiği gibi antikor çözeltisinin ve tüpün hacmini seçin.
  4. PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın. 3.4. adımda belirtildiği gibi PVDF membranını tüpe yerleştirin.
  5. 50 mL'lik tüpü hibridizasyon fırını için bir cam şişeye yerleştirin.
  6. Hibridizasyon fırınını açın.
  7. Membranı en az 5 dakika boyunca 6 rpm dönüşle kuluçkaya yatırın. Zarın her zaman duvara yapıştığından ve (iç) tüpün membranı antikor çözeltisi ile eşit şekilde kaplayacak şekilde yatay olduğundan emin olun.
    NOT: Gerçek denemeden önceki kuluçka süresini kalibre edin. İkincil antikor floresan konjuge edildiğinde, inkübasyonu karanlıkta gerçekleştirin.

6. Membran yıkama

  1. 4.1 ile 4.10 arasında olan adımları izleyin.

7. Görüntü alımı

  1. Chemiluminescent algılama
    1. Düz bir yüzeye bir parça yarı nakil esnek film (10 cm x 15 cm) yerleştirin.
    2. Chemiluminescent substratının 2 bileşenini 5 mL'lik bir tüpte karıştırın.
    3. Karışık substratın 1,5 mL'sini hemen yarı nakil esnek filme aktarın ve üzerine PVDF zarını yerleştirin. Daha sonra, substrat çözeltisinin geri kalanını zara aktarın.
    4. PVDF membranı, yarı saydam esnek bir film üzerindeki karışık substrat ile 1 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
    5. PVDF membranını cımbızla alın ve substrat çözeltisini kısa bir süre boşaltın.
    6. Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.
    7. Görüntüyü chemiluminescent modu altında alın.
  2. Floresan algılama
    1. PVDF zarını cımbızla alın ve çözeltiyi kısaca boşaltın.
    2. Membranı bir çift şeffaflık filmi arasına sıkıştırın.
    3. Görüntüyü floresan modunda elde edin.
      NOT: Maksimum hassasiyet sağlamak için 7.1 ve 7.2 adımları görüntüleme makinesine yakın bir yerde yapılmalıdır.
    4. Arka plan sinyali yüksek olduğunda, 80-100 mL PBS-T içeren bir kapta yıkama adımı gerçekleştirin: birincil antikor için 3 kez 10 dakika durulayın ve ikincil antikor için 5 dakika durulayın.
      NOT: %10 IRE çözeltileri ile seyreltilmiş hem birincil hem de ikincil antikorlar hassasiyet kaybı olmadan 8-10 kata kadar kullanılabilir6. Çözelti 1 aya kadar 4 °C'de tutulmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu örnek, CDR yönteminin batı blot üzerindeki immünoenhancing teknolojisi ile birlikte etkinliğini göstermektedir. Statik inkübasyon, PVDF membranlarının antikor çözeltisi ile inkübe edildiği yarı saydam esnek bir film üzerinde yapılırken, CDR inkübasyonu membranları ve antikor çözeltisini (Film) içeren tüpleri döndürerek hibridizasyon fırınında yapıldı. Şekil 2'de batı lekelerinde chemiluminescent tespiti için gerekli olan antijen ve antikor miktarları gösterildi. Hem statik hem de CDR inkü...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Batı blotu, ~40 yıl önce7,8. O zamandan beri, teknik gelişmeye devam etti, sonraki yenilikler tekniğin hassasiyetini, hızını ve niceliğini geliştirdi2, 9,10,11,12,13. Burada sunulan gelişmiş ultra yüksek hızlı batı şişkinlik protokolü, mevcut teknikte birkaç önemli ge...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar, bu makalenin içeriğiyle doğrudan ilgili rakip çıkarlar beyan etmemektedir.

Teşekkürler

Bu çalışma Intramural Araştırma Bölümü, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi. S.H., Japonya Kamu-Özel Ortaklığı Öğrenci Yurtdışında Eğitim Programı tarafından desteklendi ve H.N. ve K.Y. Valor ve V Drug Overseas Training Scholarship tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
14 mL Yuvarlak Alt Yüksek Netlik PP Test Tüpü, Dereceli, Snap KapaklıFalcon352059
Lazer Yazıcılar için Apollo Şeffaflık FilmiN/AN/AHer türlü Lazer Yazıcı Şeffaflık Filmi iyidir.
Azure Görüntüleme Sistemi 600Azure BiosystemsAzure 600Her türlü Görüntü Alma Sistemi, kemilüminesan ve/veya floresan tespiti için uygundur.
Sinyal İmmünoreaksiyon Arttırıcı Çözelti AlabilirTOYOBONKB-101
KARANFİL Anında Yağsız Kuru SütKaranfilN/A
ECL anti-fare IgG, Yaban turpu peroksidaz bağlantılı F (ab ')Koyundan 2 parçaGE HealthcareNA9310V
ECL anti-tavşan IgG, Yaban turpu peroksidaz bağlantılı F(ab')EşekGE HealthcareNA9340V
HYBAID Micro-4N/AN/Aparçasından 2 parça Tüpler yatay konumda eşit şekilde döndürüldüğü sürece herhangi bir hibridizasyon fırını iyidir.
Immobilon-P PVDF Membran, 0.45 & m gözenek boyutuMillipore SigmaIPVH304F0
IRDye 680RD Keçi anti-Fare IgG İkincil AntikoruLICOR926-68070
IRDye 800CW Keçi anti-Tavşan IgG İkincil AntikoruLICOR926-32211
KPL LumiGLO Rezerv Kemilüminesan Substratseracare5430-0049
Fare anti-ß aktin antikoruMillipore SigmaA5316
Odyssey Engelleme Tamponu (PBS)LICOR927-40100Floresan algılama için Engelleme Tamponu
OXO Salata DöndürücüOXO32480V2BPVDF membranları yırtılmadan kuvvetlice durulandığı sürece herhangi bir salata döndürücü iyidir.
Parafilm Sızdırmazlık FilmiBemisParafilm M PM996yarı saydam esnek film
50 mL Konik Tabanlı Santrifüj Tüpleri için Polietilen Düz Üst Vidalı KapaklarFalcon352070
14 ml'lik tüpü 50 ml'lik tüpün ortasında tutmak için halkalarN/AN/ABir makine atölyesinde hazırlanmıştır
Tavşan anti-6X His tag antikoruAbcamab9108
Tween20Kırlangıç SigmaP2287

Kaynaklar

  1. MacPhee, D. J. Methodological considerations for improving Western blot analysis. Journal of Pharmacol Toxicology Methods. 61 (2), 171-177 (2010).
  2. Janes, K. A. An analysis of critical factors for quantitative immunoblotting. Science Signaling. 8 (371), (2015).
  3. Schuck, P., Zhao, H. The role of mass transport limitation and surface heterogeneity in the biophysical characterization of macromolecular binding processes by SPR biosensing. Methods in Molecular Biology. 627, 15-54 (2010).
  4. Li, J., Zrazhevskiy, P., Gao, X. Eliminating Size-Associated Diffusion Constraints for Rapid On-Surface Bioassays with Nanoparticle Probes. Small. 12 (8), 1035-1043 (2016).
  5. Immunoreaction enhancing: technology. Toyobo. , Available from: http://www.toyobousa.com/lifescience-immunoreaction-enhancing.html (2020).
  6. Higashi, S. L., et al. Old but not Obsolete: An Enhanced High Speed Immunoblot. Journal of Biochemistry. 168 (1), 15-22 (2020).
  7. Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76, 4350-4354 (1979).
  8. Burnette, W. N. "Western blotting": electrophoretic transfer of proteins from sodium dodecyl sulfate--polyacrylamide gels to unmodified nitrocellulose and radiographic detection with antibody and radioiodinated protein A. Analytical Biochemistry. 112 (2), 195-203 (1981).
  9. Mishra, M., Tiwari, S., Gomes, A. V. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Review of Proteomics. 14 (11), 1037-1053 (2017).
  10. Ciaccio, M. F., Wagner, J. P., Chuu, C. P., Lauffenburger, D. A., Jones, R. B. Systems analysis of EGF receptor signaling dynamics with microwestern arrays. Nature Methods. 7 (2), 148-155 (2010).
  11. Treindl, F., et al. A bead-based western for high-throughput cellular signal transduction analyses. Nature Communications. 7, 12852(2016).
  12. Sajjad, S., Do, M. T., Shin, H. S., Yoon, T. S., Kang, S. Rapid and efficient western blot assay by rotational cyclic draining and replenishing procedure. Electrophoresis. 39 (23), 2974-2978 (2018).
  13. Kurien, B. T., Scofield, R. H. A brief review of other notable protein detection methods on blots. Methods in Molecular Biology. 536, 557-571 (2009).
  14. Nagase, H., et al. Reliable and Sensitive Detection of Glycosaminoglycan Chains with Immunoblots. Glycobiology. , (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Siklik Boşaltma ve YenilemeProtein TespitiAntikor İnkübasyonuKemilüminesan TespitFloresan TespitPVDF MembranBloklama TamponuSantrifüjlü Salata Kurutucu
İmmünreaksiyon Arttırıcı Teknoloji Kullanan Ultra Yüksek Hızlı Batı Blot
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.