Yöntem makalesi

Çözünür Hücre Dışı Matriks (ECM) Üretimi için İnsan Pankreasının Deterjansız Dehücresizleştirilmesi

DOI:

10.3791/61663

⸱

4 Eylül 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome, 5Wake Forest University College of Arts and Science, 6Wake Forest University School of Medicine, 7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazıda açıklanan protokol, insan pankreasından çözünür bir hücre dışı matrisin (ECM) üretilmesi için gereken adımları açıklamaktadır. Bu protokol yoluyla elde edilen çözündürülmüş ECM tozu, pankreas adacıklarının mikro ortamının in vitro ve potansiyel olarak in vivo ortamlarda yeniden kapitülasyonu için kullanılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Adacık nakli (ITx), beta hücre replasman tıbbında standart bakım olma potansiyeline sahiptir, ancak sonuçları tüm pankreas nakli ile elde edilenlerden daha düşük kalmaktadır. Şu anda insan adacık izolasyonu için kullanılan protokoller, pankreasın yıkıldığı, vücutla olan bağlantılarının kaybolduğu ve adacıkların geri dönüşü olmayan şekilde hasar gördüğü organın enzimatik sindirimine dayandıkları için inceleme altındadır. Adacık hasarı, adacık nişinin 3 boyutlu çerçevesini temsil eden ve kaybı adacık öfizyolojisi ile bağdaşmayan hücre dışı matrisin (ECM) tahrip olması gibi kritik faktörlerle karakterize edilir. Araştırmacılar, bu sorunu çözmek ve nihayetinde adacık canlılığını, işlevini ve ömrünü iyileştirmek için memeli pankreasından türetilen ECM tabanlı iskelelerin kullanılmasını önermektedir. Şu anda bu tür iskeleleri elde etmek için mevcut yöntemler serttir çünkü bunlar büyük ölçüde deterjan bazlıdır. Bu nedenle, daha az ECM hasarı yaratan ve pankreas ECM'sinin kritik bileşenlerini koruyabilen yeni, deterjan içermeyen bir yöntem öneriyoruz. Sonuçlar, yeni geliştirilen hücre giderme protokolünün, ECM bileşenleri korunurken tam DNA klirensinin elde edilmesine izin verdiğini göstermektedir. Elde edilen ECM, sitotoksisite açısından test edildi ve glukoz tehdidi ile uyarıldığında insülin sekresyonu ile pozitif bir hücresel davranış gösteren insan pankreas adacıkları ile kapsüllendi. Toplu olarak, geleneksel iyonik ve iyonik olmayan kimyasal deterjanlar kullanılmadan insan pankreasının hücrelerden arındırılması için yeni bir yöntem öneriyoruz. Bu protokol ve onunla elde edilen ECM, hem in vitro hem de in vivo uygulamalar için kullanılabilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pankreas adacıklarının izolasyonu, adacıklar arasındaki bağlantıların ve onların hücre dışı çevreleyen destekleyici yapısının enzimatik sindirimi yoluyla gerçekleştirilen titiz bir işlemdir. Hücre dışı matrisin (ECM) bu şekilde yok edilmesi, izolasyon süreçleri 1,2,3,4 sırasında meydana gelen adacıkların hasarını karakterize etmede kritik faktörlerden biridir. Peri-adacık ECM, endokrin pankreasın önemli bir aselüler bileşenidir. Fizyolojik homeostazı yapısal ve biyokimyasal olarak destekleyen üç boyutlu bir ağ oluşturmak için etkileşime giren ve çapraz bağlanan proteinler ve polisakkaritlerden oluşur ve bu in vitro mikro ortamın yeniden oluşturulmasına yardımcı olur 2,5,6. Adacıklar ve ECM arasındaki temel sinyalleşme süreçlerinin kaybı, adacıkların in vitro ve in vivoolarak hayatta kalmasını sınırlayan katkıda bulunan faktörlerden biri olarak kabul edilmektedir 2,7,8,9,10.

Hayvan ve insan kaynaklı ECM, pankreas adacıklarının mikro çevresinin 11,12,13,14,15,16,17,18,19 yeniden özetlenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. ECM'nin sıçan adacık hücrelerinin bağlanmasını, çoğalmasını ve uzun süreli kültür bakımını geliştirme yeteneği ilk olarak ref.20'de bildirildiğinden beri, diğer birçok çalışma, insan adacıkları ile doğal ECM etkileşiminin restorasyonunun adacık işlevinigeliştirdiğine dair güçlü kanıtlar sağlamıştır 21,22. Örneğin, son veriler, ECM ile kapsüllenmiş adacıkların diyabetik farelerde glisemik kontrolü önemli ölçüde iyileştirdiğini, yeni bir hücre bazlı insülin dağıtım platformunda insülinin verilmesini geliştirdiğini ve kolaylaştırdığını göstermiştir23. Ayrıca, çalışmalar, pankreatik ECM'nin kritik bileşenlerinin dahil edilmesinin, β hücrelerinin endokrin fonksiyonunu önemli ölçüde iyileştirebileceğini göstermiştir 24,25,26,27.

Literatürde bulunan ECM üretim protokolleri, örneğin Triton X-100 veya sodyum dodesil sülfat (SDS) gibi kimyasal deterjanların uygulanmasına dayanmaktadır. Mükemmel DNA izni sağlamasına rağmen, hücreden arındırma işlemlerinde kullanılan kimyasallar sitotoksik, pahalıdır ve hücreden arındırılmış doku üzerindeki kalıntılar, potansiyel klinik uygulama açısından endişelere yol açmaktadır.

Bu gözlemlere dayanarak, bu çalışmanın amaçları üç yönlüydü: Birincisi, iyonik veya iyonik olmayan kimyasal deterjanların minimum kullanımıyla insan pankreası için bir hücre giderme yöntemi geliştirmek; İkincisi, doku kültürü için çözünür bir ECM iskelesi üretmek; Üçüncüsü, sitotoksisitesini ve adacık hücresi fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için pankreas ECM'sini karakterize etmek. Karakterizasyon, çözündürülmüş pankreas ECM'nin izole adacıklar için pankreas mikro ortamının özetlenmesinde faydalı olabileceğini gösterdiğinden, tüm hücre kültürü tabanlı uygulamalar için gereklidir. Burada açıklanan, insan pankreası için etkili, deterjan içermeyen bir hücre giderme yöntemi, ECM'nin karakterizasyonu ve ECM'nin kapsüllenmiş izole insan pankreas adacıklarının canlılığı ve işlevi üzerindeki etkisidir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma çalışması, Wake Forest Baptist Tıp Merkezi'nin insan araştırma komitesi tarafından onaylandı. İnsan pankreasları, Carolina Donör Hizmetleri aracılığıyla organ bağışçılarından etik olarak elde edildi. Organ bağışçıları, UNOS yönetmeliklerine göre insanlarla ilgili bulaşıcı hastalıklar açısından tarandı. Organlar steril koruma solüsyonunda alındı ve kullanılıncaya kadar saklandı. Laboratuvara teslim edildikten sonra, tüm organlar incelendi ve histolojik amaçlar için doğal pankreas örnekleri toplandı. Organlar daha sonra donduruldu ve daha fazla kullanılana kadar -20 ° C'de steril koşullarda saklandı.

1. İnsan pankreasının cerrahi hazırlığı

NOT: Donmuş pankreaslar gece boyunca 4 ° C'de çözüldü.

  1. İnsan pankreasının cerrahi diseksiyonuna başlamadan önce, 950 mL deiyonize su (dH2O), 50 mL iyot bazlı reaktif ve% 1 Kalem / Strep çözeltisinden oluşan 1 L yıkama solüsyonu hazırlayın.
  2. Cerrahi diseksiyon sırasında steril eldiven ve laboratuvar önlüğü giyin. Olası kontaminasyonu önlemek için tüm ameliyatları hücre kültürü dereceli bir başlık altında gerçekleştirin.
  3. Pankreası steril taşıma torbasından steril plasenta havzasına aktarın. Pankreasın, organın başı sola ve kuyruğu sağa bakacak şekilde yönlendirildiğinden emin olun.
  4. Steril makas ve dişli olmayan forseps kullanarak duodenumu pankreasın başından dikkatlice inceleyin. Duodenumda delik açmamaya dikkat edin, çünkü bu kontaminasyon olasılığını artırır.
    NOT: Gastrointestinal sistemde bir delik açılırsa, deliği hızlı bir şekilde sıkıştırın ve diseksiyona devam edin.
  5. Pankreas başının diseksiyonu tamamlandıktan sonra, duodenumu uygun bir biyolojik tehlike torbasına atın ve atılması için kurumsal yönergeleri izleyin.
  6. Ana kan damarları ve ortak safra kanalı da dahil olmak üzere pankreasın başı çevresinde kalan tüm pankreas dışı dokuları inceleyin ve atın, bunlar genellikle organ alımı sırasında emilemeyen dikişlerle işaretlenir. Dokuyu kurumsal yönergelere göre atın.
  7. Pankreasın kuyruğunu çevreleyen tüm ekstra pankreas dokusunu ve peripankreatik yağ dokusunu inceleyin ve atın, dalak kan damarlarını açığa çıkarın.
  8. Dalağın vasküler pedikülü açığa çıktığında, dalağı çıkarın ve pankreasın arka yüzeyine (dalak arteri ve ven) bağlı olanlar da dahil olmak üzere dalak kan damarlarını bütünüyle inceleyin. Dalağı atın ve kurumsal yönergeleri izleyerek dokuyu çıkarın.
  9. Açıkça görülebilen herhangi bir ekstra pankreas yağını, özellikle peripankreatik yağı uygun şekilde inceleyin ve atın.
    NOT: Pankreasın kuyruğu seviyesinde, retroperiton görülebilir. Bu, dişli olmayan forsepslerle kaldırılmalı, cerrahi forseps ile uygun şekilde çıkarılmalı ve uygun şekilde atılmalıdır. Pankreas artık herhangi bir ekstra pankreas dokusundan arındırılmış olmalıdır.
  10. Cerrahi makas, sterilize edilmiş histolojik bıçaklar veya cerrahi neşter kullanarak 1 cm3 küp pankreas dokusu elde etmek için pankreası inceleyin. Bu diseksiyondan sonra elde edilen pankreas dokusu küpleri decellularizasyon işlemine tabi tutulacaktır. Decellularizasyona uğrayan ortalama pankreas küpü sayısı, organın içsel özelliklerine bağlıdır. Sunulan çalışmada ortalama olarak 40-60 pankreas küpü decellularizasyona tabi tutulmuştur.
  11. Adım 2.1'e ilerleyin

2. Pankreas dokusunun hücreden arındırılması

NOT: Bu protokol ortalama ağırlığı 100 g olan pankreas ile kullanılmıştır; Bu nedenle, bu hücre giderme tekniğini kullanırken bu ağırlığın aşılması önerilmez.

  1. Daha önce adım 1.10'da diseke edilen tüm pankreas dokusunu yıkama solüsyonu ile steril bir plastik kaba (Malzeme Tablosuna bakınız) koyun ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
  2. Pankreas dokusunu steril forseps yardımıyla çıkarın ve steril, endotoksin içermeyen deiyonize su içeren yeni bir steril kaba koyun. Kabın kapağını sıkıca kapatın ve 4 °C ayarlı sıcaklığa ve 180 saat boyunca 200–24 rpm arasında sallama hızına sahip soğutmalı bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
  3. Pankreas dokusunun bulunduğu kabı çıkarın ve işlemin devamı için davlumbazın içine yerleştirmeden önce dışını uygun şekilde temizleyin.
  4. Cerrahi forseps kullanarak pankreas dokusunu çıkarın ve 1 L deiyonize su, 50 mg DNaz I ve% 0.0025 magnezyum klorür ile birlikte yeni bir steril kaba koyun. Kabın kapağını sıkıca kapatın ve önceden ayarlanmış sıcaklığı 37 °C ve 100 saat boyunca 6 rpm çalkalama hızına sahip bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
  5. EDTA-Trizma çözeltisini hazırlayın
    1. Yeni bir steril 1 L kap alın ve davlumbaza koymadan önce uygun şekilde temizleyin. 1 L EDTA-Trizma çözeltisi hazırlamak için aşağıdakileri ekleyin: 985 mL steril deiyonize su, 7.5 mL Tris-HCl Tamponu ve 7.5 mL EDTA çözeltisi. Kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  6. Pankreas dokusunu çevreleyen kabı çıkarın ve işlemin devamı için kaputun içine sokmadan önce dışını uygun şekilde temizleyin.
  7. Pankreas dokusunu cerrahi forseps yardımıyla çıkarın ve 1 L EDTA-Trizma bazlı solüsyon içeren yeni bir steril kaba koyun. Kabın kapağını sıkıca kapatın ve önceden ayarlanmış sıcaklığı 4 °C ve 180 saat boyunca 200–18 rpm arasında sallama hızına sahip bir orbital çalkalayıcıya yerleştirin.
  8. Pankreas dokusunu içeren kabı çıkarın ve işlem için başlığa sokmadan önce dışını uygun şekilde temizleyin.
  9. Pankreas dokusunu steril forseps yardımıyla çıkarın ve steril endotoksin içermeyen deiyonize su ile yeni bir steril kaba koyun. Kabın kapağını sıkıca kapatın ve 4 °C ayarlı sıcaklığa ve 180 saat boyunca 200 ila 24 rpm arasında sallama hızına sahip soğutmalı bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin.
    NOT: Bu işlem süresi boyunca, dokunun daha parlak görüneceği renkte gözle görülür bir değişiklik olacaktır.
  10. Pankreas dokusunu toplayın ve steril 50 mL santrifüj tüplerinde saklayın, sonraki dondurma ve liyofilizasyon için tüp başına maksimum 25 mL'ye ulaşın. Santrifüj tüplerinin sayısı pankreasın büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Numuneleri -80 °C'de saklayın.

3. Pankreas ECM tozu üretimi – liyofilizasyon ve kriyo-frezeleme

  1. Hücrelerden arındırılmış materyalin -80 °C'de en az 24-40 saat saklanmasından sonra, pankreatik ECM'yi bir dondurarak kurutucuya aktarın.
  2. Donmuş malzemeyi dondurarak kurutucuya aktarın ve malzemenin çözülmesini önleyin.
    NOT: Liyofilizasyon adımı, işlemden geçen her tüpteki malzeme miktarı ve liyofilizasyon için maruz kalan yüzey gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak yaklaşık 3-5 gün sürer. Decellularize dokunun her tüpte 25 mL seviyesini aşmaması ve tüplerin 45 ° 'lik bir açıyla dondurulması önerilir, bu da liyofilizasyon başladığında daha fazla yüzeyin kolayca açığa çıkmasına izin verir. Kapakları tüplerden çıkarın.
  3. Liyofilizasyondan sonra, malzemeleri hücre kültürü dereceli bir davlumbaza aktarın.
  4. Kurutulmuş ECM'nin her bir parçasını steril makas kullanarak boyutunun yarısına kesin. Bu kurutulmuş ECM parçaları, bir ECM tozu üretmek için otomatik bir öğütme işlemine tabi tutulacaktır. Sıcaklığın yükselmesini ve ardından ECM'nin biyolojik özelliklerinin denatüre olmasını önlemek için kriyo ile öğütülmüş bir otomatik işlemci kullanın. Frezeleme işleminden sonra ince bir toz elde etmek için kriyo freze makinesinin ayarını yaptığınızdan emin olun.
    NOT: Bu çalışmada VKİ < 30 olan donörlerden alınan pankreas kullanıldı. BMI > 30 olan donörlerden alınan pankreata, daha fazla intraparankimal yağ içerme eğilimi gösterdi. Liyofilizasyon işlemi optimal olarak kabul edilmez ve yağ içeriği tarafından inhibe edilebilir. Liyofilizasyondan sonra doku gözle görülür şekilde yağlı ise, ECM tozunu üretmek için optimal olmayacağından atılmalıdır.

4. Pankreatik ECM'nin çözündürülmesi

NOT: Bu noktada, ortalama büyüklükteki bir pankreastan (100 g), hücreden arındırılmış pankreas tozunun verimi 1-2 g'dır.

  1. Steril bir plastik spatula yardımıyla 1 g ECM tozunu tartın.
  2. Daha önce açıklanan protokolleri izleyerek çözündürün: 1 g ECM'yi 100 mL 0.01 M HCl ve 100 mg pepsin içinde RT'de 48 saat boyunca sürekli karıştırarak28 çözündürün.
  3. 48 saat sonra, asidik ECM'nin pH'ını (pH = 7) nötralize etmek için NaOH kullanın ve jelleşmeyi önlemek için asidik ECM'yi içeren beheri buz üzerinde tutun.
    NOT: Jelleşme kinetiği sıcaklığa, kollajen içeriğine, pH'a ve nötralize edici solüsyona göre değişir. Bu araştırma çalışmasında 0.01 M NaOH kullanılmıştır. PH nötralizasyonu için eklenen NaOH hacmi yaklaşık 100 mL idi. Asidik ECM çözeltisini nötralize ederken pH'ı birden çok kez ölçmeyi düşünün.
  4. Nötr ECM çözeltisini steril 50 mL'lik santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri kapatın ve bir santrifüje yerleştirin. Çözündürülmüş ECM içeren tüpleri maksimum hızda (12.000 x g) 4 °C'de 15 dakika santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, tüpleri bir hücre kültürü başlığına aktarın.
    NOT: Numunenin santrifüjlenmesini takiben, ECM'nin çözünmeyen bileşeni tüpün dibinde biriktirilirken, çözündürülmüş ECM çözeltisi süpernatantın üst kısmında bulunacaktır.
  5. Steril teknikler kullanarak, çözündürülmüş ECM çözeltisini içeren tüpün süpernatantını toplayın ve tüp başına maksimum 25 mL'ye ulaşacak şekilde taze 50 mL'lik tüplere aktarın.
  6. ECM solüsyon tüplerini -80 °C'de saklayın.

5. Pankreas ECM tozu üretimi – liyofilizasyon ve depolama

  1. Çözünür ECM çözeltisinin -80 °C'de en az 24-40 saat saklanmasından sonra, tüpleri bir dondurarak kurutucuya aktarın.
  2. Donmuş malzemeyi dondurarak kurutucuya aktarın ve malzemenin çözülmemesini sağlayın.
    NOT: Liyofilizasyon adımı, işlemden geçen her tüpteki malzeme miktarı ve liyofilizasyon için maruz kalan yüzey gibi çeşitli faktörlere bağlı olarak yaklaşık 3-5 gün sürer. Çözündürülmüş ECM çözeltisinin her tüpte 25 mL seviyesini aşmaması ve liyofilizasyon başladığında daha fazla yüzeyin kolayca açığa çıkmasını sağlamak için tüplerin 45 ° 'lik bir açıyla dondurulması önerilir. Liyofilizasyondan önce kapakları falcon tüpünden çıkarın.
  3. Çözündürülmüş ECM çözeltisinin liyofilizasyonundan sonra, materyali hücre kültürü dereceli bir davlumbaza aktarın. Tam liyofilizasyondan sonra, ince bir ECM tozu görünecektir.
    NOT: Elde edilen verim, 1 g hücreden arındırılmış dokudan 700 mg'dır.
  4. Çözündürülmüş ECM tozunu saklayın veya hücre kültürü amaçları için kullanın.
    NOT: ECM'nin hemen kullanım için 4 °C'de, daha sonra kullanım için -20 °C'de ve uzun süreli saklama için -80 °C'de saklanması tavsiye edilir.

6. Pankreatik ECM'nin histolojik boyama ile karakterizasyonu

  1. Organın doğumundan hemen sonra ve hücreden arındırmadan önce bir parça doğal pankreas toplayın. Bunu % 10 formalin içinde 24 saat boyunca sabitleyin. Numuneleri deiyonize suda yıkayın. Parafine gömmeden önce dereceli alkolde kurutun ve 5 mm'lik bölümler halinde dilimleyin.
  2. Hücreden arındırma işleminin sonunda, hücreden arındırılmış malzemeden bir numune toplayın ve% 10 formalin içinde 24 saat boyunca sabitleyin. Numuneyi deiyonize suda yıkayın. Parafine gömmeden önce dereceli alkolde kurutun ve 5 mm'lik bölümler halinde dilimleyin.
  3. Başarılı bir hücreden arındırmayı doğrulamak için, hem doğal pankreas hem de hücresizleştirilmiş muadili üzerinde H&E ve DAPI boyama işlemi gerçekleştirin.
  4. Histolojik karakterizasyon için, sırasıyla kollajen ve GAG yapılarını vurgulayacak olan Masson'un Trikrom (MT) ve Alcian Mavisi (AB) boyamalarını gerçekleştirin.

7. Çözünür ECM tozunun karakterizasyonu

  1. Daha önce tarif edildiği gibi doğal pankreas dokusunun ve çözünür ECM tozunun DNA içeriğini ve toplam kollajen analizini gerçekleştirin29.
  2. Ticari olarak temin edilebilen bir kit tarafından sağlanan protokole dayalı olarak sülfatlanmış glikozaminoglikanları (sGAG) ölçün (bkz . Malzeme Tablosu). Pankreas ECM'sindeki sülfatlanmış sGAG içeriğini 595 nm30 dalga boyunda ölçmek için bir mikroplaka spektrofotometresi kullanın.
    NOT: DNA içeriğini ng/mg kuru doku ve kollajen ve GAG içeriğini μg/mg kuru doku olarak bildirin.

8. ECM ve kültür ile İnsan Adacıkları kapsüllemesi

NOT: İnsan pankreas adacıkları ticari olarak elde edilmiştir (bkz.

  1. Varışta, insan pankreas adacıklarını, her 10 cm'lik plakada yaklaşık 2.000 IEQ yoğunluğa sahip standart koşullar altında 24 saat boyunca doku kültürü ile muamele edilmiş plakalarda kültürleyin.
  2. Aşağıdaki deney gruplarıyla ECM'nin adacıkların işlevselliği ve yaşayabilirliği üzerindeki etkisini test etmek için insan adacıklarını manipüle edin: Serbest Adacıklar, Aljinat içinde kapsüllenmiş Adacıklar ve aljinat-ECM içinde kapsüllenmiş Adacıklar.
    NOT: Yukarıda belirtilen adacık grupları, ECM'nin adacıkların işlevselliği ve canlılığı üzerindeki etkisini değerlendirmek için standart koşullar altında 8 güne kadar in vitro olarak kültürlenmiştir.
  3. Aljinatı bir ölçekte tartın ve %1,5 (a/h) oranı elde etmek için HBSS ile bir santrifüj tüpüne asın. Santrifüj tüpünü gece boyunca 4 °C'de bir döndürücüye yerleştirin.
    NOT: Aljinat için üretici tarafından 75-200 kDA arasında bir moleküler ağırlık ve ≤ 1'lik bir G/M oranı rapor edilmiştir.
  4. 0.1 mg ECM'yi tartın ve 0.1 mg / mL'lik ECM konsantrasyonuna sahip olmak için önceden hazırlanmış 1 mL aljinat içinde süspanse edin.
  5. İnsan pankreas adacıklarını daha önce açıklanan bir protokol31'e göre aljinat ve aljinat-ECM'de kapsülleyin. Prosedür aşağıda kısaca açıklanmıştır.
    1. Daha önce adım 8.4'te hazırlanan 0.1 mg / mL'lik bir ECM konsantrasyonunda 1 mL aljinat içinde 3.000 IEQ ve 1 mL aljinat-ECM içinde 3.000 IEQ'yu nazikçe toplayın ve karıştırın.
    2. Elde edilen süspansiyonları sırasıyla 0.2 mL/dk'ya ve akış hızı ve 2.0 Pa hava basıncına ayarlanmış bir mikroakışkan kapsülleme cihazından pompalayın.
    3. Üretimden sonra, mikrokapsülleri 10 mM HEPES ile 100 mM CaCl2 banyosunda toplayın. Aljinatın 10 dakika çapraz bağlanmasına izin verin.
    4. Kültürlenmeden önce, kapsüllenmiş adacıkları standart koşullar altında, 37 ° C'de 2-3 dakika boyunca,% 5 CO2 ile HBSS ile yıkayın.
    5. Kültür ortamını ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve deneyin sonuna kadar her gün ortamın üçte ikisini değiştirin.
      NOT: Yukarıdaki adımlar hem aljinattaki Adacıklar hem de aljinat-ECM'deki Adacıklar için gerçekleştirilmelidir.
  6. 8. günde, kapsülleme sonrası, sırasıyla insülin üretimini ve adacıkların canlılığını değerlendirmek için glikoz ile uyarılan insülin sekresyonu (GSIS) ve DNA analizi yapın.
  7. Hücresel morfolojiyi ve canlılığı değerlendirmek için serbest ve kapsüllenmiş adacıkların parlak alan görüntülerini ve Canlı/Ölü boyamayı elde edin.
    NOT: Adacıkların sağlığını değerlendirmek için görüntülerin kalitatif değerlendirmesi yapılmıştır. Dikkate alınan parametreler arasında adacıkların şekli, sınırı, bütünlüğü ve çapının yanı sıra kültürdeki tek hücrelerin varlığı yer alır.

9. Glukoz ile uyarılan insülin salınımı (GSIS) ve DNA ölçümü

NOT: 8. günde, kapsülleme sonrası, insan pankreas adacıkları toplandı ve düşük (2.8 mM) ve yüksek (16.8 mM) glikoz konsantrasyonları içeren Kreb tamponu ile inkübe edildi, ardından KCl depolarizasyon çözeltisi (25 mM) izledi. Glikoz tehdidi, daha önce tarif edilen bir protokolün modifikasyonu ile gerçekleştirildi32.

  1. Jel filtrasyon reçinesini polipropilen sütunlara yerleştirin.
  2. Polipropilen kolonların içindeki jel filtrasyon reçinesinin orta kısmına işlem gruplarını (serbest adacıklar veya kapsüllenmiş adacıklar) yerleştirin.
  3. Glikoz ve depolarize edici çözeltileri yukarıda açıklanan polipropilen kolonlara pipetleyin ve aşağıdaki sırayla 1 saat inkübe edin: düşük molariteli glikoz çözeltisi ile bir ön inkübasyon periyodu gerçekleştirin, ardından düşük, yüksek, düşük ve depolarize edici glikoz çözeltisi ile bir dizi inkübasyona devam edin bölüm 9'un başındaki NOT'ta belirtildiği gibi.
  4. Besiyerini her inkübasyon aşamasından toplayın ve sonraki analizler için -80 °C'de saklayın.
  5. Depolarize edici çözeltinin inkübasyonunu ve toplanmasını takiben, insan pankreas adacıklarını 1 mL DNA ekstraksiyon tamponu ile inkübe edin ve daha fazla analize kadar saklayın.
  6. Üreticinin protokolünü takip ederek bir İnsülin ELISA testi ile glikoz ve depolarize edici çözelti inkübasyonlarından insülin içeriğini ölçün.
  7. Üreticinin protokolünü takip eden bir DNA tahlil kiti kullanarak adım 9.5'te toplanan ekstraksiyon tamponundan DNA içeriğini ölçün.
  8. İnsülin ölçümlerini DNA içeriğine göre normalleştirin.

10. İstatistiksel analiz

NOT: Grup karşılaştırmaları, bu yazıda açıklanan her bir test için n = 3 bağımsız değerlendirme ile aynı insan adacıkları grubunu ifade eder. Değerler Ortalama ± SD olarak ifade edilir.

  1. Hücreden arındırma ve DNA kalıntıları analizlerinin değerlendirilmesi için Mann-Whitney testini gerçekleştirmek için istatistiksel bir yazılım kullanın, doğal, hücreden arındırılmış pankreas ve çözünmüş ECM'yi karşılaştırın.
  2. Doğal, hücresi bozulmuş pankreas ve çözünmüş ECM arasındaki glikozaminoglikanların ve kollajenin değerlendirilmesi için eşleşmemiş bir t-testi gerçekleştirin.
  3. 8. günde adacık stimülasyonunun değerlendirilmesinde Glukoz Stimülasyon Testi için post-hoc Türkiye'nin çoklu karşılaştırmaları ile 2 yönlü bir ANOVA gerçekleştirin.
  4. *p < 0.05, **p<0.01, ***p < 0.001 ve ****p < 0.0001 ataması ile p < 0.05'te istatistiksel anlamlılığı düşünün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doğal ve aselüler pankreas örnekleri H&E, MT ve AB ile histolojik boyama için işlendi. H&E boyama, nükleer materyal ve hücrelerin tamamen yokluğunu gösterdi ve başarılı bir hücre gidermeyi doğruladı. MT ve AB boyamaları, sırasıyla kalitatif olarak kollajenöz ve stromal bileşenleri vurgulayarak ECM'nin çerçevesini gösterdi (Şekil 1).

Bu yöntem, insan pankreasından tutarlı bir ECM tozu üretilmesini sağladı. DNA miktar tayin testleri tatmin edici hücre kleren...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı, pankreas ECM'si üretmek için daha nazik, deterjan içermeyen bir hücre giderme protokolü geliştirmekti. Pankreas parankiminin ECM bileşenlerinin korunmasına ve hücre giderme işlemi sırasında geleneksel iyonik veya iyonik olmayan kimyasal deterjanlara uzun süre doku maruziyetinden kaçınılmasına dikkat edildi.

Geliştirilen hücre hücreden arındırma yönteminin en yenilikçi yönü, klasik iyonik ve iyonik olmayan kimyasal deterjanlardan kaçınılmas...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ortak yazarlardan herhangi biri tarafından beyan edilecek rekabet eden herhangi bir mali çıkar yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje, Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 Araştırma ve İnovasyon Programı'ndan 646272 No'lu hibe sözleşmesi kapsamında fon almıştır. İnsan Pankreas Adacıkları Prodo Laboratories, Aliso Viejo, CA 92656'dan elde edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Corning 1L Kolay Kavramalı Polistiren Saklama Şişeleri, 45 mm KapaklıThermoFisher430518Kabı, hücreden arındırma için kullanılır
Kriyojenik DeğirmenSPEX Certiprep6870-230
Sığır pankreasından Deoksiribonükleaz ISigma AldrichDN25
Damıtılmış SuThermoFisher15230147
Falcon 50mL Konik Santrifüj TüpleriCorning352070
İnsan Pankreasve
İnsülin-ElisaMercodia10-1113-01
Magnezyum Klorür, 1M, SterilBio-World41320004-1
Domuz mide mukozasından PepsinSigma AldrichP7012-5G
Kapaksız Plasenta Havzası, SterilDeRoyal32-881
Polipre kromatografi tüpleriBio-rad731-1500Polipropilen sütunlar
Quant-iT PicoGreen dsDNA Test KitiInvitrogenP7589DNA
Kiti SamplePrep Büyük Kapasiteli Dondurucu/Değirmen AksesuarıSPEX6801Büyük Öğütme Flakon Seti
Sephadex G-10 boncukCytiva17001001Jel Filtrasyon Reçinesi
UltraPur 0.5M EDTA, pH 8.0ThermoFisher15575020
UltraPur 1 M Tris-HCI Tamponu, pH 7.5ThermoFisher15567027
UltraPure DNase/RNase İçermeyen Distile SuThermoFisher10977023
,

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Korpos, E., et al. The peri-islet basement membrane, a barrier to infiltrating leukocytes in type 1 diabetes in mouse and human. Diabetes. 62 (2), 531-542 (2013).
  2. Daoud, J., Petropavlovskaia, M., Rosenberg, L., Tabrizian, M. The effect of extracellular matrix components on the preservation of human islet function in vitro. Biomaterials. 31 (7), 1676-1682 (2010).
  3. Rosenberg, L., Wang, R., Paraskevas, S., Maysinger, D. Structural and functional changes resulting from islet isolation lead to islet cell death. Surgery. 126 (2), 393-398 (1999).
  4. Paraskevas, S., Maysinger, D., Wang, R., Duguid, T. P., Rosenberg, L. Cell loss in isolated human islets occurs by apoptosis. Pancreas. 20 (3), 270-276 (2000).
  5. Hynes, R. O. The extracellular matrix: not just pretty fibrils. Science. 326 (5957), 1216-1219 (2009).
  6. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. J Cell Sci. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  7. Kuehn, C., Vermette, P., Fulop, T. Cross talk between the extracellular matrix and the immune system in the context of endocrine pancreatic islet transplantation. A review article. Pathologie Biologie (Paris). 62 (2), 67-78 (2014).
  8. Irving-Rodgers, H. F., et al. Pancreatic islet basement membrane loss and remodeling after mouse islet isolation and transplantation: impact for allograft rejection. Cell Transplant. 23 (1), 59-72 (2014).
  9. Tomei, A. A., et al. Device design and materials optimization of conformal coating for islets of Langerhans. Proceedings of the National Academy Science U. S. A. 111 (29), 10514-10519 (2014).
  10. Miao, G., et al. Basement membrane extract preserves islet viability and activity in vitro by up-regulating alpha3 integrin and its signal. Pancreas. 42 (6), 971-976 (2013).
  11. Peloso, A., et al. The human pancreas as a source of protolerogenic extracellular matrix scaffold for a new-generation bioartificial endocrine pancreas. Annals of Surgery. 264 (1), 169-179 (2016).
  12. Salvatori, M., et al. Extracellular Matrix Scaffold Technology for Bioartificial Pancreas Engineering: State of the Art and Future Challenges. Journal of Diabetes Science and Technology. 8 (1), 159-169 (2014).
  13. Mirmalek-Sani, S. H., et al. Porcine pancreas extracellular matrix as a platform for endocrine pancreas bioengineering. Biomaterials. 34 (22), 5488-5495 (2013).
  14. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2017).
  15. Sackett, S. D., et al. Extracellular matrix scaffold and hydrogel derived from decellularized and delipidized human pancreas. Science Reports. 8 (1), 10452(2018).
  16. Jiang, K., et al. 3-D physiomimetic extracellular matrix hydrogels provide a supportive microenvironment for rodent and human islet culture. Biomaterials. 198, 37-48 (2019).
  17. Citro, A., et al. Biofabrication of a vascularized islet organ for type 1 diabetes. Biomaterials. 199, 40-51 (2019).
  18. Hashemi, J., et al. Application of a novel bioreactor for in vivo engineering of pancreas tissue. Journal of Cell Physiology. 233 (5), 3805-3816 (2018).
  19. Guruswamy Damodaran, R., Vermette, P. Decellularized pancreas as a native extracellular matrix scaffold for pancreatic islet seeding and culture. Journal of Tissue Engineering and Regeneration Medicine. 12 (5), 1230-1237 (2018).
  20. Thivolet, C. H., Chatelain, P., Nicoloso, H., Durand, A., Bertrand, J. Morphological and functional effects of extracellular matrix on pancreatic islet cell cultures. Experimental Cell Research. 159 (2), 313-322 (1985).
  21. Llacua, L. A., Faas, M. M., de Vos, P. Extracellular matrix molecules and their potential contribution to the function of transplanted pancreatic islets. Diabetologia. 61 (6), 1261-1272 (2018).
  22. Orlando, G., et al. Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes. Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).
  23. Chaimov, D., et al. Innovative encapsulation platform based on pancreatic extracellular matrix achieve substantial insulin delivery. Journal of Control Release. 257, 91-101 (2016).
  24. Hadavi, E., et al. Microwell Scaffolds Using Collagen-IV and Laminin-111 Lead to Improved Insulin Secretion of Human Islets. Tissue Engineering Part C Methods. 25 (2), 71-81 (2019).
  25. Crisostomo, J., et al. ECM-enriched alginate hydrogels for bioartificial pancreas: an ideal niche to improve insulin secretion and diabetic glucose profile. Journal of Applied Biomaterial and Functional Mater. 17 (4), 2280800019848923(2019).
  26. Davis, N. E., et al. Enhanced function of pancreatic islets co-encapsulated with ECM proteins and mesenchymal stromal cells in a silk hydrogel. Biomaterials. 33 (28), 6691-6697 (2012).
  27. Carlo, D. Pancreatic acellular matrix supports islet survival and function in a synthetic tubular device: In vitro and in vivo studies. International Journal of Molecular Medicine. 25 (2), (2009).
  28. Freytes, D. O., Martin, J., Velankar, S. S., Lee, A. S., Badylak, S. F. Preparation and rheological characterization of a gel form of the porcine urinary bladder matrix. Biomaterials. 29 (11), 1630-1637 (2008).
  29. Orlando, G., et al. Discarded human kidneys as a source of ECM scaffold for kidney regeneration technologies. Biomaterials. 34 (24), 5915-5925 (2013).
  30. Afara, I. O., Prasadam, I., Arabshahi, Z., Xiao, Y., Oloyede, A. Monitoring osteoarthritis progression using near infrared (NIR) spectroscopy. Science Reports. 7 (1), 11463(2017).
  31. Tendulkar, S., et al. A scalable microfluidic device for the mass production of microencapsulated islets. Transplantation Protocol. 43 (9), 3184-3187 (2011).
  32. Fraker, C. A. The Role of Oxygen During In Vitro Culture and Immunoisolation of Islets of Langerhans. University of Miami. , PhD Thesis (2011).
  33. Keane, T. J., Londono, R., Turner, N. J., Badylak, S. F. Consequences of ineffective decellularization of biologic scaffolds on the host response. Biomaterials. 33 (6), 1771-1781 (2012).
  34. Edgar, L., et al. Utility of extracellular matrix powders in tissue engineering. Organogenesis. , 1-15 (2018).
  35. Katari, R., et al. Current Developments in Biotechnology and Bioengineering. , 325-347 (2017).
  36. Peloso, A., Katari, R., Tamburrini, R., Duisit, J., Orlando, G. Glycosaminoglycans as a measure of outcome of cell-on-scaffold seeding (decellularization) technology. Expert Reviews on Medical Devices. 13 (12), 1067-1068 (2016).
  37. Pineda Molina, C., Lee, Y. C., Badylak, S. F. Transplantation, Bioengineering, and Regeneration of the Endocrine Pancreas. , 527-536 (2020).
  38. Thomas, F. T., et al. Anoikis, extracellular matrix, and apoptosis factors in isolated cell transplantation. Surgery. 126 (2), 299-304 (1999).
  39. Kenmochi, T., et al. Improved quality and yield of islets isolated from human pancreata using a two-step digestion method. Pancreas. 20 (2), 184-190 (2000).
  40. Lamb, M., et al. In vitro maturation of viable islets from partially digested young pig pancreas. Cell Transplant. 23 (3), 263-272 (2014).
  41. Stendahl, J. C., Kaufman, D. B., Stupp, S. I. Extracellular matrix in pancreatic islets: relevance to scaffold design and transplantation. Cell Transplant. 18 (1), 1-12 (2009).
  42. de Vos, P., et al. Enzymes for Pancreatic Islet Isolation Impact Chemokine-Production and Polarization of Insulin-Producing beta-Cells with Reduced Functional Survival of Immunoisolated Rat Islet-Allografts as a Consequence. PLoS One. 11 (1), 0147992(2016).
  43. Smink, A. M., de Vos, P. Therapeutic Strategies for Modulating the Extracellular Matrix to Improve Pancreatic Islet Function and Survival After Transplantation. Current Diabetes Report. 18 (7), 39(2018).
  44. Orlando, G., Soker, S., Stratta, R. J. Organ bioengineering and regeneration as the new Holy Grail for organ transplantation. Annals of Surgery. 258 (2), 221-232 (2013).
  45. Orlando, G., et al. Rethinking Regenerative Medicine From a Transplant Perspective (and Vice Versa). Transplantation. 103 (2), 237-249 (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production
Posted by JoVE Editors on 12/10/2020. Citeable Link.

An erratum was issued for: Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production. The author list was updated.

The author list was updated from:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Kevin Enck3, Sean M. Muir4, Justine Mariam Aziz5, Sandrine Lablanche6, Emily Tubbs6, Alice A. Tomei7,8, Mark Van Dyke9, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center,
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia,
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine,
4Wake Forest University College of Arts and Science,
5Wake Forest University School of Medicine,
6Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University,
7Department of Biomedical Engineering, University of Miami,
8Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine,
9Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

to:

Riccardo Tamburrini1,2,3, Deborah Chaimov1,3, Amish Asthana1,3, Carlo Gazia3,4, Kevin Enck3, Sean M. Muir5, Justine Mariam Aziz6, Sandrine Lablanche7, Emily Tubbs7, Alice A. Tomei8,9, Mark Van Dyke10, Shay Soker3, Emmanuel C. Opara3, Giuseppe Orlando1,3
1Department of Surgery, Wake Forest Baptist Medical Center, 
2Department of General Surgery, PhD Program in Experimental Medicine, University of Pavia, 
3Wake Forest Institute for Regenerative Medicine, Wake Forest School of Medicine, 
4Department of Surgery, Tor Vergata University of Rome
5Wake Forest University College of Arts and Science, 
6Wake Forest University School of Medicine, 
7Laboratory of Fundamental and Applied Bioenergetics (LBFA), and Environmental and System Biology (BEeSy), Grenoble Alps University, 
8Department of Biomedical Engineering, University of Miami, 
9Diabetes Research Institute, University of Miami Miller School of Medicine, 
​10Department of Biomedical Engineering and Mechanics, School of Biomedical Engineering and Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University

Etiketler

Pankreas Desel larizasyonuDeterjan ermeyen Y ntemAdac k TransplantasyonuAdac k zolasyonuECM skeleDNA Temizli iPankreas Adac klarns lin Sal n mBeta H cresi Replasman
Video yakında

İlgili makaleler