Burada yetişkin fare testislerinden canlı meiotik ve post-meyotik mikrop hücrelerini izole etmek için basit ve etkili bir yöntem salıyoruz. Düşük sitotoksisite, menekşe heyecanlı DNA bağlayıcı boya ve floresan-aktive hücre sıralama kullanarak, bir birçok downstream uygulamaları için son derece zenginleştirilmiş spermatojenik hücre popülasyonları izole edebilirsiniz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Mor-Heyecanlı Hücre-Geçirgen DNA Bağlayıcı Boya Kullanılarak Murine Spermatojenik Hücrelerin İzolasyon
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Meyozis ve spermatogenezin altında yatan moleküler mekanizmaları araştırmak için meyotik spermatositlerin izolasyonu esastır. Floresan aktive hücre sıralama ile birlikte Hoechst 33342 boyama kullanarak kurulmuş hücre izolasyon protokolleri olmasına rağmen, ultraviyole lazer ile donatılmış hücre ayırıcılar gerektirir. Burada, Hoechst 33342'ye benzer yapısal olarak benzeyen düşük sitotoksisite DNA bağlayıcıboyası Olan DyeCycle Violet (DCV) lekesi kullanılarak bir hücre izolasyon protokolü tanımlanmaktadır. DCV hem ultraviyole hem de mor lazerler tarafından heyecanlı olabilir, hangi ekipman seçimi esnekliğini artırır, ultraviyole lazer ile donatılmış olmayan bir hücre ayırıcı dahil. Bu protokolü kullanarak, leptoten/zigotene, pachytene ve diplotene spermatositler de dahil olmak üzere meyotik profaz I'de üç canlı hücre alt popülasyonunu ve post-meiyotik yuvarlak spermatidleri izole edebilir. Ayrıca fare testislerinden tek hücreli süspansiyon hazırlamak için bir protokol açıklarız. Genel olarak, yordamın tamamlanması için kısa bir süre (gerekli hücrelerin sayısına bağlı olarak 4-5 saat), birçok downstream uygulamaları kolaylaştırır gerektirir.
Giriş
Spermatogenez spermatogonial kök hücrelerin küçük bir popülasyon yetişkinyaşam1,2boyunca sperm çok sayıda sürekli üretimini sürdürmek karmaşık bir süreçtir. Spermatogenez sırasında, dinamik kromatin remodeling spermatojenik hücreler haploid spermatidsüretmekiçin meyozis geçmesi gerçekleşir 3,4,5. Meyotik spermatositlerin izolasyonu moleküler araştırma için gereklidir ve sedimantasyona dayalı ayırma6,7 ve floresanaktif hücre ayrıştırma (FACS)8....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin yönergelerini takip eder (protokol no. IACUC2018-0040) Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi'nde.
1. Testis hücre süspansiyonu hazırlanması için ekipman ve reaktif kurulumu
- Her enzim stoğunu 1x Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) olarak hazırlayın ve -20 °C.'de saklayın (Tablo1).
NOT: Denemeden önce herhangi bir zaman hazırlayın. - Deneyden bir gün önce: Bir gecede 4 °C'de Fetal büyükbaş serumu (FBS) ile palto toplama tüpleri (1,5 mL tüpler).
- Deney günü: Su banyosunu 37 °C'ye ayarlayın.
- Pre-sıcak Dulbecco's Modifiye Kartal....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu sıralama protokolünün temsili bir sonucu Şekil 3'tegösterilmiştir. İki testisin (bir fare) toplam sıralama süresi genellikle hücre süspansiyonunun konsantrasyonuna ve sıralama hızına bağlı olarak yaklaşık 3 saattir. Sıralamadan sonra spermatositlerin saflığı SYCP3 ve γH2AX(Şekil 3A)
.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada spermatosit ve spermatid alt popülasyonlarını tek bir yetişkin erkek fareden izole etmek için pratik ve basit bir protokol salıyoruz. Bu protokolün tekrarlanabilirliğini sağlamak için dikkat gerektiren bazı kritik adımlar vardır. Enzim sindiriminden önce, yıkama adımı interstisyel hücreleri ortadan kaldırmayı amaçlar; sindirim sonra, bu adım spermatozoa ve enkaz kaldırmak için yardımcı olur. Yıkama / santrifüj 3 kez önemlidir. Bizim dissosyasyon tampon tarifi, birkaç farklı enzimlerin kombinasyonu aşırı hücre hasa.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar hiçbir rakip çıkarları olduğunu beyan.
Teşekkürler
Biz Yardımları için Namekawa, Yoshida ve Maezawa laboratuvarları üyelerine teşekkür ederiz; Katie Gerhardt el yazması düzenleme için; Mary Ann Handel H1T antikor paylaşımı için, Cincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi (CCHMC) Araştırma Akış Sitometri Core NIH S10OD023410 tarafından desteklenen FACS ekipman paylaşımı için; T.N.'ye Bilimsel Araştırma Yardımı (KAKENHI; 17K07424); Lalor Vakfı Doktora Sonrası Bursu A.Ş.'ye; AMED-CREST (JP17gm1110005h0001) için S.Y.; Azabu Üniversitesi Araştırma Hizmetleri Bölümü, Milli Eğitim Bakanlığı, Kültür, Spor, Bilim ve Teknoloji Bakanlığı (MEXT)-Özel Üniversite Araştırma Markalaşma Projesi Destekli Programı (2016-2019), Araştırma Faa....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1,5 ml tüp | Watson | 131-7155C | |
| 100 mm Petri kabı | Corning, Falcon | 351029 | |
| 15 mL Santrifüj tüpü | Watson | 1332-015S | |
| 5 ml polistiren tüp, hücre süzgeci geçmeli kapaklı (35 & mikro; m naylon ağ | ) Corning, Falcon | 352235 | |
| 50 mL Santrifüj tüpü | Watson | 1342-050S | |
| 60 mm Petri kabı | Corning, Falcon | 351007 | |
| 70 & mikro; m naylon örgü | Corning, Falcon | 352350 | |
| Hücre sıralayıcı | Sony | SH800S | |
| Santrifüj | |||
| Kollajenaz, rekombinant, Hayvansal | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-23141 | |
| Kollajenaz, Tip 1 | Worthington | LS004196 | |
| Kapak camı | Fisher | 12-544-G | |
| Cytospin 3 | Shandon | ||
| DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) | Fisher | D1306 | çalışma konsantrasyonu: 0.1 & mu; g/mL |
| Dnase I | Sigma | D5025-150KU | |
| Eşek serumu | Sigma | S30-M | |
| Dulbecco' s fosfat tamponlu salin (DPBS) | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco'nun Modifiye Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11885076 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Gibco | 16000044 | |
| Mary Ann Handel'den | histon H1t antikoru | 1/2000 seyreltilmiş | |
| Hank' S dengeli tuz çözeltisi (HBSS) | Gibco | 14175095 | |
| Hyaluronidaz | Sigma | H3506-1G | |
| Fosfat tamponlu salin (PBS) | Sigma | P5493-4L | |
| Pipettemen | |||
| ProLong Altın Antifade Mountant | Fisher | P36930 | |
| rH2AX antikoru | Millipore | 05-635 | Çalışma konsantrasyonu: 2 & mu; g / mL |
| Sperm Döllenme Proteini 56 (Sp56) antikoru | QED Bioscience | 55101 | çalışma konsantrasyonu: 0.5 & mu; g / mL |
| Sterilize forseps ve makas | |||
| Superfrost / Plus Mikroskop Slaytları | Fisher | 12-550-15 | |
| SYCP3 antikoru | Abcam | ab205846 | çalışma konsantrasyonu: 5 μ g/mL |
| TWEEN 20 (Polisorbat 20) | Sigma | P9416 | |
| Vybrant DyeCycle Menekşe Lekesi (DCV) | Invitrogen | V35003 | |
| Su banyosu |
Kaynaklar
- Griswold, M. D. Spermatogenesis: The Commitment to Meiosis. Physiological Reviews. 96 (1), 1-17 (2016).
- Yoshida, S. Mouse Spermatogenesis Reflects the Unity and Diversity of Tissue Stem Cell Niche Systems. Cold Spring Harbor Perspectives ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
