Yöntem makalesi

Miyokard Enfarktüsü'nün Murine Modelinde 3Boyutlu Biyobaskılı Yama Transplantasyonu

DOI:

10.3791/61675

⸱

26 Eylül 2020

 , 
1The University of Sydney, 2University of Technology Sydney (UTS), 3The Royal North Shore Hospital, 4University Hospital of Wales

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kalp yetmezliği ni modelleyen enfarktan farelerin epikardiyumuna 3Boyutlu biyobaskılı bir yama naklini amaçlamaktadır. Anestezi, cerrahi göğüs açıklığı, sol anterior inen kalıcı ligasyon (LAD) koroner arter ve kalbin enfarktüs bölgesine biyobbaskılı bir yama uygulaması ile ilgili ayrıntıları içerir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalıcı sol anterior alçalan (LAD) ligasyonu ile kalp yetmezliği nin murine modellerini kullanarak in vivo 3D biyoprinted kardiyak yamalar rejeneratif özellikleri test zorlu bir işlemdir ve doğası nedeniyle yüksek mortalite oranına sahiptir. Biyobasılan hücre ve hidrojelleri, rejeneratif özelliklerini sağlam ve uygulanabilir bir şekilde test etmek için enfarktan fare kalbinin epikardiyumuna sürekli olarak nakletmek için bir yöntem geliştirdik. İlk olarak, derin anestezili fare dikkatle entübe ve havalandırılır. Sol lateral torakotomi (göğüs cerrahi açılış) sonra, maruz LAD kalıcı olarak ligated ve biyobaskılı yama epikardiyum üzerine nakledilir. Fare göğüs kapanmasından sonra işlemden hızla kurtulur. Bu sağlam ve hızlı yaklaşımın avantajları arasında tahmin edilen 28 günlük mortalite oranı %30'a kadardır (farelerde benzer bir kalıcı LAD ligasyonu modeli kullanılarak diğer çalışmalarda bildirilen %44'ten daha düşük). Ayrıca, bu protokolde açıklanan yaklaşım çok yönlüdür ve biyobbaskılı yamaları, çalışmaları en iyi şekilde sağlamak için yüksek sayıda hayvanın ihtiyaç duyulduğu farklı hücre tipleri veya hidrojeller kullanarak test etmek için uyarlanabilir. Genel olarak, kardiyak rejenerasyon ve doku mühendisliği alanında gelecekteki çalışmalarda klinik öncesi testleri değiştirebilecek avantajlı bir yaklaşım olarak sarıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp nakli, son dönem kalp yetmezliği olan hastalar için altın standart tedavidir ancak organ bağışı sıkıntısı vardır. Bu greft reddi önlemek için bağışıklık sistemi baskılanması gerektirir ve bir yıllık mortalite oranı% 15 dünya çapında1. Bu nedenle, insan deneyleri,,,,,,2,3,4,5,6,7,8,9tercüme bir görünüm ile preklinik hayvan modellerinde miyokardiyum yeniden uzun süredir teşvik vardır. Kök hücre veya kök hücre kaynaklı kalp hücrelerinin 3D biyobaskı son gelişmeler miyokard22,3,9,,10,11,12yeniden umut verici bir yaklaşım olarak dikkat kazanmıştır.

Kalbi yenilemek için yamalar uygulayan ilk insan güvenliği denemeleri bildirilmiştir, otolog kemik iliği mononükleer hücreler kollajen veya embriyonik kök hücre kaynaklı kardiyak progenitor hücrelerinde fibrin askıya ile, epikardiyum nakledilen7,8,13. Ancak, daha hassas, ölçeklenebilir, otomadist ve tekrarlanabilir bir yöntem için, kalbin epikardiyal yüzeyine uygulanacak optimize hidrojel yamalar 3D biyobaskı aksi takdirde bir kalp nakli 2 gerekir hastalar için miyokardiyum yeniden umut verici bir yaklaşımdır2,10,11,12.

İnsan deneylerine çeviri yapmadan önce klinik öncesi hayvan çalışmaları gereklidir. Miyokardrerereing preklinik in vivo modelleridomuzlarda bildirilmiştir 5, koyun14,sıçanlar 6 ve fareler4. Farelerde miyokard enfarktüsü ortak bir model (MI) sol anterior inen kalıcı ligasyon kullanır (LAD) koroner arter15,16. Kullanılan farelerin farklı suşları arasında, C57BL6 farelerde kalıcı LAD ligasyonu kabul edilebilir bir sağkalım oranına sahiptir ve genellikle MI16'dansonra tutarlı remodeling ve kardiyak değişiklikler sunar. Kemirgen modellerinde, hasarlı miyokardinin etkin rejenerasyonu için kalbe kardiyak dokunun uygulandığı çeşitli yaklaşımlar tanımlanmıştır4,6,17. Büyük hayvanlar hala kardiyak rejeneratif özellikleri test etmek için daha klinik olarak ilgili bir modeli temsil ederken5,14, fare modelinin çok yönlülük ve fizibilite çalışma bu hızlı hareket alanına kendini ödünç. Bu da dahil olmak üzere büyük hayvan çalışmaları tipik tuzaklar bazı önleyebilirsiniz (ama sınırlı değildir): 1) yüksek hayvan ölümleri (diyagonal koroner arterler öngörülemeyen segmental enfarktlara yol açan ligated sürece14, ya da LAD distal sonu kalıcı ligasyon yerine reperfüzyon takip tıkanmış5); 2) fareler18ile karşılaştırıldığında büyük hayvan protokolleri neden nispeten artan zarar ile etik sorunlar ; 3) artan maliyet ve / veya fizibilite sorunları, örneğin MRTarayıcılar14gibi büyük hayvan ekipmanları göreli kullanılamazlık . Büyük hayvan çalışmalarının tipik geniş süresi ve bağlılığı göz önüne alındığında, özellikle bu alanın tipik hızlı gelişmeleri ile, onlar bitmeden önce modası geçmiş olma potansiyeline sahip olduğunu dikkate almak önemlidir. Örneğin, sadece son zamanlarda kritik rolü inflamatuar hücreler ve arabulucuların kardiyak rejenerasyon düzenleyen oynadığı ortaya çıkmıştır19,20. Ayrıca, küçük hayvan modelleri gibi klinik öncesi çalışmaların kritik rolü, insan deneyleri geçmeden önce sağlam bilgi kazanmak için önemli bir adım olarak bir Lancet Komisyonu tarafından vurgulanmıştır21.

Anımsanma mekanizmalarının anlaşılmasında ve yama bazlı kardiyak rejenerasyon yaklaşımlarının en iyi duruma edilmesinde ilerlemeyi kolaylaştırmak için, C57BL6 farelerinde 3Boyutlu biyobaskılı aljinat/jelatin hidrojel yaması uygulamak için 'kepçe ve perde' yöntemini açıklayan yeni bir yaklaşım salıyoruz. Bu yaklaşımın amacı, kardiyak rejenerasyon2hızla gelişen alan için geniş araştırma bağlamlarında uygulanabilir olması muhtemeldir 3D biyobaskılı yamaları test etmek için çok yönlü bir in vivo modeli sağlamaktır. Bu yöntem, in vivo yamaları içinde biyobaskı dışı yöntemler, farklı hidrojeller ve otolog veya allojenik kök hücre kaynaklı hücreler tarafından oluşturulan yamalar test etmek için uyarlanabilir. Ancak, biyobaskı, hidrojeller veya hücre tiplerinin ayrıntılı olarak değerlendirilmesi, cerrahi transplantasyon yöntemine odaklanan bu çalışmanın kapsamı dışındadır.

Protokolün avantajları arasında miyokard enfarktüsü ve biyoprinted yama uygulamasının hızlı bir şekilde yapilebilen bir cerrahi işlemde, hazır, uygun maliyetli laboratuvar araçları yla ve nispeten düşük mortalite oranıyla yapılması yer almaktadır. Ayrıca genellikle daha küçük bir alanda büyük hayvan modelleri ne kadar çok hayvan için izin verir, hangi birden fazla deneysel grupların sağlam karşılaştırma sağlar, özellikle vivo birden fazla grup karşılaştırma için yararlıdır. Öte yandan, bu protokol dezavantajları vardır: 1) fare modeli daha büyük hayvan modelleri daha insan kalp boyutu, anatomi ve fizyolojiuzak ve doğrudan insanlara çevirmek değildir; 2) murine LAD dalları proksimally, bireysel fareler arasında önemli değişkenlik ile, hangi infarkt boyutu değişkenlik yol açar (büyük hayvan modelleri ile paylaşılan bir sorun); 3) yama belirli bir enfarktüs alanı üzerinde uygulayarak daha az hassas tüm ön kalp yüzeyi üzerinde uygulanmalıdır; ve 4) yama MI sırasında hemen uygulanır (insan kullanımı için ilk MI14aşağıdaki kronik enfarktokiflas kalp ay uygulama için bir yama geliştirmek için klinik olarak daha yararlı olması muhtemeldir).

Bununla birlikte, test edilen hipoteze göre uygun şekilde seçilirse, bu protokol çoğu laboratuvarda bulunan malzeme, bütçe ve uzmanlıkla tutarlı bir şekilde, yüksek n sayılarla hızlı bir şekilde kritik in vivo verileri sağlayabilir. Büyük hayvan modelleri ile karşılaştırıldığında, gelişmekte olan 3D biyobaskı teknolojilerine uyum sağlayacak kadar çok yönlü bir in vivo modelidir (örneğin, daha büyük hayvan modellerine geçmeden önce fizibilite ve güvenliği test etmek için pilot çalışmalar yapmanın göreceli kolaylığı). Bu iyi vivo veri verimli ve ucuz, belki de farklı biyobaskı parametreleri, hücreler veya yamalar hidrojeller ile 3D biyobaskılı yamalar birden fazla karşılaştırma lar çalışan oluşturmak isteyen araştırmacılar için uygun olacaktır. Özellikle pahalı hücre soylarının veya büyük ölçekli yamalar kullanılarak oluşabilecek diğer malzemelerin aşırı israfı olmadan in vivo hidrojeller ile kök hücre ve kök hücre kaynaklı hücrelerin farklı karışımlarının etkileşimlerini test etmek için yararlı olacaktır. Fare modeli kullanmak, türlerle uyumlu fare kaynaklı hücre ve kök hücre soylarını veya belirli bir bağışıklık eksikliği olan tek tip farelerin arzu edildiği insan kaynaklı hücreleri içeren yamalar test ini de kolaylaştırır. Ayrıca, genetiği değiştirilmiş fare suşları test araştırmacılar sinyal yolları ve kardiyovasküler hastalık ile ilgili belirli hücre tipleri üzerinde belirli genlerin etkilerini izole etmek için izin verebilir, hangi şu anda büyük bir hayvan modelinde mümkün olmaz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneyde açıklanan tüm prosedürler Kuzey Sidney Yerel Sağlık Bölgesi, NSW, Avustralya'daki Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanmıştır (proje numarası RESP17/55).

1. Anestezi ve entübasyon

NOT: Stereomikroskobu, ısı yastığını (emici bir levha ile kaplı) ve ventilatör sistemini açın ve ayarlayın.

  1. Temiz eldivenler, cerrahi bölge ve %70 etanollü aletler.
  2. İntraperitoneal yol (ketamin 40 mg/kg, ksilazin 5 mg/kg, atropin 0.15 mg/kg) tarafından enjekte edilen anestezinin dozajını hesaplamak için fareyi tartın ve enjeksiyonu verin.
  3. Fare derin bir anestezi düzlemine ulaştığında, toraksın sol tarafını bir düzeltici ile tıraş edin.
  4. Fareyi %2 izofluran içeren bir odaya yerleştirin (odada yeterli ekstraksiyon havalandırması sağlayın).
    NOT: Ketamin/ksilazin enjeksiyonunun %2 izofluran inhalasyonu ile birlikte nispeten düşük dozda olması fareyi uyandırmadan optimum entübasyona izin verirken farenin ölüm riskini azaltır.
  5. Fareyi supine yerleştirin ve videoda gösterildiği gibi, tezgaha bantlanmış bir 3.0 dikiş ile üst kesici dişleri onu dizginlemek. Bir parmak sıkışması gerçekleştirerek sedation onaylayın. Orofarenksin görüntülenebilmeleri için fare boynunun üzerine yüksek yoğunluklu bir aydınlatıcı yerleştirin.
    NOT: Alternatif olarak, fare entübasyon kitinden (örneğin, Kent Mouse Entübasyon Kiti) üst kesici dişlerin altına sabitlenmiş elastik bir bantla ses trakeasını tanımlamak için ağzı açık tutmak için standa yerleştirilebilir.
  6. Çeneyi açmak için kavisli bir spatula ve dili yavaşça kaldırmak için başka bir çift spatula/künt forseps kullanın. Faregövdesi ile göz hizasında veya biraz altında konumlandırılırken entübe edindiğinden emin olun.
  7. Ses tellerinin açılıp kapanmasını görselleştirin. Açıldığında, entübasyon kiti ile birlikte verilen 20 G plastik kateteri takın.
  8. Entübdeki fareyi ısıtma yastığı ile donatılmış bir çalışma yüzeyine dikkatlice aktarın. Fareyi fare nin ağırlığına göre hedef hacmi otomatik olarak ayarlayan ventilatöre (örn. MouseVent) bağlayın.
  9. Oksijen ile % 1.5-2 isofluran sağlayın (otomatik olarak ventilatör tarafından düzenlenir: 1-2 L/dk akış hızında oksijen silindirinden otomatik ventilatöre bir bağlantı olduğundan emin olun). Çift taraflı göğüs yükselmesi için kontrol ederek entübasyon doğrulayın. Bir parmak sıkışması gerçekleştirerek anestezi doğrulayın.
  10. Kurumasını önlemek için her iki göze opthalmik merhem (örneğin, Puralube Veteriner Opthalmic Merhem) uygulayın.

2. Cerrahi alanın hazırlanması

  1. Entübasyon tüpünü ventilatör ile solunum tüpü/kateter arasındaki bağlantı yerinde bantla sabitleyin.
  2. Daha uzun bir bant parçasını kesin ve sol ön ayağını hafifçe yüksek bir pozisyonda çalışma yüzeyine sabitleyin. Ayrıca diğer ekstremiteleri bantlayın.
  3. Steril% 70 isopropanol ve povidone iyot çözeltisi ile göğüs temizleyin, dairesel bir hareketle merkezinden çevreye hareket temizlik.
  4. Anesteziyi bir kez daha bir parmak ucutu ile doğrulayın.
  5. 0.08 mg/kg Temvet (buprenorfin) 0.1 mL deri altı enjeksiyon ile %0.9 tuzlu.

3. Sol lateral torakotomi

  1. Belirgin ksifoid kıkırdağın yaklaşık 5 mm solunda bir noktada cildi hafifçe kaldırmak için ince uçlu forsepskullanın. Bu noktadan yukarıya ve orta hatta doğru, manubrium seviyesine doğru deride bir süperomedial kesi oluşturmak için cerrahi makas kullanın.
  2. Yavaşça cilt ve kas katmanları ayırmak için kavisli forceps kullanın. Deri kesisini takip ederek kas tabakasını açın.
  3. Üçüncü interkostal alanda, göğüs kafesinin doğal açısını izleyerek bir kesi belirleyin ve yapın.
  4. 3. ve 4. kaburgaları yavaşça ayırmak için retraktör kullanın.
  5. İnce perikard'ı forceps ile hafifçe çıkarın.
  6. LAD görselleştirilmezse, yavaşça sol auricle itin (Ek Şekil 1bakınız ) yukarı ve altında koroner arterler bulmak.

4. Sol anterior inen (LAD) kalıcı koroner arter ligasyonu

  1. Bir ~ 3 mm uzunluğunda 3-0 ipek dikiş kesin ve LAD aynı yönde LAD üstüne bu takviye 3-0 ipek dikiş parçası koymak (zaman noktasında video gösterildiği gibi 02:12 – 02:20).
  2. LAD tanımlayın ve LAD altında 7-0 ipek dikiş geçmek. LAD açıkça görselleştirilemezse, kalbin dinamik hareketi sırasında sol auricle ucu tarafından ulaşılan alt noktaya iğne 1 mm inferior ve medial ekleyin.
    NOT: Bu yapı kalbin ventriküler odaları na daha açık bir renk kırmızı ama bitişik akciğer daha koyu ve en iyi zaman noktasında video görselleştirilmiş 01:54 – 01:55 nerede sadece retraktör üstün kol aşağı görünür, sol akciğer üstün (açıklamalı video hala görüntü için Ek Şekil 1 bakınız).
  3. 7-0 ipek dikiş ile iki atar tamamlayın ve sıkıca lad güvenli destekleyici 3-0 ipek dikiş üstüne geçen kapatın. Ligasyon başarılı olursa, ligatür gelen anterior ventriküler alan distal blanch olacaktır.
  4. Sütüre yukarı doğru çekme kuvveti aktarılmamasını sağlamak için düğümü ters yönde üçüncü bir atışla tamamlayın. Dikiş keserek miyokard veya LAD'ye zarar verme riskini azaltmak için ek atışlara gerek yoktur.

5. Biyobasılan yaamanın epikardiyumüzerine nakli

  1. Biyobonlu yamayı altı kuyu plakasından enfarkt alanına, açılmış bir cerrahi neşter paketinin steril iç yüzeyini kullanarak dikkatlice hareket ettirin.
  2. Biyobonlu yamayı, sol ventrikül ve enfarktüs bölgesini (beyazlatılmış alan) kaplayan, tüm yüzeyi kaplayacak ve alt ve lateral kenarlar üzerinde perdeleme lisi olan ön epikardiyal yüzeye dikkatlice yerleştirin.
  3. Keskin kenarları kalbe doğru yönlendirmeden retraktörü yavaşça kapatın ve çıkarın.
  4. Göğüs kafesi ve kas tabakaları kapatmak için basit bir kesme desen 6-0 prolene dikişkullanın.
  5. 6-0 prolene dikişleri ile göğüs kapatırken Sigh Breath fonksiyonu ile, aksi takdirde göğüs boşluğunda sıkışıp olur ve bir pnömotoraks neden plevral kavite aşırı hava kaldırmak için akciğerleri şişirmek.
  6. Göğsün sıkıca kapatılmış olduğundan emin olun.
  7. Isoflurane'yi %1.0'a düşürün. Basit bir kesme desen 6-0 prolene dikişler ile cildi kapatın. Isoflurane buharlaştırıcıyı kapatın.

6. Fare kurtarma

  1. Topikal insizyon için% 0.9 salin 2 mg / mL bupivacaine uygulayın. Ayrıca uygulayın: i) Antisedan (atipamezole) 1 mg/kg; ii) Lasix (furosemid) 8 mg/kg; iii) Deri altı enjeksiyon ile %0,9 tuzlu çözeltinin 600 μL'si.
    NOT: Antisedan anesteziyi daha hızlı tersine çevirmektir; furosemid, kardiyak debi uzaması ve ilaç enjeksiyonları ile uygulanan ek sıvı nedeniyle fazla sıvı boşaltmaktır.
  2. Fareyi izleyin ve fareyi entübasyon tüpünden çıkarmak için bağımsız nefes alma gözlemlenene kadar bekleyin.
  3. Fare yeterli bir çift taraflı solunum hızı ve derinliği gösterdiğinde ve bir parmak sıkışmasına yanıt verdiğinde, fareyi Bir ısı yastığına yerleştirilen temiz bir kurtarma kafesine yerleştirin.
  4. Fareye nemli gıdalar (çiğnenebilirlik için nemlendirilmiş), su şişesi ve besin/nemlendirici jel sağlayın. Abartılı bir nefes alma çabası, aşırı kanama veya hayatı tehdit edebilecek diğer komplikasyonları izleyin.
  5. Sonraki üç gün boyunca, 0.08 mg/kg Temvet (buprenorfin) 0.1 mL deri veya intraperitoneal enjeksiyon yoluyla %0.9 tuzlu, günde iki kez, sonra işlemden sonraki beşinci güne kadar günde bir kez uygulayın.
  6. Ev fareleri, dövüş davranışlarını önlerken izolasyondan korunmak için kafes bölücüleri tarafından ayrılmış çiftler halinde. Fareleri deneylerin sonuna kadar en az her gün (28 gün) sağlıklarına yakın bir önem vererek ve herhangi bir endişe varsa izleme sıklığını artırarak izleyin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Transplantasyon sırasında, yamanın oda sıcaklığında (ek çapraz bağlantı uygulanmadan) viskozitesi, kalbin konturları üzerinde 'perde' yapmasınavekardiyak döngü ile dinamik olarak hareket etmesine olanak sağlar. Ameliyattan sonra, çalışmalar ev sahibi kardiyak fonksiyon3,,4 (tam fonksiyonel etkileri transplantasyondan sonra üç ay kadar görülemeyebilir bildirilmiştir rağmen)22yama etkileri için izin uygun bir süre olarak çalışmalar bu uygun bir süre olarak vivo 28 gün boyunca yamalar bıraktı . Şekil 1'de fare kalbinde yerinde gösterilen bir yamanın fotoğrafı, uygulamadan hemen sonra, yamanın transplantasyon sırasında kalbin üzerine örtme yeteneğini gösteren olarak çekildi. Bu temsili sonuç, hidrojelin yamanın kalbin hatlarına kalıplanmasına izin verdiğini ve aşırı gerilimin meydana geldiği durumlarda hidrojelin Şekil 1'deki çıplak (hidrojelsiz) üçgen alan (görüntüdeki siyah bir yıldızla gösterilir) tarafından gösterildiği gibi bölünebildiğini göstermektedir. Hayatta kalma verileri (Kaplan-Meier sağkalım eğrileri) Şekil 2'de sahte bir prosedüre tabi tutulan farelere göre gösterilmektedir (fare göğsünün kapanmasını takip eden ligasyon olmadan LAD altında iğne ve dikiş geçişi).

figure-results-1
Şekil 1: C57BL6 fare kalbinin epikardiyumuna uygulanan biyobaskılı kardiyak yama. Hidrojel (aljinat %4 (w/v)/jelatin %8 (w/v) içeren 10 mm x 10 mm x 0,4 mm biyobaskılı yama (transplantasyondan hemen sonra) enfarktüs alanının üzerine örtülü ve epikardiyal yüzeye bağlı olarak gösterilir (beyaz ok uçları ve noktalı çizgiler = yamanın sınırı). Yama viskozitesi kalbin hatlarına kalıp sağlar ve aşırı gerginlik üstün yönü yama hidrojel (siyah yıldız) ile kaplı olmayan üçgen çıplak alan yapmak için bölünmüş olduğu oluştu nerede. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Kaplan-Meier sağkalım analizi 28 gün post-MI. Usul grubundaki dokuz fare genel ölüm oranı $ vermek için öldü (n=38). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Video hareketsiz görüntü (video zaman noktası 01:54 - 01:55) sol auricle gösteren (sol atriyal eki). Ok, kalbin üst sol kenarında üçgen bir yapı olarak görülebilen sol auricle'ın inferomedial ucunu işaret ediyor. LAD açıkça görselleştirilmiş değilse, sol auricle ucu LAD altında bir dikiş geçmek için iğne girişi için bir dönüm noktası olarak kullanılabilir. Giriş noktası 1 mm daha düşük ve medial en alt noktaya sol auricle ucu kalbin dinamik hareketleri sırasında ulaşır (siyah ok sol auricle inferomedial ucu gösterir). Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yöntem, operatörün kalıcı LAD ligasyonu ndan sonra enfarktüslü fare kalbinin epikardiyal yüzeyine uygulayarak biyobözlenmiş bir yamayı verimli bir şekilde nakletmesini kolaylaştırır. Bu fizibilite odaklı yöntemde, bu işlemi iş günü başına sekiz fare üzerinde gerçekleştirebiliyoruz (odanın hazırlanması dahil, önce ve sonra). Altı kuyulu kuyularda sekiz adet 1 cm2 yamalar üreten bir biyobaskı koşusu 2-3 saat sürer (önce ve sonra hazırlık süresi dahil). Biz kolayca erişilebilir ve genellikle en az maliyet ekler bizim yama için kepçe olarak bir cerrahi neşter paketinin içinde steril kullanılan, kalbin ön enfarktüs yüzeyinde yama perde için aljinat / jelatin hidrojel yama doğal yapışkan özellikleri kullanarak. Deneyimlerimize göre, farelerde LAD ligasyonu protokolü operatöre bağlıdır ve tek bir modelde uzmanlaşmış deneyimli operatörler ile 28 günde daha düşük bir mortalite oranına ulaşılabıdır. Van den Borne ve ark.16, C57BL6 farelerinin 28 gün boyunca kalıcı LAD ligasyonu ndan sonra %44 mortalite mevcut olduğunu ve bu yöntemle gözlemlediğimiz %30'luk üst sınırdan daha yüksek bir yama uygulaması olmadığını bildirdiler.

Entübasyon adımı kritiktir ve yetenekli bir operatör tarafından yapılmadığı sürece fareler için ölüm kaynağı olabilir. Bu zor trakea küçük boyutu nedeniyle yapılır, bu yüzden büyüteç gözlük bu adım için operatör tarafından giyilir. Biz fare derinden her ilacın nispeten düşük dozlarda anestezi böylece anestezik indüksiyon için enjekte ketamin / xylazine yanı sıra inhale izofluorane kullanın. Bu nedenle, farenin bu entübasyon adımında uyanma riski yoktur ancak yüksek tek ilaç dozları ile ilişkili yüksek mortalite önlenir. Atropin de bradikardi ve hipersalivasyon gibi yan etkileri karşı verildi. Boğaza uygulanan spot ışığının kullanımı, nefes borusunu içten olarak aydınlatır, böylece daha görünür olur ve ses telleri farenin solunum hızıyla (genellikle dakikada ~120 nefes) açılıp kapanırken görselleştirilmelidir. Fareyi mükemmel bir şekilde konumlandırmak için çok önemlidir (bu yüzden bu adım için farenin altında ısınma paspası yerine sert bir yüzey tercih edilir) halkalı bir iplik tarafından tutulan iki kesici diş ve dil ağzı açmak ve nefes borusunu görselleştirmek için künt forseps/çift lise ile son derece hafifçe geri çekilir. Entübasyon tamamlandıktan sonra, operatör entübasyon alanından ameliyat yatağına transfer sırasında tüpü yerinden çıkarmamaya dikkat etmelidir (hipotermiyi önlemek için altında ısı paspası vardır). Solunum tüpünü ventilatör aparatına bağlarken, tüpü bir eliyle stabilize etmek ve ventilatör devresini diğer eliyle bağlamak önemlidir, böylece borunun ventilatör segmentini bağlarken solunum tüpünün nefes borusuna daha derinden itilmesi gibi minimum bir hareket vardır.

Bu çalışmada Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta (DMEM) bölgesinde aljinat %4 (w/v)/jelatin %8 (w/v) kullanıldı. Aljinat / jelatin hidrojeller biyouyumluluk, düşük maliyetli ve biyomekanik özellikleri onları 3D doku mühendisliği stratejileri23için yararlı hale bilinmektedir. Bu hidrojeller kalsiyum iyonları ekleyerek hafif jelleşme ile çapraz bağlanabilir, hangi viskozite değiştirilmesine olanak sağlar. Biyobaskıdan sonra, fosfat tamponlu saline (PBS)%2kalsiyum klorür (CaCl 2 ) %2 (w/v) uyguladık ve nakilden önce 7-14 gün boyunca dmem'de altı kuyu plakasında kültürlendik. Bu, kültürde kalp hücreleri içeren yamalar yenmeye başladıktan sonra en uygun pencereydi ama yamalar parçalanmaya başlamadan önce. CaCl2 yama parçalanmasını azaltmak için post-biyobaskı aşaması boyunca düzenli olarak eklenebilir iken, biz hidrojel içsel viskoziteCaClsadece bir başlangıç dozu ile transplantasyon kadar yapılarını korumak için yamalar için yeterli olduğunu bulundu 2 .

Dikişsiz başarılı bir nakil için izin verilen yöntem (kalbe zarar verebilir) veya tutkal (yama ile kalp arasındaki arabirimi engelleyebilir). İleride yapılan çalışmalar, dikişsiz ve tutkalsız transplantasyonun farelerde engraftment'ı olumsuz etkilemediği hipotezini doğrulayabilir, çünkü yamanın kalpten kaymaması veya akciğerlere müdahale etmediği önemlidir. Yama bazlı onarım3 ile kalıcı LAD ligasyon modellerinde yamalar engraftment değerlendiren diğer çalışmalar da engrafted alan ölçülen (mm2) zaman24ile kalan , aşılanmış yama kalınlığı (μm) zaman ile remining25, polimer tarafından nakledilen hücrelerin nicel asaz zincir reaksiyonu (PCR)26 veya etiketli canlı donör hücrelerin biyolüminesans foton emisyon akısı (zaman içinde canlı hayvanlarda hayatta etiketli aşılı hücreleri ölçebilir saniyede yayılan fotonların bir ölçüsü)27. İleride yapılan çalışmalar, dikişsiz ve tutkalsız transplantasyonun yama engraftment'ını etkileyip etkilemediğini (ev sahibi miyokardiyum üzerindeki yapısal ve fonksiyonel etkilerin yanı sıra) daha fazla değerlendirmek için bu yöntemleri kullanabilir. Bununla birlikte, immünobeceriksiz farelerimizde 28 gün in vivo dan sonra makroskopik olarak, anterior mediasten değişken fibrinöz malzeme ve yapışıklıklar sundu. Yama bazlı kardiyak rejenerasyon mekanizması, sayısal hücre yenilenmesi yerine konak makrofaj inflamatuar yanıtların19 veya salgılanan immünolojikfaktörlerin 20 stimülasyonundan kaynaklanabilir. Inflamasyon olumlu bir rol oynarsa, yabancı hidrojel malzemenin varlığı yararlı olabilir. Alternatif olarak, hidrojel bileşeni zamanla parçalanırsa yararlı olabilir yabancı malzemenin varlığını azaltmak için. Aslında, bazı yaklaşımlar başlangıçta hücreleri destekleyen ve daha sonra parçalanır, sadece doku bırakarak biyomalzemeler kullanın28,29. Yama engraftment tam olarak analiz etmek ve daha iyi yama tabanlı kardiyak rejenerasyon arkasındaki mekanizmaları anlamak için gelecekteki çalışmalar insan deneyleri2çeviri den önce optimize deneysel tasarımlar yol açabilir .

Genel olarak, bu protokol yaygın olarak uygulanabilir olması muhtemeldir ve aynı zamanda 3D biyoprinted yamalar birden fazla grup test etmek için uygundur, örneğin farklı hücresel içeriği ile. Bu yöntem için gelecekteki yönler daha önce in vivo test edilmemiş gelişmiş hidrojeller içeren yamalar biyobaskı veya farklı otolog veya allojenik kök hücre kaynaklı hücrelerin etkilerini test içerir, büyük hayvan modelleri geçmeden önce optimizasyon için.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiçbiri.

FON TABLOSU:

Christopher D. Roche, Sir John Loewenthal Bursu 2019 (Sydney Üniversitesi), Le Gros Legacy Fund New Zealand (PhD012019) ve Kalp Araştırmaları Avustralya Doktora Bursu (2019-02) tarafından desteklendi. Carmine Gentile Sydney Üniversitesi Kick-Start Grant, Sydney Üniversitesi Doktora Teşvik Programı Hibe, UTS Tohum Finansman, Yetişkin Kök Hücre Araştırma için Sydney Grant Katolik Başpiskoposluk ve Sydney Tıp Fakültesi Foudation Kardiyotorasik Cerrahi Araştırma Grant tarafından desteklendi.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Natalie Johnston'a cerrahi olmayan görüntülerin ve tüm video düzenlemelerinin kaydı için teşekkür ederiz.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-0 emilmeyen siyah örgülü işlem görmüş ipekEthicon232G
6-0, 24" (60 cm) Prolen (polipropilen) sütür, mavi monofilamentEthicon8805H
7-0, 18" (45 cm) ipek siyah örgülüEthicon768G
6.4x büyütmeli ayarlanabilir stereo mikroskopOlympusSZ 3060 STU1
Anitisedan (atipamezol)ZoetisN/A
Atropin sülfat 0.6 mg, 1 mL flakon, 10 paketSymbion Eczane HizmetleriATRO S I2
Bupivakain, 20 mL, 5 şişeBaxter HeathcareBUPI I C01
Temvet (buprenorfin), 300 & mikro; g/mL, 10 mL şişeTroy LaboratuvarlarıTEMV I 10
Kavisli uçlu forsepsKent ScientificINS650915-4İris pansuman forsepsleri, 10 cm uzunluğunda kavisli pansuman forsepsleri; 0,8 mm tırtıklı uçlar; paslanmaz çelik.
Kas/cilt kesmek için diseksiyon makasıKent ScientificINS600393-GDiseksiyon makası, düz, 10 cm uzunluğunda
Endotrakeal entübasyon kitiKent ScientificETI-MSEEntübasyon kateteri/tüpü (20 G), fiber optik ışık kaynağı ve dental spatula dahil
İnce makasKent ScientificINS600124McPherson-Vannas mikro makas, 8 cm uzunluğunda, düz, 0,1 mm uçlar, 5 mm bıçaklar; paslanmaz çelik.
Lasix (furosemid) 20 mg, 2 mL, 5 paketSigma CompanyLASI A 1
Ameliyat sonrası hayvan iyileşmesi için ısı yastığıPasswellPADPasswell Hayvanlar için Cosy Isı Yastığı - 26cm x 36cm; 10 watt; Yumuşak PVC Kapaklı
Ketamin 100 mg, 50 mLCEVA Hayvan SağlığıKETA I 1
İğne tutucuKent ScientificINS600137Castroviejo iğne tutucu, tırtıklı, 14 cm uzunluğunda, kilitli 1,2 mm çeneler
MouseVent G500 otomatik ventilatörlü PhysioSuiteKent ScientificPS-MVG
Puralube Vet Oftalmik Merhem (steril oküler kayganlaştırıcı)Dechra17033-211-38
Kendinden tutuculu dişli fare ekartörüKent ScientificINS600240ALM tırtıklı kendinden tutucu ekartör, 7 cm uzunluğunda
Düz forsepsKent ScientificINS650908-4Süper ince pansuman forsepsleri, 12,5 cm Uzunluğunda, tırtıklı uçlar, 0,35 x 0,10 mm; paslanmaz çelik.
Cerrahi büyüteçlerKent ScientificSL-001
VetFlo buharlaştırıcıKent ScientificVetFlo-1205S-M
Ksilazin 100 mg, 50 mLRandlabXYLA I R01

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-fourth adult heart transplantation report-2017; focus theme: allograft ischemic time. Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (10), 1037-1046 (2017).">Lund, L. H., et al. The registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: thirty-fourth adult heart transplantation report-2017; focus theme: allograft ischemic time. Journal of Heart and Lung Transplantation. 36 (10), 1037-1046 (2017).
  2. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 58 (3), 500-510 (2020).">Roche, C. D., Brereton, R. J. L., Ashton, A. W., Jackson, C., Gentile, C. Current challenges in three-dimensional bioprinting heart tissues for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 58 (3), 500-510 (2020).
  3. Omentum support for cardiac regeneration in ischaemic cardiomyopathy models: a systematic scoping review. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , Epub ahead of print. ezaa205(2020).">Wang, H., Roche, C. D., Gentile, C. Omentum support for cardiac regeneration in ischaemic cardiomyopathy models: a systematic scoping review. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. , Epub ahead of print. ezaa205(2020).
  4. Spheroids of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells improve recovery from myocardial injury in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 315 (2), 327-339 (2018).">Mattapally, S., et al. Spheroids of cardiomyocytes derived from human-induced pluripotent stem cells improve recovery from myocardial injury in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 315 (2), 327-339 (2018).
  5. Large cardiac muscle patches engineered from human induced-pluripotent stem cell-derived cardiac cells improve recovery from myocardial infarction in swine. Circulation. 137 (16), 1712-1730 (2018).">Gao, L., et al. Large cardiac muscle patches engineered from human induced-pluripotent stem cell-derived cardiac cells improve recovery from myocardial infarction in swine. Circulation. 137 (16), 1712-1730 (2018).
  6. A net mold-based method of biomaterial-free three-dimensional cardiac tissue creation. Tissue Engineering Methods (Part C). 25 (4), 243-252 (2019).">Yang, B., et al. A net mold-based method of biomaterial-free three-dimensional cardiac tissue creation. Tissue Engineering Methods (Part C). 25 (4), 243-252 (2019).
  7. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report. European Heart Journal. 36 (30), 2011-2017 (2015).">Menasché, P., et al. Human embryonic stem cell-derived cardiac progenitors for severe heart failure treatment: first clinical case report. European Heart Journal. 36 (30), 2011-2017 (2015).
  8. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiovascular progenitors for severe ischemic left ventricular dysfunction. Journal of the American College of Cardiology. 71 (4), 429-438 (2018).">Menasché, P., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived cardiovascular progenitors for severe ischemic left ventricular dysfunction. Journal of the American College of Cardiology. 71 (4), 429-438 (2018).
  9. Three-dimensional bioprinting: new horizon for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 46 (3), 339-341 (2014).">Beyersdorf, F. Three-dimensional bioprinting: new horizon for cardiac surgery. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 46 (3), 339-341 (2014).
  10. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344(2019).">Noor, N., et al. 3D printing of personalized thick and perfusable cardiac patches and hearts. Advanced Science. 6 (11), 1900344(2019).
  11. A multi-cellular 3D bioprinting approach for vascularized heart tissue engineering based on HUVECs and iPSC-derived cardiomyocytes. Scientific Reports. 8 (1), 13532(2018).">Maiullari, F., et al. A multi-cellular 3D bioprinting approach for vascularized heart tissue engineering based on HUVECs and iPSC-derived cardiomyocytes. Scientific Reports. 8 (1), 13532(2018).
  12. Bioprinting 3D microfibrous scaffolds for engineering endothelialized myocardium and heart-on-a-chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).">Zhang, Y. S., et al. Bioprinting 3D microfibrous scaffolds for engineering endothelialized myocardium and heart-on-a-chip. Biomaterials. 110, 45-59 (2016).
  13. Myocardial assistance by grafting a new bioartificial upgraded myocardium (MAGNUM clinical trial): one year follow-up. Cell Transplant. 16 (9), 927-934 (2007).">Chachques, J. C., et al. Myocardial assistance by grafting a new bioartificial upgraded myocardium (MAGNUM clinical trial): one year follow-up. Cell Transplant. 16 (9), 927-934 (2007).
  14. Elastomeric cardiopatch scaffold for myocardial repair and ventricular support. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 57 (3), 545-555 (2020).">Chachques, J. C., et al. Elastomeric cardiopatch scaffold for myocardial repair and ventricular support. European Journal of Cardio-Thoracic Surgery. 57 (3), 545-555 (2020).
  15. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: an improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (122), e55353(2017).">Reichert, K., et al. Murine left anterior descending (LAD) coronary artery ligation: an improved and simplified model for myocardial infarction. Journal of Visualized Experiments. (122), e55353(2017).
  16. Mouse strain determines the outcome of wound healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 84 (2), 273-282 (2009).">van den Borne, S. W. M., et al. Mouse strain determines the outcome of wound healing after myocardial infarction. Cardiovascular Research. 84 (2), 273-282 (2009).
  17. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).">Noguchi, R., et al. Development of a three-dimensional pre-vascularized scaffold-free contractile cardiac patch for treating heart disease. Journal of Heart and Lung Transplantation. 35 (1), 137-145 (2016).
  18. From mice to monkeys? Beyond orthodox approaches to the ethics of animal model choice. Animals. 10 (1), 77(2020).">Walker, R. L., Eggel, M. From mice to monkeys? Beyond orthodox approaches to the ethics of animal model choice. Animals. 10 (1), 77(2020).
  19. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem-cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2019).">Vagnozzi, R. J., et al. An acute immune response underlies the benefit of cardiac stem-cell therapy. Nature. 577, 405-409 (2019).
  20. Stem cell-inspired secretome-rich injectable hydrogel to repair injured cardiac tissue. Acta Biomaterialia. 69, 95-106 (2018).">Waters, R., et al. Stem cell-inspired secretome-rich injectable hydrogel to repair injured cardiac tissue. Acta Biomaterialia. 69, 95-106 (2018).
  21. Lancet Commission: stem cells and regenerative medicine. Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).">Cossu, G., et al. Lancet Commission: stem cells and regenerative medicine. Lancet. 391 (10123), 883-910 (2018).
  22. Enhanced therapeutic effects of human iPS cell derived-cardiomyocyte by combined cell-sheets with omental flap technique in porcine ischemic cardiomyopathy model. Scientific Reports. 7 (1), 8824(2017).">Kawamura, M., et al. Enhanced therapeutic effects of human iPS cell derived-cardiomyocyte by combined cell-sheets with omental flap technique in porcine ischemic cardiomyopathy model. Scientific Reports. 7 (1), 8824(2017).
  23. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).">Lee, K. Y., Mooney, D. J. Alginate: properties and biomedical applications. Progress in Polymer Science. 37 (1), 106-126 (2012).
  24. Cell-sheet therapy with omentopexy promotes arteriogenesis and improves coronary circulation physiology in failing heart. Molecular Therapy. 23 (2), 374-386 (2015).">Kainuma, S., et al. Cell-sheet therapy with omentopexy promotes arteriogenesis and improves coronary circulation physiology in failing heart. Molecular Therapy. 23 (2), 374-386 (2015).
  25. Omentopexy enhances graft function in myocardial cell sheet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 353-359 (2009).">Suzuki, R., et al. Omentopexy enhances graft function in myocardial cell sheet transplantation. Biochemical and Biophysical Research Communications. 387 (2), 353-359 (2009).
  26. A novel vascularized patch enhances cell survival and modifies ventricular remodeling in a rat myocardial infarction model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (6), 1388-1396 (2010).">Zhou, Q., Zhou, J. Y., Zheng, Z., Zhang, H., Hu, S. S. A novel vascularized patch enhances cell survival and modifies ventricular remodeling in a rat myocardial infarction model. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 140 (6), 1388-1396 (2010).
  27. Cord lining-mesenchymal stem cells graft supplemented with an omental flap induces myocardial revascularization and ameliorates cardiac dysfunction in a rat model of chronic ischemic heart failure. Tissue Engineering (Part A). 19 (11-12), 1303-1315 (2013).">Lilyanna, S., et al. Cord lining-mesenchymal stem cells graft supplemented with an omental flap induces myocardial revascularization and ameliorates cardiac dysfunction in a rat model of chronic ischemic heart failure. Tissue Engineering (Part A). 19 (11-12), 1303-1315 (2013).
  28. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).">Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
  29. Biodegradable scaffold with built-in vasculature for organ-on-a-chip engineering and direct surgical anastomosis. Nature Materials. 15 (6), 669-678 (2016).">Zhang, B., et al. Biodegradable scaffold with built-in vasculature for organ-on-a-chip engineering and direct surgical anastomosis. Nature Materials. 15 (6), 669-678 (2016).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

3B Biyobas l YamaMiyokard nfarkt s ModeliMurin Kalp TransplantasyonuSol n nen Arter LigasyonuTorakotomi Cerrahi Yakla mKardiyak H cre Biyobask sAljinat Jelatin HidrojeliEpikardiyal Yama TransplantasyonuVentilat r Destekli AnesteziAmeliyat Sonras Fare yile mesi

İlgili makaleler