Yöntem makalesi

Gelişmekte Olan Arpa Tohumlarından Yüksek Saflıkta Dokuların İzolasyonu

2.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61681

⸱

26 Ekim 2020

 ,  , 
1Czech Acad Sci, Centre of the Region Haná for Biotechnological and Agricultural Research, Institute of Experimental Botany, 2The Polish Academy of Sciences, The Franciszek Górski Institute of Plant Physiology

Bu makalede

Özet

Burada, tüm arpa tohumu gelişimi sırasında embriyo, endosperm ve tohum maternal dokularının yüksek saflıkta manuel izolasyonu ve kalite kontrolü için bir protokol sunuyoruz.

Özet

Tahıl tohumlarının gelişimini düzenleyen mekanizmaların anlaşılması, bitki ıslahı ve verimin artırılması için çok önemlidir. Bununla birlikte, tahıl tohumlarının analizi, küçük boyutları, bazı dokuların sıvı karakteri ve dokular arası bağlantıların sıkı olması nedeniyle zordur. Burada, arpa tohumu gelişiminin erken, orta ve geç aşamalarında embriyo, endosperm ve tohum maternal dokularının diseksiyonu için ayrıntılı bir protokol gösteriyoruz. Protokol, ince uçlu aletler ve binoküler mikroskop kullanılarak manuel doku diseksiyonuna ve ardından ploidi analizine dayalı saflık kontrolüne dayanmaktadır. Tohum maternal dokuları ve embriyolar diploid, endosperm ise triploid dokudur. Bu, akış sitometrisi kullanılarak numune saflığının izlenmesine olanak tanır. Ek ölçümler, bu tür örneklerden izole edilen RNA'nın yüksek kalitesini ve yüksek hassasiyetli analiz için kullanılabilirliklerini ortaya çıkardı. Sonuç olarak, bu protokol, gelişmekte olan ekili arpa tanelerinden ve potansiyel olarak diğer tahıllardan saf dokuların pratik olarak nasıl inceleneceğini açıklar.

Giriş

Tohumlar, anne ve evlat kökenli çeşitli dokulardan oluşan karmaşık yapılardır1. Tahıl taneleri, en büyük kısmı embriyoyu koruyan ve besleyen özel bir triploid doku olan endosperm tarafından oluşturulan özel bir tohum türünü temsil eder. Tahıllar, küresel gıda kaynaklarının yaklaşık `'ını sağlar ve bitki üretiminden elde edilen en değerli çıktıdır2. Tahıl tohumu gelişimini kontrol eden moleküler süreçlerin bilgisi, ekonomik önemleri ve bitki üremesindeki merkezi rolleri nedeniyle önemlidir 1,3.

Ekili arpa (Hordeum vulgare subsp. vulgare; 2n = 2x = 14; 1C = 5.1 Gbp) dünya çapında dördüncü en önemli tahıl ürünüdür. Hayvan yemi, gıda ve biyoteknolojiiçin kullanılır 4. Bunun yanı sıra, aynı zamanda klasik ılıman kuşak tahıl mahsulü modeli olan ve önemi artan bir türdür5. Arpa genomik kaynakları, genetik haritalar, çeşitler, arazi ırkları ve mutant koleksiyonları, yüksek kaliteli genom düzenekleri ve açıklamaların yanı sıra ana gelişim aşamalarınıntranskriptomik verilerini içerir 5,6,7. Ayrıca, arpa genleri diğer tahılların genetik iyileştirmeleri için kullanılır. Kuraklık ve tuzluluk gibi abiyotik streslere, spesifik patojenlere ve yüksek faydalı bileşik içeriğine (örneğin, β-glukan) karşı direnç, arpayı buğday ıslahı için değerli bir özellik kaynağı haline getirir8.

Tohum gelişimi, tozlaşma gününde (DOP) döllenme ile başlatılır. DOP, stigma ve anterlerin morfolojisinin Waddington ölçeğine (W10.0)9 göre değerlendirilmesi ile tanımlanır. Tozlaşmamış çiçekler içeren sivri uçlar, kompakt (dallanmamış) stigma ve yeşil anterler ile karakterize edilirken, tozlaşan sivri uçlar genişletilmiş spikletler, genişletilmiş ve geniş dallı stigma, şişmiş ovül, açık anterler ve serbest polen içeriyordu. DOP'taki çiçekler bir ara fenotipi temsil ediyordu. Anterler sarı bir renge sahipti, kolayca bozuldu ve daha sonra polen saldı. Stigma, pistilin geniş çaplı sigmatik dallarına yayılmıştır (Şekil 1C).

Arpa tohumu gelişimi, kısmen örtüşen üç aşamayı içerir 1,10. Evre I (tozlaşmadan 0 – 6 gün sonra; DAP), hücre çoğalması ve nişasta sentezinin olmaması ile karakterize edilen çift döllenme ile başlatılır; aşama II (7 – 20 DAP), nişasta ve protein depolama moleküllerinin üretimi ile birlikte farklılaşma ve büyük biyokütle kazanımını içerir; aşama III (21 DAP'tan sonra) tohum olgunlaşmasına, kuruma ile ağırlık azalmasına ve uyku halinin başlamasına karşılık gelir. Alternatif olarak, fazlar sırasıyla erken, orta ve geç olarak adlandırılır11.

Arpa tanesi, lemma, palea ve glumes12'den oluşan kabuklarla kaplıdır. Çoğu arpa genotipinde, kabuklar kuru tohumları sıkıca sarar. Tohumun kendisi embriyo, endosperm ve tohum maternal dokuları tarafından oluşturulur (Şekil 1A). Diploid embriyo, yumurta hücresinin tek bir sperm hücresi çekirdeği tarafından döllenmesinden kaynaklanır. Tam gelişmiş tohumda embriyo, kökü çevreleyen koleorhiza ile embriyonik eksenden, sürgün meristemini ve birincil yaprakları çevreleyen koleoptil ve scutellum (kotiledon)1,10,13,14'ten oluşur. Triploid endosperm, diploid merkezi hücrenin ikinci sperm hücresi çekirdeği tarafından döllenmesinin sonucudur. Endospermin proliferasyonu, bölünen çekirdeklerin merkezi vakuol tarafından çevreye itildiği sinsityal (koenosit) aşaması ile başlar. Sinsityal fazın sonunda, mikrotübüller çekirdeklerin etrafında radyal bir ağ oluşturur ve antiklinal hücre duvarı oluşumunu ve endosperm hücreselleşmesinin başlangıcını gösterir. Endosperm farklılaşması hücreselleşme ile eş zamanlı olarak gerçekleşir ve beş ana doku ile sonuçlanır: nişastalı endosperm, transfer hücreleri, aleurone ve subaleurone tabakaları ve embriyoyu çevreleyen bölge. Tohum maternal dokuları, perikarp ve tohum kabukları içeren maternal kökenli çok katmanlı diploid bir yapıdır10,12. Tohum maternal dokuları, tahılın dorsal tarafında, taşıma ile ilgili bir işlevi olan ve tohum gelişiminin sonraki aşamalarında endosperme gömülü hale gelen bir çekirdek çıkıntısı içerir15.

figure-introduction-1
Şekil 1: Arpa tohumlarının geliştirilmesi. (A) Tahıl tanesinin, belirtilen tohum maternal dokuları (SMT'ler, yeşil), endosperm (END, sarı), embriyo (EMB, turuncu) ve kabukları (H, gri) ile sagital planda şematik çizimi. (B) Anteze yakın arpa başak morfolojisi. Ölçek çubuğu = 1 cm. (C) Tozlaşma öncesi, sırası ve sonrasındaki aşamalarda stigma ve anterlerin morfolojisi. Ek, polen taneleri (ok uçları) ile stigmanın ayrıntılarını gösterir. Ölçek çubuğu = 5 mm, iç çubuk = 200 μm. (D) 4, 8, 16 ve 24 DAP tohumlarının sagital ve enine kesitleri. (NP, nükleer projeksiyon) Ölçek çubuğu = 5 mm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yüksek verimli genomikteki son ilerlemeler, bireysel tohum dokusu gelişiminin incelenmesi için araçlar sağlar. Ancak bu amacın önündeki en büyük engel tohum dokularının kompakt yapısı ve sıkı yapışmasıdır1. Gelişmekte olan arpa tohumlarından elde edilen tohum dokularının yüksek saflıkta diseksiyonu için bir protokol geliştirdik ve daha sonra RNA dizilimi gibi son derece hassas analizler için kullanım imkanı bulduk. Ek olarak, sunulan protokol diğer tahıllara kolayca uyarlanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Büyüyen bitkiler

NOT: Tek bir arpa bitkisinin genellikle 5 ila 6 yeke içerdiği ve diseksiyon için her bir başaktan sadece ortadaki 5 ila 6 başakçık kullanılması gerektiği göz önüne alındığında, bitki başına maksimum verim iki sıralı çeşitler için 72 tohum ve altı sıralı çeşitler için 216 tohumdur.

  1. Arpa tohumlarını çimlendirmek için, bir kat filtre kağıdı ile kaplanmış üç kat selüloz kağıt mendil ile doldurulmuş bir Petri kabı hazırlayın. Damıtılmış su ile nemlendirin, böylece fazla su kalmaz, tohumları yüzeye koyun ve Petri kabını kapatın. Filtrasyon kağıdı, köklerin selüloz dokusundan büyümesini önler. Tohumları karanlıkta 25 °C'de 3 gün çimlendirin.
    NOT: Alternatif olarak, tohumları doğrudan ıslak bir toprak karışımına koyarak çimlendirin (bkz. adım 1.2).
  2. Görünür bir kök ve sürgün ile çimlenmiş tohumları yaklaşık 5 cm'lik bir sürgün ile toprak ve kum karışımı (3:1, h/h) ile 5 cm x 5 cm'lik turba saksılarına aktarın. Düzenli olarak sulayın. 10 gün sonra bitkileri aynı toprak karışımı ile doldurulmuş 12 cm x 12 cm saksılara aktarın.
  3. Bitkileri kontrollü uzun gün rejimi altında (16 saat gündüz 20 °C, 8 saat gece 16 °C; ışık yoğunluğu 200 μmol m-2 s-1; nem %60) bir iklim odasında büyütün.
    NOT: İlkbahar arpası, ekimden antez başlangıcına kadar yaklaşık 8-10 hafta gerektirir ve vernalizasyona gerek yoktur. Kışlık arpanın çiçeklenmeyi tetiklemesi için 7-8 haftalık vernalizasyona ihtiyacı vardır (kısa gün koşulları, 8 saat gündüz 4 °C, 16 saat gece 4 °C; ışık yoğunluğu 200 μmol m-2 s-1; nem %85).

2. Tozlaşmanın belirlenmesi

NOT: Gelişimsel ilerlemenin doğru tahmini için tozlaşmanın kesin olarak belirlenmesi gerekir. Arpa kendi kendine tozlaşan bir türdür. Tozlaşma gününü (DOP) tanımlamak için, kendi kendine tozlaşma gününü izledik. Bu özellik çeşide özgüdür, ancak kılçıkların yaprak kılıfından çıkıntıya başlaması, DOP'a yaklaştığının iyi bir göstergesidir (Şekil 1B).

  1. Sivri ucu kaplayan yaprak kılıfını açın. Sivri ucun orta kısmındaki spikeletlerin içindeki anterleri ve yumurtalığı kontrol etmek için ince uçlu cımbız kullanın. Sarı anterli ve "kabarık" stigmalı başakçıklar birkaç saat içinde tozlaşır16 ve DOP olarak kabul edilir (Şekil 1B).
  2. Son başakçıkların ucuna yakın bir yerde sivri ucu kesin ve bayrak yaprağını ve kılçıkların üst kısmını çıkarın. Ardından, her bir başakçıktaki gövdelerin üst 1/3'ünü kesin. Bu, anterleri kurutur ve polenlerin daha senkronize bir şekilde açılmasına ve salınmasına yol açar.
  3. Çiviyi, başak kimliği, bitki numarası ve tanımlanmış DOP tarihi olan bir cam torba ile örtün. Bu aynı zamanda belirli deneyleri tehlikeye atabilecek çapraz tozlaşmayı da önler.
  4. Bilgileri bir tablo düzenleyicisine not edin. Doku izolasyonunun yapılması gereken tozlaşmadan (DAP) sonraki günü hesaplamak için aşağıdaki formülü kullanın.
    xDAP = DOP + x
    x = beklenen DAP
    NOT: Değerler 'Veri' biçiminde olmalıdır.
  5. Tohum dokularının diseksiyonu için, hazırlanan tablo takvimine göre DAP'ta sivri uçları toplayın.

3. Tohum dokularının diseksiyonu

NOT: Aşağıdaki adımlar bir stereomikroskop kullanılarak gerçekleştirilmelidir. Cımbız kullanarak diseksiyondan önce gövdeleri çıkarın. Gövdelerin yaklaşık 16 DAP'tan itibaren daha kuru ve daha yapışkan hale geldiğini unutmayın. Diseksiyon sırasında fizyolojik koşulları korumak ve bitki materyallerinin kurumasını önlemek için, numuneleri 1x PBS'lik bir damla içine koyarak nemlendirin (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, pH = 7.4). Uzun numune toplama süresi nedeniyle DNA, RNA veya protein bozulmasını önlemek için her dokunun diseksiyonu için yeni bir tohum kullanın. Diseke edilmiş materyalden RNA izolasyonu için sadece RNaz içermeyen malzemeler ve kimyasallar kullanın. RNA bozulmasını en aza indirmek için tipik olarak 5-10 tohumdan diseke edilen dokulardan oluşan bir numune için toplam diseksiyon süresi olan 15 dakikayı aşmayın.

  1. Doku diseksiyonundan önce ince uçlu cımbız kullanarak gövdelerin geri kalanını çıkarın. 1 dakika boyunca 1× PBS ile nemlendirmek, spikeletin kuru kalıntılarının giderilmesine yardımcı olur.
  2. Soyulmuş tohumu 1× PBS'lik bir damla ile bir Petri kabına yerleştirin ve ince uçlu cımbız, ince iğne ve mikrokılcal pipet kullanarak tek tek parçaları inceleyin. Bireysel dokuların diseksiyonu için biraz farklı bir strateji uygulanır: tohum maternal dokular (adım 3.3), embriyo (adım 3.4) ve endosperm (adım 3.5).
  3. Tohum maternal dokularının diseksiyonu
    1. 8 DAP'a kadar tohumlardan diseksiyon
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin ve tohumu uzunlamasına bir eksen boyunca nazikçe kesin ve cımbız kullanarak apikalden bazal kısma endospermi çevreleyen son katman hariç tohum anne dokularını soyun.
      2. 5 ila 10 tohumdan tohum maternal dokularını 50 μL 1× PBS ile 1.5 mL'lik bir tüpe toplayın, tamponu bir pipet kullanarak atın, dokuyu 100 μL PBS ile iki kez durulayın, pipetleme ile fazla tamponu çıkarın ve tüpü kapatın ve sıvı nitrojen içinde dondurun veya doğrudan akış sitometrik ploidi ölçümü için kullanın. Malzeme miktarı tipik olarak bir aşağı akış uygulaması için yeterlidir (örneğin, RNA izolasyonu veya akış sitometrik ploidi ölçümü).
    2. 8 DAP'tan sonra tohumlardan diseksiyon
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin, tohum maternal dokularının ventral tarafının ortasında nazikçe kesin ve çekirdek çıkıntısı da dahil olmak üzere tüm tohumun etrafındaki dokuyu yavaş yavaş soyun. Her bir aşağı akış uygulaması için, dokuyu adım 3.3.1'de açıklandığı gibi 5 ila 10 tohum arasında toplayın ve yıkayın.
  4. Embriyo diseksiyonu
    1. 8 DAP ve daha genç tohumlardan diseksiyon
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin ve tohumun bazal 1 / 3'ünü kesin. Ayrılan parçayı dikkatlice ikiye bölün ve embriyoyu serbest bırakın. Her bir aşağı akış uygulaması için, embriyoları 3.3.1'de tarif edildiği gibi 10 ila 20 tohumdan toplayın ve yıkayın.
    2. 8 DAP'tan sonra tohumlardan diseksiyon
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin ve ventral tarafın bazal kısmından tohum maternal dokularını çıkarın. İnce iğne veya ince uçlu cımbızla embriyonun çevresindeki ince endosperm tabakasını nazikçe rahatsız edin ve embriyoyu soyun. Her bir alt uygulama için, 3.3.1'de açıklandığı gibi 5 tohuma kadar embriyoları toplayın ve yıkayın.
  5. Endosperm diseksiyonu
    1. 4 DAP tohumundan sinsityal endospermin diseksiyonu.
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin ve endospermi çevreleyen son hücre tabakası dışında tohum anne dokularını çıkarın. Ventral tarafın ortasındaki tabakayı ince bir iğne ile nazikçe delin ve bir mikrokılcal pipet kullanarak kılcal hareketle sinsityal endospermi emdirin.
      2. Her aşağı akış uygulaması için, 10 ila 15 tohumdan sıvı endospermleri, planlanan aşağı akış analizine uygun tamponlu yeni bir 1.5 mL tüpe toplayın (yani, 1x PBS, RNA izolasyon tamponu, akış sitometrisi tamponu). Tampon hacmi, planlanan aşağı akış uygulaması için protokolü yansıtmalıdır. Sıvı nitrojen içinde dondurun.
    2. 5 ila 8 DAP tohumundan selüllarize endospermin diseksiyonu
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin ve tüm tohum anne dokularını ve embriyoyu çıkarın. Her aşağı akış uygulaması için, 10 ila 15 tohumdan endospermi toplayın ve 1x PBS içeren yeni bir 1.5 mL tüpe yıkayın ve sıvı nitrojen içinde dondurun.
    3. 8 DAP sonrası tohumdan selüllarize endospermin diseksiyonu
      1. Sırt tarafına bir tohum yerleştirin, tüm tohum anne dokularını ve embriyoyu çıkarın. Her bir aşağı akış uygulaması için, adım 3.3.1'de açıklandığı gibi tüp başına tek bir tohumdan endosperm toplayın ve yıkayın.
  6. Tüpleri izole edilmiş malzeme ile kullanana kadar – 80 °C'de saklayın.
    NOT: Protokol buradan duraklatılabilir.

4. Akış sitometrisi kullanılarak doku saflığının kontrolü

NOT: Numune saflığı, RNA izolasyonundan önce akış sitometrisi kullanılarak kontrol edilebilir. Biyolojik numune analizi için uygun cihaz kalibrasyonu kritik öneme sahiptir. Akış sitometresi/ploidi analizörü optikleri, tipik olarak %2'lik varyasyon katsayısına (CV<) ulaşan maksimum tepe keskinliğine ulaşana kadar kalibrasyon boncukları (floresan lekeli polistiren mikro küreler) kullanılarak ayarlanmalıdır. Tahıl tohumu dokuları esas olarak G1, G2 ve endorereplikasyonlu çekirdek popülasyonlarını içerir; Bu nedenle, logaritmik bir ölçek kullanılması önerilir. Çoğunlukla G1 çekirdeği içeren ve bazal ploidi kontrolü görevi gören bir yaprak dokusu ile başlayın.

  1. Buz üzerinde tutulan taze hazırlanmış numuneleri (bkz. adım 3.3.1) veya17'de açıklandığı gibi donmuş dokuyu kullanın.
    NOT: Akış sitometrisi için < 8 DAP örneğinin tamamı kullanıldığından, bu yalnızca dolaylı bir kontrolü temsil eder. Araştırmacıların, < 8 DAP örneği ile RNA izolasyonuna geçmeden önce yüksek oranda saf örneğe (%>90) ulaşana kadar çoklu izolasyon ve ölçüm yapmalarını öneririz.
  2. 300 μL Otto I tamponu (0.1 M sitrik asit monohidrat, %0.5 (h/h) Tween 20, 0.22 μm'lik bir filtreden süzülür) içeren 1.5 mL'lik tüpte dokuları 5 ila 10 tur plastik havaneli homojenize ederek 4 ve 8 DAP embriyo numunesinden çekirdekleri serbest bırakın (diğer örnekler için bkz. adım 4.4).
  3. Ham süspansiyonu 50 μm naylon ağdan bir akış sitometrisi analiz tüpüne süzün ve DNA'yı boyamak için 2 μg mL-1 DAPI (4 ', 6-diamidino-2-fenilindol) içeren 600 μL Otto II tamponu (0.4 M Na2HPO4 · 12H2O) ekleyin.
  4. Diğer tüm dokuları (16 DAP veya daha eski embriyolar dahil) 500 μL Otto I tamponu içeren ve jiletle doğranarak homojenize edilen bir Petri kabına yerleştirin. Süspansiyonu adım 4.3'teki gibi filtreleyin ve DAPI içeren 1 mL Otto II tamponu ile boyayın.
    NOT: Keskin çift kenarlı tıraş bıçağıyla manipülasyon özel dikkat gerektirir. Yaralanma riskini azaltmak için, tek kenarlı tıraş bıçakları veya özel bıçak tutucular mevcuttur.
  5. Bir akış sitometresi kullanarak numunenin nükleer DNA içeriğini tahmin edin. Numune saflığını analiz etmek için numune başına en az 2000 partikül gereklidir.

5. RNA izolasyonu ve kalite ölçümü

  1. Endojen ribonükleazlar tarafından RNA bozulmasını önlemek için donmuş doku kullanın. Tohum maternal dokularından ve embriyo örneklerinden, ticari olarak temin edilebilen kitleri veya TRIzol reaktifi19'u kullanarak RNA'yı izole edin. Endosperm dokularındaki yüksek nişasta içeriği nedeniyle, sorunlu dokular için ticari kolon üstü RNA ekstraksiyon protokollerini kullanarak tüm numunelerden toplam RNA'yı izole edin (ör., Spektrum Bitki Toplam RNA Kiti) kolon üzerinde DNaz I tedavisiile 20.
  2. RNA jel elektroforezi veya Agilent 2100 Biyoanalizörü için özel bir protokol kullanarak RNA konsantrasyonunu ve bütünlüğünü ölçün.
    NOT: Bozulmamış toplam RNA, sırasıyla 1,9 ve 3,7 kb civarında net bir 18S ve 25S rRNA bantlarına/tepe noktalarına sahiptir. 25S rRNA bandı, 18S rRNA bandından yaklaşık iki kat daha yoğun olmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Arpa tohumu gelişiminin dokuya özgü transkriptomik analizini yapmak için, yüksek saflıkta doku izolasyonu için bir protokol oluşturduk. Protokol, soyulmuş (elle kabuk çıkarıldıktan sonra) tahıllardan embriyo, endosperm ve tohum maternal dokularının manuel diseksiyonuna dayanır (Şekil 1A). Protokol, birkaç iki ve altı sıralı bahar arpa çeşidinden materyalleri izole etmek için başarıyla kullanıldı ve sivri uçlar belirli bir DAP'ta hasat edildi ve fiksasyon olmadan doğrudan ekstraksiyon için ku...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, arpa tohumu dokularının yüksek saflıkta izolasyonuna izin veren bir protokol sunuyoruz. Arpa için geliştirilmiş ve test edilmiş olmasına rağmen, buğday, yulaf, çavdar veya tritikale gibi Triticeae kabilesinin diğer üyelerine kolayca uyarlanabilir27. Tohum dokusu diseksiyonuna odaklanan protokolün ilk kısmı, standart dışı veya pahalı ekipman gerektirmez ve bu nedenle birçok bilim insanı tarafından erişilebilir olmalıdır. Kapsamlı kalite kontrol ana...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Akış sitometrelerinin bakımı için Dr. Jan Vrána ve Dr. Mahmoud Said'e, tamponların hazırlanması için Eva Jahnová'ya, malzeme listesi için Marie Seifertová'ya ve bitki bakımı için Zdenka Bursová'ya teşekkür ederiz. Bu çalışma öncelikle Çek Bilim Vakfı hibesi 18-12197S tarafından desteklenmiştir. A.P. , Çek Bilimler Akademisi'nden J. E. Purkyně Bursu ve ERDF projesi "Sürdürülebilir küresel kalkınma için bir araç olarak bitkiler" (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000827).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.22 um filtreMerckSLGSV255F
1.5 ml Eppendorf tüpSarstedt72.690.001
4 ',6-diamidido-2-fenilindolInvitrogenD21490
50 um naylon örgüİpek a Progrersuhelon 120 T Agilent
2100 BiyoanalizörAgilentG2939BA
Ampul GrubuDrummond Scientific Company1-000-9000
Kalibrasyon boncuklarıInvitrogenA16502
Selüloz doku kağıdı
Sitrik asit monohidratPenta13830-31000
İklim odasıWeiss Gallenkamp
DNase ISigma AldrichDNASE70
Filtresi kağıtFagron
İnce uçlu cımbızGüzel Bilim Araçları11254-20
Akış sitometresiSysmex-Partec
Akış sitometri tüpüSarstedt55.484
Dondurucu
Glassine çanta
KClLachner30076-AP0
KH2PO4Litolab100109
Sıvı nitrojenLinde
Mikrokılcal pipetFivephoton BiyokimyasallarMGM 1C-20-30
Minutyen PimleriGüzel Bilim Araçları26002-20
Na2HPO4Lachema
Na2HPO4.12H2OLachner30061-AP0
NaClLachner30093-AP0
Turba saksılarıJiffy5x5 cm
Petri kabı
Pim TutucuGüzel Bilim Araçları26016-12
Plastik havanelip-LabA199001
Saksıları12x12 cm
JiletliGillette
RNAse zapInvitrogenAM9780
Kum
MakasıGüzel Bilim Araçları14060-11
Toprak
Spektrumu Bitki Toplam RNA KitiSigma AldrichSTRN50
StereomikroskopOlympus
Tween 20Sigma AldrichP2287
TRIzol reaktifiInvitrogen15596026
RNA 6000 Pico KitiAgilent5067-1513

Kaynaklar

  1. Sreenivasulu, N., et al. Barley grain development: Toward an integrative view. International Review of Cell and Molecular Biology. 281, 49-89 (2010).
  2. FAO. Cereal supply and demand brief. Food and Agriculture Organization of the United Nations. , Available from: http://www.fao.org (2019).
  3. Baik, B. K., Ullrich, S. E. Barley for food: Characteristics, improvement, and renewed interest. Journal of Cereal Science. 48 (2), 233-242 (2008).
  4. Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Stein, N., Muehlbauer, G. J. , Springer. Cham. Switzerland, AG. 1-10 (2018).
  5. Mascher, M., et al. A chromosome conformation capture ordered sequence of the barley genome. Nature. 544 (7651), 427-433 (2017).
  6. Mascher, M. Pseudomolecules and annotation of the second version of the reference genome sequence assembly of barley cv. Morex V2. Morex. , Available from: https://edal.ipk-gatersleben.de (2019).
  7. Rapazote-Flores, P., et al. BaRTv1.0: An improved barley reference transcript dataset to determine accurate changes in the barley transcriptome using RNA-seq. BMC Genomics. 20 (1), 968(2019).
  8. Molnár-Láng, M., Linc, G., Szakács, É Wheat-barley hybridization: The last 40 years. Euphytica. 195 (3), 315-329 (2014).
  9. Waddington, S. R., Cartwright, P. M., Wall, P. C. A quantitative scale of spike initial and pistil development in barley and wheat. Annals of Botany. 51 (1), 119-130 (1983).
  10. Sabelli, P. A., Larkins, B. A. The development of endosperm in grasses. Plant Physiology. 149 (1), 14-26 (2009).
  11. Dante, R. A., Larkins, B. A., Sabelli, P. A. Cell cycle control and seed development. Frontiers in Plant Science. 5, 1-14 (2014).
  12. Rodríguez, M. V., Barrero, J. M., Corbineau, F., Gubler, F., Benech-Arnold, R. L. Dormancy in cereals (not too much, not so little): About the mechanisms behind this trait. Seed Science Research. 25 (2), 99-119 (2015).
  13. Sreenivasulu, N., et al. Gene expression patterns reveal tissue-specific signaling networks controlling programmed cell death and ABA-regulated maturation in developing barley seeds. Plant Journal. 47 (2), 310-327 (2006).
  14. Olsen, O. A. Nuclear endosperm development in cereals and Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 16, suppl_1 214-227 (2004).
  15. Thiel, J., et al. Different hormonal regulation of cellular differentiation and function in nucellar projection and endosperm transfer cells: A microdissection-based transcriptome study of young barley grains. Plant Physiology. 148 (3), 1436-1452 (2008).
  16. Weschke, W., et al. Sucrose transport into barley seeds: Molecular characterization of two transporters and implications for seed development and starch accumulation. Plant Journal. 21 (5), 455-467 (2000).
  17. Staszak, A. M., Rewers, M., Sliwinska, E., Klupczyńska, E. A., Pawłowski, T. A. DNA synthesis pattern, proteome, and ABA and GA signalling in developing seeds of Norway maple (Acer platanoides). Functional Plant Biology. 46 (2), 152-164 (2019).
  18. Otto, F. Chapter 11 DAPI staining of fixed cells for high-resolution flow cytometry of nuclear DNA. Methods in Cell Biology. 33, 105-110 (1990).
  19. Fisher Scientific. Procedural guidelines. , (2020).
  20. Spectrum TM. Plant Total RNA Kit. , (2020).
  21. Nowicka, A., et al. Dynamics of endoreduplication in developing barley seeds. Journal of Experimental Botany. , eraa453(2020).
  22. Chen, J., et al. Dynamic transcriptome landscape of maize embryo and endosperm development. Plant Physiology. 166 (1), 252-264 (2014).
  23. Zhang, S., Laurie, A. E., Ae, W., Meng, L., Lemaux, P. G. Similarity of expression patterns of knotted1 and ZmLEC1 during somatic and zygotic embryogenesis in maize (Zea mays L.). Springer. 215 (2), 191-194 (2002).
  24. Doll, N. M., et al. Transcriptomics at maize embryo/endosperm interfaces identifies a transcriptionally distinct endosperm subdomain adjacent to the embryo scutellum. Planta. 32 (4), 833-852 (2020).
  25. Yi, F., et al. High temporal-resolution transcriptome landscape of early maize seed development. Plant Cell. 31 (5), 974-992 (2019).
  26. Gómez, E., et al. The maize transcription factor myb-related protein-1 is a key regulator of the differentiation of transfer cells. Plant Cell. 21 (7), 2022-2035 (2009).
  27. Bewley, J. D., Black, M., Halmer, P. The encyclopaedia of seeds: Science, technology and uses. CABI. , Wallingford, UK. (2006).
  28. Liew, L. C., et al. Temporal tissue-specific regulation of transcriptomes during barley (Hordeum vulgare) seed germination. Plant Journal. 101 (3), 700-715 (2020).
  29. Pirrello, J., et al. Transcriptome profiling of sorted endoreduplicated nuclei from tomato fruits: how the global shift in expression ascribed to DNA ploidy influences RNA-Seq data normalization and interpretation. Plant Journal. 93 (2), 387-398 (2018).
  30. Sreenivasulu, N., et al. Transcript profiles and deduced changes of metabolic pathways in maternal and filial tissues of developing barley grains. Plant Journal. 37 (4), 539-553 (2004).
  31. Bian, J., et al. Transcriptional dynamics of grain development in barley (Hordeum vulgare L). International Journal of Molecular Sciences. 20 (4), 962(2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Arpa Tohumu Geli imiDoku DiseksiyonuPloidi AnaliziAk SitometrisiEmbriyo zolasyonuEndosperm zolasyonuMaternal Doku zolasyonuBinok ler MikroskopiRNA Kalite AnaliziTah l Dokusu Safl
Video yakında

İlgili makaleler