Altın Nanopartikülleri ve Cucurbit [n]uril Agregaları İçinde Hassas Plazmonik Nanokavşakların Oluşumu Yoluyla Ürik Asidin Kantitatif SERS Tespiti

Pürin nükleotidlerin metabolizmasının son ürünü olan ürik asit, gut, preeklampsi, böbrek hastalıkları, hipertansiyon, kardiyovasküler hastalıklar ve diyabet gibi hastalıkların tanısında kan serumu ve idrarda önemli bir biyobelirteçtir ^1,2,3,4,5. Ürik asit tespiti için mevcut yöntemler arasında kolorimetrik enzimatik testler, yüksek performanslı sıvı kromatografisi ve kılcal elektroforez bulunmaktadır ve bunlar zaman alıcı, pahalı ve sofistike numune hazırlama^gerektirir 6,7,8,9.

Yüzey ile geliştirilmiş Raman spektroskopisi, titreşim parmak izleri aracılığıyla biyomoleküllerin seçici tespitine izin verdiği ve yüksek hassasiyet, hızlı tepki, kullanım kolaylığı ve hiç veya minimum numune hazırlama gibi sayısız avantaj sunduğu için rutin bakım noktası teşhisi için umut verici bir tekniktir. Asil metal nanopartiküllere (örneğin, Au NP'ler) dayanan SERS substratları, yüzey plazmon rezonansı 11'in neden olduğu güçlü elektromanyetik iyileştirme yoluyla analit moleküllerinin Raman sinyallerini 4 ila¹⁰ büyüklük¹⁰ sırasına kadar artırabilir. Özel boyutlardaki Au NP'ler, karmaşık metal nanokompozitlerin zaman alıcı üretiminin aksine kolayca sentezlenebilir¹² ve bu nedenle üstün özellikleri nedeniyle biyomedikal uygulamalarda yaygın olarak kullanılır^13,14,15,16. Makrosiklik moleküllerin, cucurbit[n]urillerin (CB n, burada n = 5-8 , 10), Au NP'lerin yüzeyine bağlanması, yüksek simetrik ve sert CB molekülleri Au NP'ler arasındaki hassas aralığı kontrol edebildiğinden ve ana konakçı-misafir komplekslerinin oluşumu yoluyla merkezde veya plazmonik sıcak noktalara yakın yerlerde analize edebildiğinden, analit moleküllerinin SERS sinyallerini daha da artırabilir (Şekil 1)^{17, 18,19,20}. Au NP: CBn nanoagregaları kullanan SERS çalışmalarının önceki örnekleri arasında nitropatlayıcılar, polisiklik aromatikler, diaminostilben, nörotransmiterler ve kreatinin^{21,22,23,24,25} bulunur ve SERS ölçümleri ya bir küvette ya da özel yapım bir numune tutucuya küçük bir damlacık yüklenerek gerçekleştirilir. Bu algılama şeması, yüksek tekrarlanabilirliğe sahip karmaşık bir matristeki biyobelirteçleri hızlı bir şekilde ölçmek için özellikle yararlıdır.

Burada, CB7'nin konakçı-misafir komplekslerini ve önemli bir biyobelirteç UA'yı oluşturmak ve sulu ortamda CB7 aracılı Au NP agregasyonları yoluyla 0.2 μM'lik bir tespit limiti ile UA'yı ölçmek için kolay bir yöntem, tanısal ve klinik uygulamalar için umut verici olan modüler bir spektrometre kullanılarak gösterilmiştir.

1. Au NP'lerin Sentezi

1. Au tohumlarının geleneksel Turkevich yöntemi ile sentezi²⁶
   1. 98.5 mg HAuCl 4· çözerek 10 mL 25 mM HAuCl₄ çözeltisi hazırlayın 3H₂O bir cam şişede 10 mL deiyonize su içeren öncül.
      NOT: Az miktarda HAuCl 4 öncüsünü bir tartım teknesine aktarın ve kristalleri tartmak için metalik spatula yerine plastik bir spatula kullanın, çünkü HAuCl₄ öncüsü metal laboratuvar gereçlerini aşındıracaktır. HAuCl₄ higroskopik olduğundan ve bu nedenle atmosferden su emerek zamanla ağırlığını artıracağından tartım adımı mümkün olduğunca hızlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. HAuCl₄ oldukça aşındırıcıdır ve ciddi cilt yanıklarına ve göz hasarına neden olabilir. Kullanırken ekstra özen gösterin.
   2. Bir cam şişede 0.5 mL deiyonize su ile 64.5 mg sodyum sitrat tozunu çözerek 0.5 mL 500 mM sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın.
   3. 100 mL 0,25 mM HAuCl 4 çözeltisi vermek için 25 mM HAuCl₄ çözeltisinin 1 mL'sini 250 mL mavi kapaklı bir şişede 99 mL su ile seyreltin.
   4. 0,25 mM HAuCl 4 çözeltisinin 99,5 mL'sini_, bir kondenserle donatılmış 250 mL'lik üç boyunlu yuvarlak tabanlı bir şişeye ekleyin. Çözeltiyi kuvvetli bir şekilde karıştırarak 90 ° C'ye ısıtın ve sıcaklığı 15 dakika boyunca koruyun.
   5. 500 mM sodyum sitrat çözeltisinin 0,5 mL'sini reaksiyon karışımına enjekte edin ve çözeltinin rengi yakut kırmızısına dönene kadar sıcaklığı ve karıştırmayı koruyun.
      NOT: Reaksiyon yaklaşık 30 dakika sürer.
2. Kinetik olarak kontrol edilen yöntemle Au NP'lerin tohumlanmış büyümesi¹³
   1. Sentezlenmiş Au tohumu çözeltisini 70 °C'ye soğutun.
   2. Bir cam şişede 10 mL deiyonize su ile 154.8 mg sodyum sitrat tozu çözerek 10 mL 60 mM sodyum sitrat çözeltisi hazırlayın.
   3. 25 mM HAuCl₄ çözeltisinin 0,67 mL'sini ve 60 mM sodyum sitrat çözeltisinin 0,67 mL'sini 2 dakikalık bir zaman aralığıyla Au tohumlarına enjekte edin.
   4. Au NP'lerin boyutunu kademeli olarak 40 nm'ye çıkarmak için adım 1.2.3'ü tekrarlayın.
      NOT: 40 nm'ye ulaşmak için yaklaşık 10 büyüme adımı gerekir. Gerekli gerçek adım sayısı, kesin kuruluma bağlı olabilir.
3. Otomatik sentezleyici kullanılarak Au NP'lerin tohumlanmış büyümesi (Şekil 2)
   1. Bölüm 1'de hazırlanan Au tohumu çözeltisinin 25 mL'sini 50 mL'lik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve bir termomikserde 70 °C'ye soğutun.
      NOT: 25 mL su içeren 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne yerleştirilmiş bir termokupl termometre kullanarak termomikserin içindeki sıcaklığı izleyin.
   2. 3 mL Luer kilitli tek kullanımlık şırıngayı 2,5 mL 25 mM HAuCl₄ çözeltisi ile doldurun. Başka bir 3 mL Luer kilit tek kullanımlık şırıngayı 2,5 mL 60 mM sodyum sitrat çözeltisi ile doldurun.
   3. Şırıngaları şırınga pompalarına yerleştirin ve PEEK borusunu (150 μm iç çap) şırıngalara bağlamak için Luer-to-MicroTight adaptörlerini kullanın. Boruyu, termomikserdeki Au tohumu çözeltisini içeren santrifüj tüpüne yerleştirin.
   4. Her iki şırınga pompasını da 20 dakika boyunca (dakikada 8,357 μL) 0,1675 mL çözelti dağıtacak şekilde ayarlayın.
   5. Termomikser dönüş hızını 700 rpm'ye ayarlayın ve 25 mM HAuCl 4 çözeltisini içeren şırınga pompasında_Başlat'a basın.
   6. 2 dakika sonra, 60 mM sodyum sitrat çözeltisini içeren şırınga pompasında Başlat'a basın.
   7. HAuCl₄ çözeltisi enjeksiyonuna başladıktan 30 dakika sonra, analiz için Au NP çözeltisinin bir aliquot'unu çıkarın.
   8. Au NP'lerin çapını kademeli olarak 40 nm'ye çıkarmak için 1.3.5 – 1.3.7 arasındaki adımları tekrarlayın.
      NOT: Bu kurulum, adım 1.3.4'te eklenen reaktanların hacmini artırarak Au NP'leri bir adımda 40 nm'ye kadar büyütmek için kullanılabilir. Bu, aynı enjeksiyon oranını korurken dağıtım süresini artırarak elde edilir.

2. Au NP'lerin Karakterizasyonu

1. UV-Vis spektroskopisi
   1. Yarı mikro kuvars küvete 1 mL Au NP çözeltisi ekleyin.
   2. Spektrometreyi açın.
   3. Dalga boyu aralığını 400 - 800 nm olarak ayarlayın.
   4. Her numune için UV-Vis spektrumunu edinin.
2. Dinamik ışık saçılımı (DLS)
   1. Numune çözeltisini 0,22 μm filtreli plastik bir yarı mikro küvete filtreleyin.
   2. DLS cihazını açın.
   3. Sıcaklığı 25 ° C'ye ayarlayın ve 60 s için dengeleyin.
   4. Her numunenin hidrodinamik boyutunu ölçün.
3. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM)
   1. Numune çözeltisinin 5 μL'lik bir damlacığını C kaplı 300 mesh Cu ızgaraya damlatın ve havada kurutun.
      NOT: Bir TEM ızgarasında iyi dağılmış Au NP'ler elde etmek üzere daha konsantre Au NP çözelti numuneleri için seyreltme gereklidir.
   2. 200 kV hızlanma voltajında bir TEM kullanarak her numune için birden fazla TEM görüntüsü elde edin.
   3. Ortalama boyutu ve standart sapmayı hesaplamak için ImageJ kullanarak her numune için 200 Au NP çapını ölçün.

3. CB7-UA komplekslerinin oluşumu

1. 0,4 mM CB7 çözeltisinin hazırlanması
   1. 15 mL'lik bir cam şişeye 4.65 mg CB7 ekleyin.
      NOT: CB7 miktarı, literatürdeki çoğu raporda kullanılan CB7'nin (= 1163 Da) formül ağırlığına göre hesaplanır. Bununla birlikte, CB7 katı numuneleri tipik olarak sentez ve saflaştırma adımlarından kalan su, HCl, metanol ve diğer tuzları içerir ve numunede ~% 10 – 20 ölü ağırlığa katkıda bulunur. Sıkışmış çözücüler ve tuzlar, vakumlu fırında veya başka yollarla ısıtılarak uzaklaştırılamadı. Miktarları farklı numune partileri arasında değişir, ancak element analizi kullanılarak ölçülebilir. Bununla birlikte, sunulan protokol, CB7 numunelerinde ölçülmemiş miktarda çözücü ve tuz varlığına duyarlı değildir.
   2. Şişeye 10 mL su ekleyin ve kapağı sıkın.
   3. CB7 katı tamamen çözünene kadar numuneyi oda sıcaklığında sonikleştirin.
      NOT: CB7, literatür^27'ye göre sentezlenmiştir, ancak ticari olarak da temin edilebilir.
2. 0,4 mM UA çözeltisinin hazırlanması
   1. 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne 2.69 mg UA ekleyin.
   2. Tüpe 40 mL su ekleyin ve kapağı sıkın.
   3. Sıcaklığı 70 °C'ye, hızı 800 rpm'ye ve zamanı 2 saate ayarlayarak numune çözeltisini döndürmek için bir termomikser kullanın. Çözeltinin oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
      NOT: UA suda düşük çözünürlüğe sahiptir (0,40 mM)⁵. UA tozu tamamen çözülmemişse daha uzun süre girdap. Alternatif olarak, ultrasonication çözünmeyi kolaylaştırmak için kullanılabilir.
3. 0,4 mM UA çözeltisinin sıralı seyreltmeleri
   1. 10 mL 0,2 mM UA çözeltisi vermek için 0,4 mM UA çözeltisinin 5 mL'sini 15 mL'lik bir cam şişede 5 mL su ile seyreltin. Kapağı sıkın ve 30 s boyunca sonikasyon yapın.
   2. Tablo 1'de açıklandığı gibi uygun miktarda UA ve su kullanarak adım 3.3.1'i yineleyin.
4. CB7-UA komplekslerinin hazırlanması
   1. 1,5 mL'lik bir tüpe 0,4 mM CB7 çözeltisinin 0,75 mL'sini ve 0,75 mL'lik 0,4 mM UA çözeltisinin 0,75 mL'sini ekleyin. Kapağı sabitleyin ve 30 s boyunca sonikat yapın.
   2. Ev sahibi-misafir komplekslerinin oluşumunu sağlamak için 30 dakika bekleyin.
   3. Farklı konsantrasyonlarda UA çözeltisi kullanarak adım 3.4.1 - 3.4.2'yi tekrarlayın.

4. UA'nın SERS algılaması

1. Raman sisteminin deneysel kurulumu (Şekil 3)
   1. 633 nm He-Ne lazeri (22,5 mW) açın.
   2. Modüler Raman spektrometresini açın.
   3. Bilgisayarı açın ve yazılımı başlatın.
   4. Spektroskopi Uygulama Sihirbazı Simgesi'ne tıklayın ve ardından Raman'ı seçin.
   5. Yeni bir satın alma işlemi başlatın. Entegrasyon süresini 30 sn'ye, taramaları ortalama 5 sn'ye ve boxcar'ı 0'a ayarlayın.
   6. Arka plan spektrumunu saklayın ve lazer dalga boyunu girin (yani, 633 nm).
      NOT: Entegrasyon süresi her taramanın süresidir, ortalamaya göre taramalar her spektrumu oluşturmak için ortalama tarama sayısıdır ve boxcar ortalama²⁸ komşu piksel sayısıdır.
2. SERS substratlarının oluşumu
   1. 1,5 mL'lik bir tüpe 40 nm Au NP çözeltisinin 0,9 mL'sini ve önceden oluşturulmuş CB7-UA kompleks çözeltisinin 0,1 mL'sini ekleyin. Kapağı sabitleyin ve çözelti yakut kırmızısından mora değişene kadar sonikat yapın.
      NOT: Ticari sitrat stabilize 40 nm Au NP çözelti numuneleri de kullanılabilir. Tipik olarak, lokalize yüzey plazmon rezonans (LSPR) zirvesinin optik yoğunluğu, konsantre stok çözeltisi numunelerinden seyreltme yoluyla 1'e ayarlanır. Numunedeki sitrat konsantrasyonu tipik olarak 2 mM olarak tutulur.
   2. Numune çözeltisini yarı mikro bir küvete aktarın. Küveti Raman numune tutucusuna yerleştirin ve kapağı kapatın.
   3. Ölçümü başlatın.
   4. Beş ardışık SERS spektrumunu kaydetmek için otomatik kaydetmeyi ayarlayın.
   5. Ölçümü durdurun ve numuneyi değiştirin.
   6. Farklı konsantrasyonlarda CB7-UA çözeltisi kullanarak adım 4.2.1 - 4.2.5'i tekrarlayın.
      NOT: Toplama süresinin, Au NP'lerin toplanmasına aracılık etmeye büyük katkısı olan boş CB7 konsantrasyonundaki fark nedeniyle, 0.1 μM UA için 30 s ile 20 μM UA için 30 dakika arasında değişen nanoagregalardaki UA konsantrasyonuna bağlı olduğu bulunmuştur. CB7-UA kompleksi için, bir portal hacimli UA molekülü tarafından bloke edilir, bu da onu Au NP yüzeyine bağlanmak için kullanılamaz hale getirir ve bu nedenle NP agregasyonu^21'e aracılık edemez. Çözeltinin rengi yakut kırmızısından mora değiştiğinde numune ölçüm için hazırdır.

5. Veri analizi

1. Bilgi işlem
   1. Asimetrik en küçük kareler (ALS) eklentisine sahip taban çizgisini indirin ve Origin'e yükleyin.
      NOT: ALS eklentisi OriginPro gerektirir.
   2. Ham verileri Origin'e ekleyin.
   3. Her numunenin beş SERS spektrumundan ortalama bir değer hesaplayın. Değeri lazerin gücüne (yani 22,5 mW) ve entegrasyon süresine (yani 30 sn) bölün.
   4. İletişim kutusunu açmak için ALS simgesine tıklayın. Her ortalama spektrumun taban çizgisini düzeltmek için asimetrik faktörü 0,001'e, eşiği %0,03'e, yumuşatma faktörünü 2'ye ve yineleme sayısını 20'ye ayarlayın.
   5. Farklı UA konsantrasyonlarının SERS spektrumlarını, y ofsetleri ile istiflenmiş çizgiler kullanarak çizin. Çıkış, Raman kaymasına (cm-1) karşı yoğunluk (s-1 ^{mW-1 s-1} sayılır) olmalıdır.

Sunulan Au NP sentezinde, UV-Vis spektrumları, 10 büyüme adımından sonra LSPR zirvelerinin 521 nm'den 529 nm'ye kaydığını gösterirken (Şekil 4 A, B), DLS verileri, Au NP'lerin boyutu 25.9 nm'den 42.8 nm'ye yükseldikçe dar bir boyut dağılımı göstermektedir (Şekil 4C, D). TEM görüntülerinden ölçülen G0, G5 ve G10'un ortalama boyutları (Şekil 4E) sırasıyla 20.1 ± 2.1 nm, 32.5 ± 2.3 nm ve 40.0 ± 2.2 nm'dir ve her durumda 200 parçacık sayılmaktadır. Bu sonuçlar, bu protokolün tekdüze ve dar dağılmış Au NP'lerin sentezlenmesinde etkili olduğunu göstermektedir.

Sunulan SERS çalışmalarında, CB7 ve UA'nın konakçı-konuk kompleksleri, SERS spektrumundaki karakteristik UA sinyalleri tarafından desteklendiği gibi, Au NP: CB7 nanoagregaları içinde hassas plazmonik nanokavşakların oluşumuna aracılık eden boş CB7 ile oluşturulmuştur (Şekil 5A).

CB (+ ile işaretlenmiş) ve UA (*) Raman zirveleri için atamalar Tablo 2'de gösterilmiştir. Tersine, CB7'nin yokluğunda UA'nın hiçbir SERS sinyali gözlenemez, bu da CB7'nin Au NP'lerin toplanmasını tetiklemedeki kilit rolünü gösterir.

UA'nın SERS titrasyonunda, tekrarlanabilir plazmonik nanoyapıların (yani SERS substratlarının) yerinde oluşumunu sağlamak için 20 μM'lik sabit bir CB7 konsantrasyonu kullanılmıştır. Bu protokolde sunulan algılama şemasının yüksek hassasiyeti, UA zirvelerinden gelen net SERS sinyallerinin 640 cm-1 ve 1130 cm-1'de (sırasıyla iskelet halkası deformasyonuna ve C-N titreşimine atfedilir) ~0.2 μM'ye (Şekil 5B-D) kadar gözlemlenmesiyle gösterilmiştir. Ek olarak, SERS yoğunluğu ve UA'nın log konsantrasyonu arasındaki çok güçlü korelasyonlar (R 2 > 0.98), her iki tepe için de güç yasası ile elde edildi ve doğrusal bölgeler 0.2 ila 2 μM aralığında bulundu (Şekil 5E, F). SERS yoğunluğu ve log konsantrasyonu arasındaki doğrusal korelasyonların dar bir analit konsantrasyonu aralığı için yaklaşılabileceği, oysa verilerimizde gözlemlendiği gibi, log konsantrasyonu negatif sonsuzluğa yaklaştığında (yani, analit konsantrasyonu 0'a yaklaştığında) SERS sinyalinin 0'a yaklaştığı belirtilmelidir. SERS sinyalleri, Şekil 5E, F'de gösterilen küçük hata çubuklarının kanıtladığı gibi yüksek oranda tekrarlanabilir.

Şekil 1: Kendi kendine monte edilmiş Au NP: CB7 nanoagregaları içindeki hassas plazmonik nanokavşakların şematik gösterimi. Inset, agregasyonun boş CB7 tarafından aracılık edildiği plazmonik nanokavşakların yakınlaştırılmasını gösterirken, UA, konakçı-konuk kompleksi yoluyla Au NP'lerin yüzeyinde zenginleştirilir. Şemanın ölçeğe çizilmediği belirtilmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: (a) Şematik illüstrasyon ve (b) otomatik Au NP sentezleyicinin fotoğrafı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Raman sisteminin şematik gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Au NP'lerin temsili karakterizasyonu. (A) Au NP'lerin UV-Vis spektrumları ve (B) büyüyen adımların sayısı 10'a yükseldikçe LSPR zirvelerinin kaymasını gösteren yakınlaştırma spektrumları. (C) Au NP'lerin hidrodinamik boyutu ve (D) büyüyen adımların sayısının bir fonksiyonu olarak parçacık boyutunun karşılık gelen grafiği. (E) 5 ve 10 büyüme adımından sonra Au tohumlarının ve Au NP'lerin boyutlarını gösteren Au NP'lerin TEM görüntüleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Au NP: CB7 nanoagregaları içindeki UA tespitinin temsili SERS sonuçları. (A) CB7'nin varlığında veya yokluğunda UA'nın SERS spektrumları. CB7 ve UA'nın Raman zirveleri sırasıyla + ve * ile işaretlenmiştir. (B) Tam aralıklı, (C) 600 - 700 cm-1 yakınlaştırma ve (D) 1100 - 1180 cm-1 yakınlaştırmalı SERS spektrumları 0 ila 20 μM konsantrasyonlarında UA. UA'nın ana Raman zirveleri * ile işaretlenmiştir. Spektrumlar taban çizgisi düzeltildi ve netlik için ofset edildi. (E,F) UA konsantrasyonuna karşı SERS tepe yoğunluğunun karşılık gelen grafikleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1: UA çözeltisinin sıralı seyreltmeleri.

Tablo 2: CB7 ve UA 2,4,29'un Raman zirveleri için atamalar.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.