Antijen Etiketli Blokaj Lezyonu ile Tekrarlayan Karşılaşmaların Görselleştirilmesi

Çift iplikçik kopmalarına hücresel yanıt, kopmaları spesifik genomik bölgelere yönlendirmek için giderek daha güçlü yöntemlerin art arda gelmesi nedeniyle iyi belgelenmiştir ^1,2,3. Konumun kesinliği, bölgede biriken ve DNA Hasar Yanıtına (DDR) katılan proteinlerin ve diğer faktörlerin kesin karakterizasyonunu sağlar, böylece kırılmaları onaran Homolog Olmayan Son Birleştirme (NHEJ) ve Homolog Rekombinasyon (HR) yollarını yönlendirir. Tabii ki, birçok kırılma, radyasyon ve belirli dizilere saldırmayan kimyasal türler gibi ajanlar tarafından tanıtılır⁴. Bununla birlikte, bunlar için uçları etiketleme ve yerelleştirme için uygun yapılara dönüştürebilen prosedürler mevcuttur ^5,6. Kırılmalar, immünoglobulinin yeniden düzenlenmesi gibi biyolojik süreçlerle de ortaya çıkar ve son teknoloji, lokalizasyonlarına da izin verir⁷. Yanıt veren faktörler ve bu siteler arasındaki ilişki daha sonra belirlenebilir.

Kırılmalar ayrıca, doğal kırıcılar olmayan, ancak transkripsiyon ve replikasyon gibi DNA işlemlerini bozan bileşikler tarafından oluşturulan adduktların dolaylı bir sonucu olarak ortaya çıkar. Bu tıkanıklıklara hücresel yanıtın bir özelliği olarak, belki onarım sırasında veya nükleaz saldırısına karşı savunmasız bir yapıyı tetikledikleri için oluşabilirler. Tipik olarak, addukt, mola ve yanıt veren faktörlerle ilişki arasındaki fiziksel ilişki çıkarımsaldır. Örneğin, ICL'ler sisplatin ve Mitomisin C⁸ gibi kemoterapötikler tarafından ve abazik bölgeler^9'un bir reaksiyon ürünü olarak oluşturulur. ICL'ler, replikasyon çatalları^10'a güçlü bloklar olarak bilinir, böylece nükleazlar¹¹ tarafından bölünebilen çatalları durdurur. İplikçikler arasındaki kovalent bağlantı genellikle ara^12,13 olarak zorunlu kırılmalara sahip yollar tarafından rahatlatılır ve replikasyon çatalı^14'ü yeniden oluşturmak için homolog rekombinasyon gerektirir. Çoğu deneyde araştırmacı, bir replikasyon çatalının bir ICL ile çarpışmasının aşağı yönünde oluşan kırılmalara ilgi faktörlerinin tepkisini takip eder. Bununla birlikte, provokatif bir lezyonun lokalizasyonu için herhangi bir teknoloji bulunmadığından, replisome'un ve bileşen parçalarının ICL'ye yakınlığı ancak varsayılabilir.

Burada ICL'ler tarafından gösterilen, sekansa özgü olmayan kovalent katkılarla protein ilişkilerinin analizini sağlamak için bir strateji geliştirdik. Sistemimizde bunlar, binlerce yıldır cilt bozuklukları için terapötik olarak kullanılan fotoaktif bir doğal ürün olan psoralen tarafından tanıtılmaktadır¹⁵. Yaklaşımımız psoralenslerin iki önemli özelliğine dayanmaktadır. Birincisi, sisplatin veya Mitomisin C 8,16 gibi popüler bileşiklerin oluşturduğu% ^10'dan azının aksine^, adduktların% 90'ını aşabilen yüksek çapraz bağlantı oluşum sıklığıdır. İkincisi, bileşiğin çapraz bağlama kapasitesi kaybı olmadan konjugasyona erişilebilirliğidir. Trimetil psoralen'i kovalent olarak uzun zamandır kurulmuş bir immünoetiket olan Digoxigenin'e (Dig) bağladık. Bu, genomik DNA'daki psoralen adduktlarının Dig etiketinin immünoboyaması ile tespit edilmesini ve konvansiyonel immünofloresan¹⁷ ile görselleştirilmesini sağlar.

Bu reaktif, önceki çalışmamızda, DNA lifi bazlı bir tahlil¹⁶ kullanılarak ICL'lerle replikasyon çatalı karşılaşmalarının analizine uygulandı. Bu çalışmada, replikasyonun bozulmamış bir ICL'den sonra devam edebileceğini bulduk. Bu, replikasyon stresi ile aktive olan ATR kinazına bağlıydı. CMG replikatif helikazın yapısı göz önüne alındığında replikasyon yeniden başlatma beklenmiyordu. Bu, GINS kompleksinin (PSF1, 2, 3 ve SLD5'ten oluşan G) ve CDC45 (C)^18'in proteinleri tarafından kilitlenen lider iplik sentezi için şablon ipliği etrafında ofset aralıklı bir halka oluşturan MCM hetero-heksamerinden (M) oluşur. Replikasyonun, ICL distal tarafında, replisome çarpışmasının yanına kadar yeniden başlayabileceği önerisi, replisome'un yapısında bir değişiklik yapılmasını savundu. Bir ICL ile karşılaşma sırasında hangi bileşenlerin yanıt verdiği sorusunu ele almak için, burada açıklanan yaklaşımı geliştirdik. Dig etiketini, ICL'nin replisome^20'nin proteinleriyle yakın ilişkisini sorgulamak için Proximity Ligation Assays'da (PLA)^19'da bir ortak olarak kullandık.

1. Hücre hazırlığı

1. 1. Gün
   1. 35 mm'lik cam tabanlı kültür tabaklarını hücre yapıştırıcı çözeltisi ile ön işlemden geçirin.
   2. Tedaviden bir gün önce önceden işlenmiş bulaşıklardaki plaka hücreleri. Hücre deney gününde aktif olarak bölünmeli ve% 50-70 oranında birleşmelidir.
      NOT: Bu deneyde HeLa hücreleri,% 10 fetal sığır serumu, 1x penisilin / streptomisin ile desteklenmiş Dulbecco Modifiye Kartal Orta DMEM ile kullanılmıştır. Yapışkan hücre hatları için herhangi bir kısıtlama yoktur. Bununla birlikte, yapışkan olmayan hücreler slaytlar üzerine santrifüj edilmeli ve PLA tarafından analizden önce sabitlenmelidir.
2. 2. Gün
   1. Daha önce sentezlenmiş Dig-TMP'nin dondurulmuş bir alikotunu 1: 1 EtOH: H 2 O'da yeniden askıya alarak bir Digoxigenin Trimetil psoralen (Dig-TMP) stok çözeltisi hazırlayın. çözünmüş Dig-TMP'nin 100x seyreltmesinin (H₂O cinsinden) 250 nm'de OD'yi ölçerek konsantrasyonu belirleyin. Dig-TMP'nin yok olma katsayısı 25.000'dir. Her kullanımdan önce OD'yi 250 nm'de ölçerek konsantrasyonu doğrulayın ve stok konsantrasyonunu hesaplayın: Abs x 100 x 10⁶/25.000 = Konsantrasyon (μM cinsinden). Genel olarak, stok çözeltisi yaklaşık 3 mM'dir. Çözelti yaklaşık bir ay boyunca –20 ° C'de saklanabilir.
      NOT: Dig-TMP, burada açıklanan prosedürü izleyerek önceden kimyasal olarak sentezlenmelidir. Reflü 4'-klorometil-4,5',8-trimetilpsoralen, 12 saat boyunca azot altında toluen içinde 4,7,10-trioksa-1,13-tridekanidi-amin ile. Çözücüyü çıkarın ve silika jel kromatografisi ile 4'-[N-(13-amino-4,7,10-trioxatrideca)] aminometil-4,5',8-trimetilpsoralen ürününü geri kazanın. Ürünü, 18 saat boyunca 50 ° C'de dimetil formamid ve trietilamin içinde digoxigenin NHS esterine konjuge edin. Çözücüyü çıkarın ve hazırlayıcı ince tabaka silika jel kromatografisi ile kalıntıyı saflaştırın. Ürün bandı kloroformunu elute edin: metanol:% 28 amonyum hidroksit (8: 1: 0.1) karışımı. Solventleri buharlaştırın ve peleti P EtOH:_H2O içinde çözün.
   2. Dig-TMP stoğunu% 50 EtOH: H₂O'da hücre kültürü ortamına 5 μM'lik son bir konsantrasyona kadar ekleyin. Ortamı plakalardan aspire edin, önceden ısıtılmış Dig-TMP içeren ortamı ekleyin ve Dig-TMP'nin dengelenmesini sağlamak için plakaları 30 dakika boyunca bir inkübatöre (37 ° C,% 5 CO₂) yerleştirin.
   3. Hücreler inkübe edilirken, UV kutusunu ( Malzeme Tablosuna bakınız) 37 ° C'ye önceden ısıtın.
   4. Plakaları önceden ısıtılmış UV kutusuna yerleştirin ve hücreleri bu deney için 5 dakika boyunca 3 J /^cm2 UVA ışığı dozuna maruz bırakın. Plakalar, ışınlama sırasında 37 ° C'de tutulan bir termo-bloğun üzerine yerleştirildi. Formülü kullanarak zamanı hesaplayın:
      
   5. Bir pipet kullanarak ortamı aspire edin, taze önceden ısıtılmış ortam ekleyin ve plakaları inkübatöre 37 ° C'de, 1 saat boyunca% 5 CO_2'de geri yerleştirin.
   6. Ortamı çıkarın ve bulaşıkları fosfat tamponlu salin (PBS) ile bir kez nazikçe yıkayın.
   7. PBS'yi çıkarın ve oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca PBS'ye% 0.1 formaldehit (FA) ekleyin. Bu, sitoplazmik elementleri çıkarmak ve PLA arka planını azaltmak için gereken CSK-R (RNaz içeren sitoiskelet ekstraksiyon tamponu, 1.2.9'da tarif edilmiştir.) ön işlemi sırasında hücre ayrılmasını önler.
   8. FA'dan kurtulun ve bulaşıkları PBS ile bir kez yıkayın.
   9. CSK-R tamponu ekleyin ve sitoplazmayı çıkarmak için RT'de 5 dakika inkübe edin [CSK-R tamponu: 10 mM BORULAR, pH 7.0, 100 mM NaCl, 300 mM sakaroz, 3 mM MgCl₂, %0.5 Triton X-100, 300 μg/mL RNaz A]. Arabelleği aspire edin, taze CSK-R ekleyin ve RT'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: CSK tampon stoğu 4 °C'de saklanabilir ve kullanımdan hemen önce Triton X ve RNaseA eklenebilir.
   10. PBS ile üç kez yıkayın.
   11. RT'de 10 dakika boyunca PBS'de% 4 formaldehit içeren hücreleri sabitleyin.
   12. PBS ile hücreleri yıkayın. Bu adımı üç kez gerçekleştirin.
   13. Soğuk% 100 metanol ekleyin ve -20 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
   14. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın. Bu noktada hücreler PBS'de 4 °C'de nemli bir odada bir haftaya kadar saklanabilir.
   15. Hücreleri 80 μL 5 mM TritonX-100'de 4 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
   16. PBS'de 100 μL 5 mM EDTA içeren hücreleri, 37 ° C'de 30 dakika boyunca 1 μL 100 mg / mL RNaz A ile desteklenmiş olarak inkübe edin.
   17. PBS ile hücreleri üç kez yıkayın.
   18. Hücreleri bloke edici tamponda (PBS'de% 5 BSA ve% 10 keçi serumu) 4 ° C'de bir gece boyunca nemli bir odada saklayın.

2. Yakınlık ligasyon testi

NOT: 3. Günde yakınlık ligasyon testi yapın.

1. Antikor boyama
   1. Plaka başına 40 μL birincil antikor çözeltisi hazırlayın: İstenilen seyreltmeyi elde etmek için uygun miktarda birincil antikorları ekleyin (MCM5, CDC45, PSF1 veya pMCM2 gibi replisome bir bileşene karşı fare anti Digoxigenin ve tavşan antikoru, Malzeme Tablosunda belirtilen seyreltmeler) bloke tamponuna (24 μL'lik nihai hacme ulaşmak için). Dokunarak karıştırın ve RT'de 20 dakika bekletin. birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce dokunarak karıştırın.
   2. Kuyunun merkezine 40 μL birincil antikor çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat boyunca nemli bir odada inkübe edin. Boyama sırasında, PLA problarının ve bloke edici tamponun oda sıcaklığına ısınmasına izin verin.
   3. RT'de PBS-T [PBS-T: 1X PBS'de% 0.05 Ara-20] ile hücreleri yıkayın.
   4. Yıkarken bulaşık başına 40 μL PLA probu çözeltisi hazırlayın (PLA probları, bir PLUS veya MINUS oligonükleotidine kovalent olarak bağlı tavşan veya fare IgG'sini tanıyan ikincil bir antikordan oluşur): 8 μL PLA probu anti mouse-PLUS + 8 μL PLA probu anti tavşan-EKSI antikoru + 24 μL bloke tamponu. Karıştırın ve RT'de 20 dakika bekletin. birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın. Çözeltiyi plakadaki kuyunun ortasına yerleştirin.
   5. Son yıkamayı çıkarın, kuyunun ortasına 40 μL PLA prob çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat nemli bir odada inkübe edin.
   6. Tamponda yıkayın RT'de eğimli bir platformda her biri 10 dakika boyunca üç kez. Yıkama sırasında, ligasyon karışımını RT'ye getirin.
2. Ligasyon ve amplifikasyon
   1. Plaka başına 40 μL Ligasyon karışımı hazırlayın: 8 μL (5x) ligasyon stoğu + 31 μL damıtılmış su + 1 μL ligaz. Birden fazla plaka için ana karışımı hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın.
   2. Her plakaya 40 μL ligasyon çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 30 dakika boyunca nemli bir odada inkübe edin.
   3. RT'de eğilebilen bir platformda hücreleri tampon A ile her biri 2 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
   4. Çanak başına 40 μL amplifikasyon çözeltisi hazırlayın: 8 μL (5x) amplifikasyon stoğu + 31.5 μL damıtılmış su + 0.5 μL DNA Polimeraz. Birden fazla numune için bir ana karışım hazırlayın ve kuyucuklara uygulamadan önce iyice karıştırın.
   5. Her plakaya 40 μL amplifikasyon çözeltisi ekleyin ve 100 dakika boyunca 37 ° C'de nemli bir odada inkübe edin.
   6. Amplifikasyon çözeltisini aspire edin ve tampon B ile yıkayın. RT'de eğimli bir platformda her biri 10 dakika boyunca 6 yıkama yapın.
   7. RT'de 1 dakika boyunca 0.01x tampon B ile bir kez yıkayın.
   8. Tampon B'yi aspire edin ve ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 anti-fare IgG ve Alexa Fluor 568 anti-tavşan IgG'yi bloke edici çözelti içinde ikincil antikorlar, Alexa Fluor 488 anti-fare IgG ve Alexa Fluor 568 anti-tavşan IgG'yi bloke eden çözeltide, bloke edici tamponda, nemli bir odada, 37 ° C'de 30 dakika veya 4 ° C'de bir gecede inkübe edin.
   9. PBS-T ile hücreleri RT'de eğilebilir bir platformda her biri 10 dakika boyunca üç kez yıkayın.
   10. PBS-T'yi aspire edin ve DAPI ile montaj ortamına monte edin. Monte edilen plakalar hemen görüntülenebilir veya görüntülemeden önce karanlıkta en fazla 4 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

3. Görüntüleme ve nicelleştirme

1. Bir epifloresan veya konfokal mikroskopta görüntüleme yapın (3D görüntüleme isteniyorsa, 15 yığında en az 3 μm örtün). Üçlü deneyler yapın ve numune veya koşul başına en az 100 gözlem yapmak için yeterli sayıda alanı görüntüleyin. Aynı pozlama ayarlarını kullanarak kontroller de dahil olmak üzere tüm alanları ve örnekleri görüntüleyin.
2. Uygun bir görüntü analiz yazılımı ile sayısallaştırın (bu analizi tek veya çoklu düzlem görüntülerinde gerçekleştirebilen açık kaynaklı ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakınız).
   1. DAPI boyamasına dayalı hücre çekirdeklerini segmentlere ayırın. Nükleer PLA noktalarının tespitini gerçekleştirin. PLA noktalarını karşılık gelen çekirdeklerine atayın. Çekirdek başına PLA noktalarını csv dosyası olarak dışa aktarın (bkz. Ek Dosya 1 ve Ek Dosya 2).
3. İstatistiksel analiz (önerilen açık kaynaklı ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakınız).
   1. Numunelerin Shapiro-Wilk testi ile normal bir dağılımı takip edip etmediğini doğrulayın.
   2. Bir Student-t testi (normal dağılım varsayımı karşılanıyorsa) veya Wilcoxon-Rank Sum testi (bir örnek için normal dağılım varsayımı ihlal edilmişse) kullanarak iki örnek arasında anlamlı bir fark olup olmadığını belirleyin.
4. Veri görselleştirme: Farklı örnekler için veri dağılımını, medyan (Q₂), 25^{. (Q} ₁) ve 75^{. yüzdelik} dilimi görselleştirmek için kutu grafikleriyle birleştirilmiş nokta grafikleri oluşturun (Önerilen açık kaynak ve ticari yazılımlar için Malzeme Tablosuna bakın).

pMCM2'nin 4.3D gösterimi: ICL etkileşimleri

1. Plan Fluor 60x/1.25 sayısal diyaframlı yağ hedefi kullanarak dönen diskli konfokal mikroskop üzerinde PLA plakalarını görüntüleyin. 1,6 mm'yi kapsayan 16 yığın elde edin ve uygun görüntü analiz yazılımıyla 3B rekonstrüksiyonu oluşturun (bkz.

Sürüngen proteinler ile Dig-TMP'nin PLA'sı
Dig-TMP'nin yapısı Şekil 1'de gösterilmiştir. Trimetil psoralenin bir glikol bağlayıcı aracılığıyla digoxigenin'e konjuge edildiği sentezin detayları daha öncetartışılmıştı 17,21. Hücrelerin bileşik ile inkübasyonu ve ardından 365 nm ışığa (UVA) maruz kalmak, bileşiği fotoaktive eder ve çapraz bağlama reaksiyonunu yönlendirir. Adducts'un% 90'ından biraz fazlası ICL'lerdir16. Dig etiketi, çekirdek boyunca ICL'lerin varlığını ortaya koyan immünofloresan ile görselleştirilebilir (Şekil 2). MCM2 gibi bir replisome proteinin immünofloresansı, ICL'lerin girişinden etkilenmeyen bir dağılım olan çekirdek boyunca bir dağılımı da gösterir. Bu sonuçlar, DSB'lere DNA Hasar Yanıtı'nda (DDR) görüldüğü gibi, yanıt veren proteinlerin odak görünümünün, yanıtın bir özelliği olmadığını göstermiştir: ICL etkileşimleri.

Şekil 2'de gösterilen deneyde yanıtlayıcıların ICL'lerle etkileşimini görselleştirmek için, iki antijenin yakınlığını bildiren PLA'yı uyguladık (Şekil 3a). ICL'lerin uygulanmasından 1 saat sonra MCM5 ve Dig etiketinin ilişki sıklığını ölçtük (Şekil 3b). PLA sinyalleri, yanıtların ICL'lere yakınlığını gösterdi.

ICL'ler tarafından sunulanlar da dahil olmak üzere çoğaltma stresi, ATR kinaz22'yi aktive eder. ATR'nin birçok substratı arasında, serin 10823'teki MCM2 de dahil olmak üzere MCM proteinleri bulunur. ICL ile tekrarlanabilir bir karşılaşmanın, diğer birçok substratın yanı sıra MCM2'nin fosforilasyonuna neden olması beklenir. Bu beklentiye uygun olarak, pMCM2Ser108 ile Dig etiketi arasındaki PLA pozitifti (Şekil 3c). Diğer deneylerde plato frekansına 1 saat20'de ulaşıldığını bulduk. Bu sonuçları, genom boyunca çeşitli şekillerde yerleştirilmiş ve bir ICL'den değişken olarak uzak olan replisomelerin sonunda blokla karşılaştığını, ATR aktivasyonunu ve MCM2 fosforilasyonunu tetiklediğini gösteren olarak yorumladık.

Önceki şekillerdeki PLA sonuçları, çoklu optik düzlemlerin sıkıştırılmış bir toplamı olarak sunulmaktadır. Bununla birlikte, bireysel çekirdeklerden elde edilen sonuçlar, Video 1'deki pMCM2: Dig-TMP PLA için gösterildiği gibi üç boyutlu bir rekonstrüksiyonda da sunulabilir. Bu analiz, ICL'lerle replisome karşılaşmaların çekirdek boyunca gözlemlenebileceğini göstermiştir.

Replikasyon çatalı çalışmamız, ICL karşılaşmalarının beklenmedik bir replikasyon yeniden başlatma fenomeni16'yı ortaya çıkardığını göstermiştir. İşlevsel bir yanıtın kilitli halka yapısı göz önüne alındığında, replikasyon aparatının bileşiminin bir ICL ile çarpıştığında değişip değişmediğini sormak oldukça ilgi çekiciydi. Replikasyon çatallarının% 10'undan azı bir ICL ile temas ettiğinden, tüm replisomelerin protein bileşimini basitçe analiz etmek üretken olmazdı. Bununla birlikte, Dig ve çeşitli bileşenler arasındaki PLA bu soruyu ele almamıza izin verdi. pMCM2 ile elde edilen olumlu sonuçların aksine, GINS kompleksinin proteinlerinin ICL'lerle PLA sinyali veremediğini bulduk. Öte yandan, CDC45 ile yapılan tahlil pozitifti, bu da diğer kilitleme proteininin tutulduğunu gösteriyordu (Şekil 4a,b). Hücreler bir ATR inhibitörü ile inkübe edildiğinde, yeniden başlatma tamamen bastırıldı ve GINS: Dig PLA güçlü bir şekilde pozitifti (Şekil 4c). Bu sonuçları yorumlamamız, ATR aktivitesinin yokluğunda GINS proteinlerinin tutulduğu, CMG helikazın kilitli bir konfigürasyonda kaldığı ve ICL20'den sonra replikasyon yeniden başlatma olmadığı yönündeydi.

Şekil 1: Digoxigenin antijen etiketine bağlı trimetil psoralenin yapısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Replisome protein MCM5 ve DIG TMP'nin immünofloresansı ayrık odaklar göstermez. Hücreler Dig-TMP ve UVA ile tedavi edildi ve 1 saat sonra MCM5 ve Dig için immün boya uygulandı. Beyaz çubuk 5 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Dig-TMP ve MCM5 arasındaki PLA. (a) MCM5 replisome proteini ile ICL üzerindeki Dig etiketi arasındaki etkileşime uygulanan Proximity Ligation Assay'ın şeması. Şema basitleştirilmiştir. Pratikte primer antikorlar, oligonükleotidlere kovalent olarak bağlanmış sekonder antikorlar tarafından bağlandı. (b) MCM5 ve Dig-TMP arasındaki PLA. Etkileşim alanlarını gösteren ayrık sinyallere dikkat edin. Sinyal dağılımını (nokta grafiği) ve medyanı (kutu grafiği kırmızı çubuk), 25. ve 75. yüzdelik dilimleri (kutu uçları) ve aykırı değerler (aşırı çizgiler) hariç enyüksek ve en düşük değerleri gösteren nokta ve kutu grafikleri. Wilcoxon-Rank Sum testi, iki koşul arasında anlamlı bir fark olduğunu doğruladı (p<0.001). Beyaz çubuklar, pMCM2 ve Dig-TMP arasında 5 μm. (c) PLA'yı temsil eder. Bu sinyaller, MCM2'nin ATR'ye bağımlı fosforilasyonunu tetikleyen ICL ile replisome'un karşılaşmasını temsil eder. PLA, farklı hücrelerdeki karşılaşma sıklığının değişkenliğini bildirir. Beyaz çubuk 5 mm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Dig-TMP ve replisome kilitleme proteinleri arasındaki PLA. (a) CDC45: Dig-TMP. Beyaz çubuk 5 μm. (b) PSF1: Dig-TMP'yi temsil eder. Minimum sinyal frekansı, çapraz yolu bloke eden bir ATR inhibitörü ve PSF1 içeren GINS kompleksinin salınımı ile tedavi edilerek büyük ölçüde arttırılır. Beyaz çubuklar 5 μm'yi temsil eder. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: pMCM2'nin üç boyutlu rekonstrüksiyonu: PLA sinyallerini kazmak, çekirdek boyunca dağılımı gösterir. PCNA yeşil, PLA kırmızı, DAPI mavi renkte boyanır. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 1: PLA ölçümü için hücre profili işlem hattı. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Dosya 2: PLA ölçümü için IMARIS hücre modülü toplu iş parametreleri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.