Yöntem makalesi

Üriner Hücre Dışı Veziküllerin Flow Sitometri Kullanılarak Boyut Tayini ve Fenotipik Analizi

DOI:

10.3791/61695

⸱

23 Nisan 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Red de Apoyo a la Investigación, Universidad Nacional Autónoma de México e Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán, 2Departamento de Biología Celular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, idrar hücre dışı veziküllerin, uEV'lerin sağlıklı insan donörlerinden izolasyonu ve akış sitometrisi kullanılarak boyut ve yüzey belirteç ekspresyonu ile fenotipik karakterizasyonu için bir yöntemi tanımlar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre dışı veziküller, EV'ler, idrar gibi herhangi bir sıvıda herhangi bir hücre tipi tarafından salgılanan heterojen bir lipidik zar kompleksidir. EV'ler, eksozomlarda olduğu gibi çap olarak 40-100 nm'den mikro-parçacıklarda 100-1000 nm'ye kadar değişen farklı boyutlarda olabilir. Ayrıca birçok hastalığın prognozu ve teşhisi için biyobelirteç olarak kullanılabilecek farklı moleküller içerebilirler. Bu vezikülleri karakterize etmek için birçok teknik geliştirilmiştir. Bunlardan biri akış sitometrisidir. Bununla birlikte, EV'lerin konsantrasyonunun nasıl ölçüleceğini ve biyobelirteç tespiti ile birlikte boyutlarına göre nasıl ayırt edileceğini gösteren mevcut bir rapor yoktur. Bu çalışma, konfigürasyonunda herhangi bir değişiklik yapılmadan analiz için geleneksel bir sitometre kullanılarak idrar hücre dışı veziküllerin, uEV'lerin izolasyonu, miktar tayini ve fenotipifikasyonu için bir prosedürü tanımlamayı amaçlamaktadır. Yöntemin sınırlamaları, numune başına en fazla dört farklı biyobelirteçin boyanmasını içerir. Yöntem ayrıca numunede bulunan EV'lerin miktarı ile sınırlıdır. Bu sınırlamalara rağmen, bu protokol ve müteakip analizleriyle, böbrek ve beyin hasarını içeren hastalıklarda, EV belirteçlerinin zenginleşmesi ve idrar örneklerinde bulunan bu veziküllerin bolluğu hakkında daha fazla bilgi edinebiliriz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hayvanlarda kan böbreklerden 250 - 300 kez geçirilerek süzülür; Bu süre zarfında idrar oluşur. Bu biyoakışkanın üretimi, glomerüler filtrasyon, tübüler yeniden emilim ve salgılama dahil olmak üzere bir dizi işlemin sonucudur. Metabolik atık ürünler ve elektrolitler idrarın ana bileşenleridir. Ayrıca, peptitler, fonksiyonel proteinler ve hücre dışı veziküller (EV'ler) gibi diğer yan ürünleratılır 1,2,3,4,5,6. Başlangıçta, su dengesi bozukluğu olan hastalardan alınan idrar örneklerinde idrar hücre dışı veziküller (uEV'ler) tanımlandı. Bu hastalar, daha sonra bu hastalık için bir biyobelirteç olarak kullanılan aquaporin-2 (AQP2) gibi moleküllerin varlığını gösterdi7. Daha sonraki birkaç çalışma, uEV'lerin hücresel kökenini belirlemeye odaklandı ve bu yapıların böbrek hücreleri (glomerulus, podositler, vb.) ve endotelyal veya lökositik soyların diğer hücre tipleri tarafından salgılanabileceğini açıkladı. Ayrıca, uEV'lerdeki sayı ve molekül zenginleşmesi birçok hastalık ve bozukluğun durumu ile ilişkili olabilir 8,9,10,11,12,13,14.

Toplamda, EV'ler, lipid çift katmanları tarafından çevrelenen ve hücreler tarafından pasif veya aktif mekanizmalar yoluyla farklı sıvılara salınan oldukça heterojen bir parçacık ailesini oluşturur. Kökenlerine bağlı olarak, EV'ler endozom kaynaklı eksozomlar veya plazma zarından türetilmiş mikro-parçacıklar/mikropartiküller olarak sınıflandırılabilir. Bununla birlikte, bu sınıflandırma kriteri ancak parçacıkların biyogenezi doğrudan gözlemlendiğinde uygulanabilir. Bu nedenle, fiziksel, biyokimyasal ve hücresel köken dahil olmak üzere diğer önemsiz olmayan kriterler, bu alandaki birçok araştırmacı tarafından onaylanmıştır 15,16,17. Analiz edilen izolatın doğasına bağlı olarak, EV'lerin karakterizasyonu için farklı analitik teknikler önerilmiştir. Örneğin, büyük (≥100 nm) veya küçük (≤100 nm) EV'lerin zenginleştirilmesine dayanarak, sırasıyla akış sitometrisi veya nanopartikül izleme yoluyla miktar tayini önerilmektedir18.

Günümüzde, EV'lerin birçok hastalık için biyobelirteç olarak kullanımı önem kazanmıştır, bu nedenle farklı kaynakların araştırılması araştırılmıştır. En umut verici kaynaklardan biri, kolay ve invaziv olmayan bir şekilde elde edilebildiği için idrardır. Bu nedenle, bu protokol, diferansiyel santrifüjleme ile uEV'lerin izolasyonu, florokrom konjuge antikorlarla işleme ve geleneksel 2 lazerli / 4 renkli sitometre kullanılarak aşağı akış analizi için bir prosedürü tanımlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan idrar örnekleri, donör tarafından bilgilendirilmiş onam imzalamış sağlıklı gönüllülerden elde edildi. Bu prosedürler Instituto Nacional de Ciencias Médicas y Nutrición Salvador Zubirán Araştırma Etik Komitesi tarafından da onaylanmıştır.

1. İdrar hücre dışı veziküllerin izolasyonu

NOT: uEV'lerin izolasyon protokolü ref.19'dan itibaren değiştirilmiştir. Şekil 1 , uEV'leri izole etmek için protokolün temsilini göstermektedir.

figure-protocol-1
Şekil 1: Akış sitometrisi analizi için uEV izolasyonuna genel bakış. Bu protokolde, hücreleri ve kalıntıları çıkarmak için önce günün ilk idrarını santrifüj edin. Daha sonra, THP proteinini uzaklaştırmak için tedavi ile büyük vezikülleri çıkarmak için santrifüjleyin ve son olarak uEV'leri tek bir yıkama ile zenginleştirmek ve elde etmek için ultrasantrifüjleme gerçekleştirin. WB doğrulaması için idrar fraksiyonlarını tutma adımları işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Sağlıklı gönüllülerden alınan ilk sabah idrarını (15 mL) kullanın. Tüm hücreleri ve kalıntıları temizlemek için idrarı 3.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
    NOT: Tercihen taze idrar kullanın; mevcut değilse, -20 ° C'de en fazla 3 ay süreyle saklanan veya -70 ° C'de en fazla 6 ay süreyle saklanan idrar kullanın. İdrar örneğini buz üzerinde çözdürün ve kuvvetlice girdaplayın. Tüm prosedürleri buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirin. Western blot analizi için isteğe bağlı bir adım, çift bir tüp yapmak ve ilk sabah idrarının 200 μL'sini ayrı bir tüpte alikot etmektir. Hücre dışı vezikül belirteçlerini kontrol etmek için numuneyi kullanana kadar -20 °C'de saklayın ve "tam idrar" olarak etiketleyin.
  2. Adım 1.1'de elde edilen süpernatanı yeni bir 15 mL konik santrifüj tüpüne aktarın, ardından 4 ° C'de 45 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı 8 mL'lik bir polikarbonat ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve bunu buz üzerinde saklayın.
    NOT: İsteğe bağlı olarak, Western blot analizi için "hücresiz idrar" olarak etiketlenmiş ayrı bir tüpte adım 1.1'de elde edilen süpernatantın 200 μL'sini alikot edin.
    1. Tamm-Horsfall proteininin uzaklaştırılması, THP
      NOT: THP idrarda bulunur ve bir bireyin böbrek hastalığı olduğunda zenginleştirilir. THP'nin uEV'lere bağlanabildiği için uEV'lerin verimini azalttığı bildirilmiştir. Bu proteini uzaklaştırmak için bir indirgeyici ajanın kullanılması gereklidir 3,6.
      1. 250 mM sükrozu 10 mM trietanolamin ile karıştırarak izolasyon çözeltisini hazırlayın. PH'ı 7.6'ya ayarlayın.
      2. Adım 1.2'de elde edilen peleti 500 μL izolasyon çözeltisi ile karıştırın ve ardından 5 μL β-merkaptoetanol ekleyin.
      3. Pelet karışımını 37 °C'de 10 dakika inkübe edin ve her 2 dakikada bir girdap yapın. 500 μL izolasyon çözeltisi ekleyin ve ardından 37 °C'de 10 dakika boyunca 17.000 x g'da santrifüjleyin. Elde edilen süpernatanı toplayın (indirgenmiş-toplanmamış THP artı uEV'ler içeren).
  3. Her iki ayrılmış süpernatanı da (1.2 ve 1.2.1.3 adımlarından) aynı 8 mL polikarbonat ultrasantrifüj tüpünde karıştırın ve ardından ultrasantrifüj sabit açılı bir rotor kullanarak 4 ° C'de 70 dakika boyunca 160.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: İsteğe bağlı olarak, Western blot analizi için, yukarıda elde edilen süpernatantın 200 μL'sini "EV'siz süpernatan" olarak etiketleyerek saklayın. Bu örnek, hücre dışı vezikül belirteçleri ararken negatif bir kontrol görevi görecektir.
  4. Süpernatanı atın. 8 mL polikarbonat tüpe buz gibi soğuk 1x PBS ekleyin ve 4 ° C'de 70 dakika boyunca 160.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: uEV'leri içerdiğinden peleti atmamaya dikkat edin. 1x PBS'nin en az 0,22 μm gözenekli şırınga filtresi ile sterilize edilmesi ve filtrelenmesi gerekir.
  5. Süpernatanı atın. Süpernatantın geri kalanını 8 mL polikarbonat tüpe ekleyin ve 4 ° C'de 70 dakika boyunca 160.000 x g'da santrifüjleyin.
  6. Süpernatanı atın ve uEV'leri yıkamak için pelete 8 mL buz gibi soğuk PBS ekleyin.
  7. Süpernatanı atın. Peletin kurumasını bekleyin ve ardından 1 mL buz gibi PBS ile tekrar süspanse edin. Kullanana kadar -70 °C'de saklayın.
    NOT: Western blot analizi yapıyorsanız, çift tüpün peletini 50 μL RIPA tamponu artı proteaz inhibitörleri ile yeniden süspanse edin. Kullanana kadar -20 °C'de saklayın.

2. UEV'lerin lekelenmesi

NOT: uEV'lerin boyanmasından ve analizinden önce, uEV'lerin uygun izolasyonunu doğrulamak içinMISEV2018 18 tarafından önerilen en az bir metodolojinin uygulanması önemlidir; burada, Western blot analizi tasvir edilmiştir. Şekil 2 , uEV lekesi için temsili bir protokolü göstermektedir.

figure-protocol-2
Şekil 2: Sitometrede uEV'lerin boyanmasına ve yakalanmasına genel bakış. (A) uEV boyamasının temsili. 500.000 uEV için antikor karıştırıldı ve 12 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edildi. Daha sonra CFSE eklendi ve 37 ° C'de 10 dakika inkübe edildi. UEV'lerin içinde CFSE vardı ve antikor antijenin yüzeyine bağlanacaktı. Akış sitometresindeki numunenin 100 μL'sini yavaş bir hızda yeniden süspanse etmek ve yakalamak için 400 μL soğuk PBS kullanıldı. (B) Analiz stratejisi. İlk nokta grafiği (SSC-H VS FL-X), uEV'ler için negatif kontrolü gösterir, ardından uEV'lerin CFSE ile boyanmasını gösteren nokta grafiği ve son olarak, uEV'lerin antikor boyamasını içeren bir histogram (siyah çizgi), negatif kontrol gri çizgide gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Malzeme Tablosunda belirtildiği gibi, herhangi bir geleneksel kolorimetrik protein tahlili kullanarak protein içeriğini ölçerek uEV'lerin nispi sayısını hesaplayın. UEV'lerin 1:5 oranında seyreltilmesini gerçekleştirin ve tahlil protein kitinde verilen veri sayfasındaki talimatları izleyin.
  2. Daha önce bildirilen bir formül20'ye dayanarak, 1 μg / mL uEV proteininin 800.000 uEV / μL'ye eşit olduğunu düşünün. 20 μL buz gibi soğuk PBS'de 500.000 uEV'nin bulunduğundan emin olun.
  3. Tüpleri Tablo 1'de belirtildiği gibi etiketleyin.
    NOT: Kullanılan tüp sayısı, kullanılan antikor sayısına bağlı olacaktır, 2 lazer / 4 renk sitometresi için sınırlama, kullanılabilecek tüp başına maksimum 4 antikordur; bu nedenle, kompanzasyon gerekmesine rağmen, sitometredeki yalnızca FL1, FL2, FL3 ve FL4 okunabilir. Bu prosedürler için, akış sitometrisi için 1.5 mL mikrosantrifüj tüpleri veya 5 mL yuvarlak tabanlı tüpler kullanın. İhtiyaç duyulan tüpler Tablo 1'de gösterilmiştir. Tüp 4 ve 5, bu protokolde kullanılacak tüm antikorların bir kokteylinden oluşur. İki problem tüpü (8 ve 9) örnek olarak verilmiştir; Bu nedenle, bu kontrol setinin her tüpte kullanılacak kombinasyona sahip olması gerekir.
Tüp 1.Megamix FSC boncukları
Tüp 2.PBS
Tüp 3.CFSE ile PBS
Tüp 4.Problem 1'in tüm antikorları ile PBS
Tüp 5.Problem 2'nin tüm antikorları ile PBS
Tüp 6.Otofloresan kontrolüHerhangi bir reaktif içermeyen uEV'ler, sadece PBS'de.
Tüp 7.#uEVsCFSE ile uEV'ler
Tüp 8.Sorun 1CD37 FITC, CD53 PE, ADAM10 APC ile uEV'ler
Tüp 9.Sorun 2CD9 FITC, TSPAN33 APC ile uEV'ler

Tablo 1: Tüplerin etiketlenmesi. Tüplerin nasıl etiketleneceğini gösteren örnek. İlk tüpler gerekli tüm kontrollerdir. Antikorlar-florokromlar içeren tüpler lekelenmeye bağlı olacaktır.

  1. Etiketli tüplere 500.000 uEV içeren 20 μL PBS ekleyin.
  2. Daha önce titre edilmiş antikorları Tablo 1'de belirtildiği gibi ekleyin. Gece boyunca 4 °C'de inkübe edin.
    NOT: Boyamadan önce, agregaları önlemek için antikorların 4 °C'de en az 5 dakika boyunca tam hızda santrifüjlenmesi önerilir. Burada kullanılan antikorlar, uEV'lerde bulunan proteinlere bir örnektir ve şu anda hazırlanmakta olan bağımsız bir el yazmasına aittir.
  3. 3 numaralı tüpe 0.4 μL karboksifloresein süksinimidil ester (CFSE) [5 nM] ekleyin. 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.
    NOT: CFSE, bir numunede bulunan tüm EV'leri boyamak ve bir akış sitometresi analizi yapıldığında arka plan gürültüsünü ayırt etmek için kullanılan bir boyadır. Daha fazla bilgi için Tartışma bölümüne bakın.
  4. Tüm tüplere 400 μL buz gibi 1x PBS ekleyin.
  5. Tüm tüpleri 4 °C'de tutun.

3. Konvansiyonel bir sitometre kullanılarak uEV'lerin edinilmesi

NOT: Akış sitometresinin kullanımına ilişkin talimatlar (Malzeme Tablosuna bakınız) burada açıklanmıştır.

  1. 6 ve 8 tepeli boncukları kullanarak sitometrenin kalite kalibrasyonunu gerçekleştirin.
    NOT: Son zirvenin %CV'si 6'nın altında bir değer olmalıdır; Sitometre teknisyeni bununla ilgilenecektir.
  2. Akış sitometresi yazılımını açın.
    NOT: Yazılım açıldıktan sonra, 96 örnek için bir şablon, çalıştırma parametreleri ve nokta grafikleri veya histogramlar oluşturmak için "boş" bir bölüm içeren bir ekran gösteren yeni bir deney açılacaktır.
  3. Çalışmakta olan yazılımın ekranındaki parametreleri ayarlayın: Yakalamak için 100 μL örnek, yavaş çalışma, eşiği FSC-H'de 10.000 ve SSC-H'de 2.000 olarak ayarlayın.
    NOT: Burada önerilen eşik bir örnektir; Analiz edilen numunelere göre eşiğin ayarlanması gerekir.
  4. Tablo 1'de gösterildiği gibi 1 numaralı tüpü (Megamix tüp) yükleyin. Boncukları yakalayın. Nokta Grafiği seçeneğine tıklayarak yazılım ekranının "boş" kısmında iki nokta grafiği oluşturun. Şekil 3'ün A ve B paneli olarak oluşturun.
    NOT: Megamix floresan boncuklar (0,1, 0,3, 0,5 ve 0,9 μm boyutlarını sınırlamak ve boyutlar için şablon oluşturmak için kullanılan boncuklar) FL1 (FITC) dedektörü kullanılarak analiz edilebilir. Tüm nokta grafiklerinin ve histogramların yükseklik değerlerinde görüntülenmesi gerekir. Mümkün olduğu kadar çok olay kaydedin; Çalışma sayfasında yapılan herhangi bir değişiklik verileri değiştirmez.

figure-protocol-3
Şekil 3: Megamix FSC boncuk nokta grafikleri. Gösterilen nokta grafikleri, akış sitometresi yazılımı kullanılarak oluşturulmuştur; Akış sitometresinde görüntü çok benzer olacaktır. (A) Arka plan gürültüsünü önleyen boncukları seçmek için oluşturulan ilk nokta grafiği. (SSC-H VE FL1-H). (B) Boncukların farklı boyutlarını gösteren, önceki kapının seçilmesiyle oluşturulan nokta grafiği. (SSC-H'YE KARŞI FSC-H). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Yazılım ekranının "boş" bölümünde, kullanılan her florokrom için bir nokta grafiği ve histogram oluşturun; Örnek olarak Ek Şekil 1'deki algoritmayı kullanın. Bunu yapmak için, her florokrom için Nokta Grafiği veya Histogram seçeneğine tıklayın.
    NOT: Şekil 3A'da gösterildiği gibi arka plan gürültüsü her zaman mevcut olacaktır. FL1'in 0 ila 1.000'i (x ekseni) arasındaki tüm noktalar oluşturulan geçidin dışındadır. Bu nedenle, yeterli sonuçlar elde etmek için tüm kontrol tüplerini kullanmak önemlidir. Her tüp yüklemesi arasında, kılıf sıvısını geri yıkayın ve bir tıkanıklık açma döngüsü gerçekleştirin. Yüklemeden önce her tüpü hafifçe çalkalayın. Ardışık beş tüp yükledikten sonra, 100 μL PBS 1x çalıştırın.
  2. Kesme değerlerini (negatif) ayarlamak için 2 ve 5 numaralı tüpleri yükleyin. Bunu yapmak için, Dikdörtgen Kapı simgesini (oluşturulan nokta grafiğinin altında bulunur) veya Çizgi Kapısı simgesini (oluşturulan histogramın altında bulunur) seçin; ve Ek Şekil 1'de gösterilenler gibi nokta grafikleri ve histogramlar elde etmek için sinyalin olmadığı bir yere yerleştirin.
    NOT: Tüm bu tüpler, 103'ten (1.500) fazla "floresan" olmayacağından, pozitif bölgenin% 0.70'den fazla yerleştirilmesini gerektirmez. Bu bölgeden daha ileride herhangi bir floresan varsa, kullanılan reaktifleri seyreltin. Bu nedenle, son ölçümlerden önce reaktifleri titre etmek önemlidir.
  3. Numune için negatif bölgeleri ayarlamak için 6 numaralı tüpü (otofloresan tüp) yükleyin. Bunu yapmak için, Dikdörtgen Kapı simgesini (oluşturulan nokta grafiğinin altında bulunur) veya Çizgi Kapısı simgesini (oluşturulan histogramın altında bulunur) seçin; Sinyalin olmadığı bir yere yerleştirin.
  4. Sonraki tüpleri yükleyin ( Tablo 1'de gösterilen 7 ila 9 arasındaki tüpler).
  5. Denemeyi kaydedin.
    NOT: Burada kullanılan sitometre yazılımı için, Deneyi Kaydet komutu, oluşturulan verileri kaydetmeyi ifade eder. Başka bir deyişle, akış sitometresi tarafından alınan tüm tüplerin ve her tüp için üretilen verilerin kaydedilmesi gerekir. Bunu yapmak için, Deneyi Kaydet düğmesine tıklamak gerekir.
  6. Verileri FSC dosyaları olarak dışa aktarın.

4. Verilerin bir akış sitometresi yazılımı ile analizi.

NOT: Malzeme tablosunda gösterilen akış sitometresi yazılımını kullanma talimatları bu bölümde açıklanmıştır. Şekil 4'te , boyut kapılarını oluşturma adımlarının yer aldığı çalışma alanı gösterilmektedir.

figure-protocol-4
Şekil 4: Verilerin analizine başlamak için tüm adımların bulunduğu çalışma alanı. Tüm görüntüler, çalışma alanının serigrafi baskısı ile oluşturuldu. (A) Eklenen örnek verilerle oluşturulan çalışma alanı (solda), tüp 1'in seçilmesiyle oluşturulan nokta çizimi, FSC boncukları, (sağda). (B,C), SSC-H ve FSC-H'ye sahip olmak için eksenin modifikasyonunu gösterir. (DF) her iki eksenin adım adım özelleştirilmesini gösterir. (G-I) farklı boncuk boyutlarının seçimini ve oluşturulmasını gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Akış sitometresi yazılımını açın. Örnek Ekle düğmesine tıklayarak örnekleri ekleyin ve dışa aktarılan FCS dosyalarını seçin.
  2. Bir nokta grafiği açmak için Megamix tüpüne tıklayın: SSC-H (y ekseni), VS FSC-H (x ekseni). T düğmesine tıklayarak (Veri Görüntüsünü Dönüştür) 0 ila 100.000 arasında görüntülemek için her iki ekseni de ayarlayın, Ekseni Özelleştir'e tıklayın, SSC-H veya FSSC-H'ye tıklayın ve ölçek değerini min 0 ve maksimum 100.000 olarak değiştirin (bkz. Şekil 4AF).
  3. Adım 4.2'de oluşturulan nokta grafiğinde kapıları 0.1, 0.3, 0.5 ve 0.9 μm için ayarlayın. Şekil 4GI'de gösterildiği gibi bir kapı oluşturmak için Dikdörtgen Kapı düğmesini seçin.
    NOT: Şekil 5 , pozitif bölgeleri oluşturma ve florokrom için Ortalama Yoğunluğu elde etme adımlarının bulunduğu çalışma alanını göstermektedir.

figure-protocol-5
Şekil 5: Elde edilen verileri analiz etmek için çalışma alanı. Tüm görüntüler, çalışma alanının serigrafi baskısı ile oluşturuldu. (A) Tüm örneklere uygulanan boyut kapısı ile oluşturulan çalışma alanı. (B) Seçilen otofloresan tüpü, boyut kapısını gösteren nokta grafiği ve seçilen bir boyut (0.1 μm) için histogram, her florokrom ve boyut için pozitif kapıyı elde etmek için bu histogramı kullanın. (C) Her florokrom ve boyut için pozitif kapılarla oluşturulan çalışma alanı. (D) Örnekler için oluşturulan Çalışma Alanı (solda) ve Düzen Düzenleyicisi (sağda). Mizanpaj Düzenleyicisi'nde, otofloresan tüpü için histogram ve FL1-H için pozitif tüp ve bunları değiştirmek için özellikler panelinin nasıl elde edileceği gösterilir. (E) Resim, ortalama yoğunluk floresan değerinin nasıl elde edileceğini gösterir. (F) Yazılımın istatistik bilgileriyle yapmasına izin verdiği tüm değişiklikleri gösteren, üç farklı florokrom için oluşturulan histogramlar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Oluşturulan kapıları (0.1, 0.3, 0.5 ve 0.9 μm) tüm numunelere uygulayın. Kapıları seçin, sürükleyip bırakarak Tüm Örnekler seçeneği, Şekil 5A'da gösterildiği gibi.
  2. Otofloresan tüpüne tıklayın. Her boyut için her florokrom için pozitif bölgeleri ayarlayın. Boyut kapıları ile SSC-H VS FSC-H nokta grafiğini açın, Tek Kapı Boyutu'na tıklayın. Yeni pencerede, histogram seçeneğini seçmek için y eksenine tıklayın. X ekseninde FL1-H'yi seçin, ardından pozitif bölgeyi oluşturmak için Aralık simgesini seçin. FL2-H ve FL4-H için işlemi tekrarlayın (bkz. Şekil 5B).
  3. Kapıları tüm örneklere uygulayın. Kapılar'ı seçin, Şekil 5C'de gösterildiği gibi Tüm Örnekler seçeneğine sürükleyip bırakın.
  4. Düzen Düzenleyicisi'ni açın.
  5. Her örneği düzenleyiciye sürükleyip bırakın. "Otofloresan" tüpünün boyutunu seçin, sürükleyip bırakın, ardından lekeli tüpün aynı boyutunu seçin, sürükleyip bırakın.
  6. Histogramın sağ alt kısmına tıklayın. Özellikler menüsünü açın. Efsane'ye tıklayın. Florokrom için ortalama yoğunluğu ekleyin.
    NOT: Özellikler'de, histogramın görünümünü değiştirmek için kullanılabilecek başka araçlar da vardır.
  7. Kalan florokromlar ve boyutları için aynı prosedürü tekrarlayın.

5. Numune başına uEV sayısını elde etmek için analiz.

NOT: Şekil 6 , numune başına uEV sayısını elde etme adımlarının yer aldığı çalışma alanını göstermektedir.

figure-protocol-6
Şekil 6: CFSE tüpünü analiz etmek için çalışma alanı. Tüm görüntüler, çalışma alanının serigrafi baskısı ile oluşturuldu. (A) Tüm boyutlar bölgesinin seçilmesiyle oluşturulan çalışma alanı, uEV'lerin toplamı (solda), seçilen kapıyı gösteren nokta grafiği (sağda). (B) Otofloresan tüpündeki CFSE negatif bölge için nokta grafiği SSC-H VS FL1-H. (C) Boyama tüpünde CFSE için nokta grafiği SSC-H VS FL1-H. (D) CFSE boyama istatistikleri ile elde edilen ve numunedeki uEV sayısını gösteren tablonun görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. Otofloresan tüpüne tıklayın. Boyut kapıları ile SSC-H VS FSC-H nokta grafiğinde, tüm boyutları içeren bir bölge oluşturun. Yeni Bölge'ye tıklayın. Pozitif bölgeyi ayarlayın (bkz. Şekil 6A,B).
  2. Kapıları tüm örneklere uygulayın. Kapıları seçin, Tüm Örnekler seçeneğinde sürükleyip bırakın.
  3. CFSE + uEVs tüpüne tıklayın. Yeni bölgeyi açın ve Şekil 6C'de gösterildiği gibi CFSE (FL1-H) için pozitif bölgeyi doğrulayın.
  4. Şekil 6D'deki çalışma alanında, tüp için # hücre verilerini kopyalayın. Bu sayı, akış sitometrisi (#uEVs FC) ile elde edilen #uEVs sayısıdır.
  5. Mikrolitre başına uEV sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü uygulayın:
    figure-protocol-7
  6. Çalışma alanında her florokrom (#uEVs/μL FLX) için mikrolitre başına #uEVs sahip olmak için FLX-H alt kümesinin istatistiklerini kopyalayın, bu sayı yüzdedir (%FLX alt kümesi).
  7. Her florokrom için mikrolitre başına uEV sayısını hesaplamak için aşağıdaki formülü uygulayın.
    figure-protocol-8
    NOT: Seçilen kapının tek bir boyut için mi yoksa tüm uEV'ler için mi olacağına bağlı olarak, seçilen verileri doğrulayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokol aracılığıyla ve uEV'lerin boyanmasından önce birkaç kontrol noktası vardır. Bu nedenle, öncelikle uEV'lerin ekstraktında bulunan protein miktarını doğrulamak önemlidir. Hücre dışı veziküllerle çalışan tüm araştırma grupları, adım 2.1'de belirtildiği gibi proteini ölçer. Ek Şekil 2 , 4E, 5E ve 6E kuyularında uEV fraksiyonunu içeren temsili bir 96 kuyu plakasını göstermektedir. 1A, 2A ve 3A kuyuları boşluklardan oluşur, ancak saflaştırılmış uEV'ler yoksa, kuyular benzer renk alacaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Günümüzde, hücre dışı veziküllerin çeşitli hastalıklar için biyobelirteç olarak kullanımı, özellikle idrar gibi invaziv olmayan kaynaklardan izole edilebilenler içinartmıştır 5,21,22,23,24. UEV'lerin izolasyonunun, sağlıklı bir bireyin durumunu ve çeşitli hastalıklardan muzdarip hastaların tanı/prognozunu bilmek için hayati bi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, araştırmanın potansiyel bir çıkar çatışması olarak yorumlanabilecek herhangi bir finansal veya ticari ilişkinin yokluğunda yürütüldüğünü beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma CONACyT (A3-S-36875) ve UNAM-DGAPA-PAPIIT Programı (IN213020 ve IA202318) tarafından sağlanan hibelerle desteklenmiştir. NH-I, CONACyT'den 587790 bursu ile desteklendi.

Yazarlar, bu protokolün gerçekleştirilmesi için değerli tavsiyeleri için Leopoldo Flores-Romo†, Vianney Ortiz-Navarrete, Antony Boucard Jr ve Diana Gómez-Martin'e ve idrar örnekleri için tüm sağlıklı bireylere teşekkür etmek istiyor.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
APC anti insan CD156c (ADAM10) antikoruBioLegend3527065 ve mikro; L'den 20'ye ve mikro; PBS
APC anti insan TSPAN33 (BAAM) antikoruBioLegend395406L'si 5 ve mikro; L'den 20'ye ve mikro;
JA-25.5O sabit açılı rotorlu PBS Avanti santrifüjündeBeckamn CoulterJ-26S XPI
BD Accuri C6 Akış SitometresiBD Biosciences
β-merkaptoetanolSIGMA-AldrichM3148
A-4-44 rotorlu tezgah üstü santrifüjEppendorf5804
BLUEstain 2 protein merdiveniGOLDBIOP008
CD9 (C-4) fare monoklonal antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-13118
CD63 (MX-49.129.5) fare monoklonal antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-5275
Akış sitometrisi için Hücre İzi CFSE hücre proliferasyon kitiThermo ScientificC34554
Chemidoc XRS + sistemiBIORAD5837
FITC anti insan CD9 antikoruBioLegend3121045 ve mikro ekleyin; L'den 20'ye ve mikro; PBS
FITC anti insan CD37 antikoruBioLegend'da3563045 & mikro ekleyin; L'den 20'ye ve mikro; PBS'de L UEV
Floresan sarı parçacıklarSpherotechFP-0252-2
Floresan sarı parçacıklarSpherotechFP-0552-2
Floresan sarı parçacıklarSpherotechFP-1552-2
FlowJo YazılımıBecton, Dickinson ve Şirket
Keçi anti-fare immünoglobulinleri/HRPDakoP0447
Halt proteaz inhibitör kokteyliThermo Scientific78429
Immun-Blot PVDF membran 0.22 & mikro; mBIORAD1620177
Megamix-Plus FSC boncuklarıCOSMO BIO CO. LTD7802
NuPAGE LDS numune tamponu 4XThermo ScientificNP0007
Rotorlu Optima ultrasantrifüj 90Ti sabit açılı 355530Beckamn CoulterXPN100
Page Blue protein boyama çözeltisiThermo Scientific24620
PE anti insan CD53 antikoruBioLegend3254065 ve mikro ekleyin; L'den 20'ye ve mikro; PBS
Pierce BCA Protein tahlil kitindeThermo Scientific23227
Pierce RIPA tamponuThermo Scientific89900
Polikarbonat kalın duvarlı santrifüj tüpleriBeckamn Coulter355630
Spherotech 8 Tepe doğrulama boncukları (FL1-FL3)BD Accuri653144
Spherotech 6 Tepe doğrulama boncukları (FL4)BD Accuri653145
SükrozSIGMA-Aldrich59378
TrietanolaminSIGMA-Aldrich90279
içinde uEV'lerin L UEV L uEV L uEV

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Decramer, S., et al. Urine in clinical proteomics. Molecular & Cellular Proteomics. 7 (10), 1850-1862 (2008).
  2. Nawaz, M., et al. The emerging role of extracellular vesicles as biomarkers for urogenital cancers. Nature Reviews Urology. 11 (12), 688-701 (2014).
  3. Pisitkun, T., Johnstone, R., Knepper, M. A. Discovery of urinary biomarkers. Molecular & Cellular Proteomics. 5 (10), 1760-1771 (2006).
  4. Urinology Think Tank Writing Group. Urine: Waste product or biologically active tissue. Neurourology and Urodynamics. 37 (3), 1162-1168 (2018).
  5. Wang, S., Kojima, K., Mobley, J. A., West, A. B. Proteomic analysis of urinary extracellular vesicles reveal biomarkers for neurologic disease. EBioMedicine. 45, 351-361 (2019).
  6. Merchant, M. L., Rood, I. M., Deegens, J. K. J., Klein, J. B. Isolation and characterization of urinary extracellular vesicles: implications for biomarker discovery. International Urology and Nephrology. 13 (12), 731-749 (2017).
  7. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  8. Jing, H., et al. The role of extracellular vesicles in renal fibrosis. Cell Death and Disease. 10 (5), 367(2019).
  9. Liu, X., et al. Tubule-derived exosomes play a central role in fibroblast activation and kidney fibrosis. Kidney International. 97 (6), 1181-1195 (2020).
  10. Quaglia, M., et al. Extracellular Vesicles as Mediators of Cellular Crosstalk Between Immune System and Kidney Graft. Frontiers in Immunology. 11, 74(2020).
  11. Simpson, R. J., Lim, J. W., Moritz, R. L., Mathivanan, S. Exosomes: proteomic insights and diagnostic potential. Expert Review of Proteomics. 6 (3), 267-283 (2009).
  12. Street, J. M., Koritzinsky, E. H., Glispie, D. M., Star, R. A., Yuen, P. S. Urine Exosomes: An Emerging Trove of Biomarkers. Advances in Clinical Chemistry. 78, 103-122 (2017).
  13. Thongboonkerd, V. Roles for Exosome in Various Kidney Diseases and Disorders. Frontiers in Pharmacology. 10, 1655(2019).
  14. Watanabe, Y., et al. Molecular Network Analysis of the Urinary Proteome of Alzheimer's Disease Patients. Dementia and Geriatric Cognitive Disorders Extra. 9 (1), 53-65 (2019).
  15. Jadli, A. S., Ballasy, N., Edalat, P., Patel, V. B. Inside(sight) of tiny communicator: exosome biogenesis, secretion, and uptake. Molecular and Cellular Biochemistry. 467 (1-2), 77-94 (2020).
  16. Svenningsen, P., Sabaratnam, R., Jensen, B. L. Urinary extracellular vesicles: Origin, role as intercellular messengers and biomarkers; efficient sorting and potential treatment options. Acta Physiologica. 228 (1), 13346(2020).
  17. Witwer, K. W., Thery, C. Extracellular vesicles or exosomes? On primacy, precision, and popularity influencing a choice of nomenclature. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1648167(2019).
  18. Thery, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Perez-Hernandez, J., et al. Increased Urinary Exosomal MicroRNAs in Patients with Systemic Lupus Erythematosus. PLoS One. 10 (9), 0138618(2015).
  20. Freyssinet, J. M., Toti, F. Membrane microparticle determination: at least seeing what's being sized. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 8 (2), 311-314 (2010).
  21. D'Anca, M., et al. Exosome Determinants of Physiological Aging and Age-Related Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Aging Neuroscience. 11, 232(2019).
  22. Lawson, C., Vicencio, J. M., Yellon, D. M., Davidson, S. M. Microvesicles and exosomes: new players in metabolic and cardiovascular disease. Journal of Endocrinology. 228 (2), 57-71 (2016).
  23. Lee, S., Mankhong, S., Kang, J. H. Extracellular Vesicle as a Source of Alzheimer's Biomarkers: Opportunities and Challenges. International Journal of Molecular Sciences. 20 (7), (2019).
  24. Mori, M. A., Ludwig, R. G., Garcia-Martin, R., Brandao, B. B., Kahn, C. R. Extracellular miRNAs: From Biomarkers to Mediators of Physiology and Disease. Cell Metabolism. 30 (4), 656-673 (2019).
  25. Hoorn, E. J., et al. Prospects for urinary proteomics: exosomes as a source of urinary biomarkers. Nephrology (Carlton). 10 (3), 283-290 (2005).
  26. Ranghino, A., Dimuccio, V., Papadimitriou, E., Bussolati, B. Extracellular vesicles in the urine: markers and mediators of tissue damage and regeneration. Clinical Kidney Journal. 8 (1), 23-30 (2015).
  27. Zhang, W., et al. Extracellular vesicles in diagnosis and therapy of kidney diseases. American Journal of Physiology-Renal Physiology. 311 (5), 844-851 (2016).
  28. Fernandez-Llama, P., et al. Tamm-Horsfall protein and urinary exosome isolation. Kidney International. 77 (8), 736-742 (2010).
  29. Royo, F., et al. Different EV enrichment methods suitable for clinical settings yield different subpopulations of urinary extracellular vesicles from human samples. Journal of Extracellular Vesicles. 5, 29497(2016).
  30. Rider, M. A., Hurwitz, S. N., Meckes, D. G. ExtraPEG: A Polyethylene Glycol-Based Method for Enrichment of Extracellular Vesicles. Scientific Reports. 6, 23978(2016).
  31. Lv, C. Y., et al. A PEG-based method for the isolation of urinary exosomes and its application in renal fibrosis diagnostics using cargo miR-29c and miR-21 analysis. International Urology and Nephrology. 50 (5), 973-982 (2018).
  32. Alvarez, M. L., Khosroheidari, M., Kanchi Ravi, R., DiStefano, J. K. Comparison of protein, microRNA, and mRNA yields using different methods of urinary exosome isolation for the discovery of kidney disease biomarkers. Kidney International. 82 (9), 1024-1032 (2012).
  33. Wang, D., Sun, W. Urinary extracellular microvesicles: isolation methods and prospects for urinary proteome. Proteomics. 14 (16), 1922-1932 (2014).
  34. Pospichalova, V., et al. Simplified protocol for flow cytometry analysis of fluorescently labeled exosomes and microvesicles using dedicated flow cytometer. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 25530(2015).
  35. van der Pol, E., et al. Standardization of extracellular vesicle measurements by flow cytometry through vesicle diameter approximation. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 16 (6), 1236-1245 (2018).
  36. Huyan, T., Du, Y., Huang, Q., Huang, Q., Li, Q. Uptake Characterization of Tumor Cell-derived Exosomes by Natural Killer Cells. Iranian Journal of Public Health. 47 (6), 803-813 (2018).
  37. Puzar Dominkus, P., et al. PKH26 labeling of extracellular vesicles: Characterization and cellular internalization of contaminating PKH26 nanoparticles. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1860 (6), 1350-1361 (2018).
  38. Morales-Kastresana, A., et al. Labeling Extracellular Vesicles for Nanoscale Flow Cytometry. Scientific Reports. 7 (1), 1878(2017).
  39. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Urinary Extracellular VesiclesFlow CytometryEV Size DeterminationPhenotypic AnalysisEV IsolationBiomarker DetectionEV QuantificationConventional CytometerKidney DiseaseBrain Damage
Video yakında

İlgili makaleler