Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Erişkin Kemirgenlerden Hipokampusun Dorsal Kutbundan Akut Beyin Dilimlerinin Hazırlanması

3.6K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61699

⸱

10 Eylül 2020

1Simons Initiative for the Developing Brain, Centre for Discovery Brain Sciences, The University of Edinburgh

Bu makalede

Özet

Bu protokolün amacı, elektrofizyolojik inceleme için dorsal hipokampus dilimleri üretmek için bir yöntemi tanımlamaktır. Bu prosedür, sağlıklı ana nöronların korunmasına izin veren koronal dilimleme açısına yakın bir dilimleme açısı ile dilim hazırlamadan önce soğutulmuş ACSF ile perfüzyon kullanır.

Özet

Akut kemirgen beyin dilimlerinden alınan tüm hücre yama-kelepçe kayıtları, hücresel ve sinaptik özelliklerin hassas bir şekilde ölçülmesini sağlayan modern nörofizyolojik araştırmaların temel dayanağıdır. Bununla birlikte, dilim elektrofizyolojisine ek olarak farklı deneysel modlar arasında korelasyonlu analizler yapmak için giderek artan bir ihtiyaç vardır, örneğin: immünohistokimya, moleküler biyoloji, in vivo görüntüleme veya elektrofizyolojik kayıt; beyin işleviyle ilgili her zamankinden daha karmaşık soruları yanıtlamak için. Bununla birlikte, bu çeşitli deneysel yaklaşımlardan anlamlı sonuçlar çıkarmak kolay değildir, çünkü nispeten iyi tanımlanmış beyin yapıları içinde bile, hücresel fonksiyonun yüksek derecede alt bölgesel varyasyonu mevcuttur. Bu, hiçbir yerde, hücresel ve moleküler özelliklere dayalı olarak iyi tanımlanmış dorso-ventral özelliklere sahip olan hipokampusun CA1'inden daha iyi örneklenemez. Bununla birlikte, yayınlanmış birçok çalışma, protein ekspresyon modellerini inceler veya hipokampusun dorsal genişliğinde in vivo aktiviteyi davranışsal olarak ilişkilendirir; ventromedial bölgeden elde edilen bulguları hücresel elektrofizyoloji ile mekanik olarak açıklayabilecektir. Bu, daha olgun hayvanlarda diğer deney modları gerçekleştirildiğinde, genç hayvanlarda birçok akut dilim elektrofizyolojik deneyin gerçekleştirilmesi gerçeğiyle daha da karıştırılmaktadır. Bu sorunları ele almak için, bu yöntem, olgun (>60 günlük kemirgenlerin) yapay beyin omurilik sıvısı ile transkardiyal perfüzyonunu ve ardından CA1 piramidal hücrelerden kayıt yapmak için dorsal hipokampusun septal kutbu dahil olmak üzere modifiye koronal dilimlerin hazırlanmasını içerir. Bu süreç, sağlıklı akut dorsal hipokampus dilimlerinin üretilmesine yol açar ve diğer ölçümlerle eşleşen dilim bazlı hücresel elektrofizyolojik sorgulamaya izin verir.

Giriş

Hipokampus, nispeten büyük boyutu ve belirgin laminer yapısı nedeniyle memeli beyninde tartışmasız en iyi çalışılmış yapıdır. Hipokampus bir dizi davranışsal süreçte rol oynamıştır: uzamsal navigasyon, bağlamsal bellek ve bölüm oluşumu. Bu, kısmen, in vivo analiz için kemirgenlerde hipokampusun dorsal kısımlarına göreceli erişim kolaylığından kaynaklanmaktadır. Gerçekten de, ana çıkış hücreleri tipik olarak piyal yüzeyden 2 mm'den daha azdır.

Kemirgenlerde, hipokampus, dorsal septumdan ventral neokortekse uzanan telensefalonun istilasından oluşan nispeten büyük bir yapıdır. 2 ana bölgeden oluşur: dentat girus ve cornu ammonis (CA); ikincisi, bağlantı, hücresel anatomi ve genetik özelliklere dayalı olarak dentat girus hilusa (eski adıyla CA4) uzanan iyi tanımlanmış 3 alt bölgeye (CA1-3) ayrılmıştır1. Bu yapı, sinaptik özellikler 2,3,4, anatomi5, genetik çeşitlilik 6,7,8 ve davranışsal işlev 9,10'da büyük farklılıklar olmasına rağmen, hipokampusun dorso-ventral kapsamı boyunca korunur. CA bölgelerinden, CA1 alt alanı büyük ölçüde glutamaterjik CA1 piramidal hücrelerden (CA1 PC'ler) oluşur, bunun için 3 alt tiptanımlanmıştır 11 ve nöronların ~%10'unu oluşturan inhibitör internöronlar, ancak tanımlanan 30'dan fazla alt tip ile oldukça çeşitlidir 12,13,14. Bölgesel spesifik farklılıklara ek olarak, normal yaşlanmanın sinaptik iletim15,16,17, anatomi18 ve genetik profil19 üzerinde dramatik etkileri olduğu gösterilmiştir. Hücresel ve sinaptik özelliklerin karmaşıklıklarını kontrollü bir şekilde değerlendirmek için mevcut altın standart yöntem, akut beyin dilimlerinden20 tam hücre yama-kelepçe kayıtlarının kullanılmasıdır.

Hipokampal fonksiyonun anlaşılması, davranışsal görevler, elektrotların veya görüntüleme pencerelerinin implantasyonu veya viral plazmit ekspresyonu için cerrahi veya anatomik olarak erişim kolaylığı nedeniyle büyük ölçüde dorsal manipülasyona dayanmaktadır. Ek olarak birçok çalışmada, bu işlemler gelişim sırasında beyin yapısındaki değişkenliği önlemek için geç juvenil veya yetişkin kemirgenlerle gerçekleştirilmektedir. Buna rağmen, hücresel ve hücre altı elektrofizyolojiyi incelemek için birçok yaklaşım, çoğunlukla hipokampusun enine düzlemindeki ventro-medial kısmından erken ve orta juvenil kemirgenlerdegerçekleştirilir 21,22,23,24,25. Tüm dorso-ventral kapsamın değerlendirildiği durumlarda, enine genişliği 4,26 korumak için bir doku kıyıcı kullanılır veya deney genç sıçanlarda27 veya farelerde28 gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, beynin diseksiyonundan önce dokunun soğutulmasının, sıçanlarda29 hipokampal yapıyı ve farelerde30,31 neokortikal nöronları koruduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, olgun sıçanlarda, modifiye edilmiş koronal dilimler tarafından üretildiği gibi, hipokampusun dorsal enine ekseninden beyin dilimlerinin üretimi ile ilgili bir ayrıntı yetersizliği vardır.

Bu protokol, yaşlı sıçanlardan alınan modifiye edilmiş dorsal hipokampus dilimlerindeki tek veya çift nöronlardan tam hücre yama kelepçesi kayıtlarının elde edilebileceği ve ardından post-hoc morfolojik tanımlamanın yapılabileceği bir yaklaşımı tanımlar. Soğutulmuş yapay beyin omurilik sıvısının (ACSF) transkardiyal perfüzyonunu takiben sağlıklı beyin dilimleri elde edilir, bu da CA1 PC'lerden ve lokal internöronlardan elektrofizyolojik özelliklerin ölçümünü kolaylaştırır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvanlar, İçişleri Bakanlığı ve Kurumsal yönergelere (HO# P135148E) göre üretildi ve bakımı yapıldı. Tüm sıçanlar 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu ve yiyecek ve suya ad libitum erişim sağlandı.

1. Soğutulmuş ACSF'nin transkardiyal perfüzyonu

  1. Tüm deneylerden önce, ~ 200 mL sakaroz-ACSF (Tablo 1) -20 ° C'de dondurucuya (dilimleme için yarı donana kadar) ve ~ 100-200 mL filtrelenmiş sükroz-ACSF'yi buz üzerine (perfüzyon için), karbojen (% 95 O2/5% CO2).
  2. Yetişkin bir fareyi ev kafesinden toplayın ve gürültü ve ışık seviyelerine alışması için prosedür odasındaki bir tutma kafesine ~ 30 dakika yerleştirin.
  3. Diseksiyon araçlarını (Şekil 1A), perfüzyon alanını ve enjekte edilebilir anestezikleri (100 mg / kg'lık bir nihai konsantrasyon için yaklaşık 1 mL 200 mg / mL sodyum pentobarbital) hazırlayın.
  4. İçine küçük bir bez kağıt mendil veya pamuk yünü koyarak uygun bir anestezi odası hazırlayın. Odadaki emici malzemeye 1-2 mL uçucu izofluran anestezik ekleyin.
  5. Fareyi sakinleştirmek için bir anestezi odasına yerleştirin. Solunum hızı saniyede ~ 1 sığ nefese düşene kadar solunumu izleyin.
  6. Bu noktada, dilimleme sırasında kullanmak üzere buz üzerinde karbojen ile yarı dondurulmuş sakaroz-ACSF'yi köpürtmeye başlayın.
  7. Fareyi tartın ve ağırlığını not edin.
  8. Hazırlanan sodyum pentobarbitali intraperitoneal boşluğa enjekte ederek sıçanı terminal olarak anestezikleştirin. Sodyum pentobarbital dozu, daha önce alınan ağırlık ve ilacın stok konsantrasyonundan hesaplanan 100 mg / kg olmalıdır. Fareyi bir tutma odasına yerleştirin ve terminal anestezinin başlaması için 0,5-5 dakika bekleyin.
  9. Reflekslerin durduğunu onaylayın: künt bir prob (yani yuvarlak forseps) kullanarak hem kornea göz kırpma (göz bebeğine dokunun) hem de arka pençe kıstırma (bacağı kaldırın ve arka pençeyi sıkıştırın) reflekslerini test edin. Refleksler durduğunda, fareyi hipodermik iğneler kullanarak polistiren veya mantar cerrahi tahtasına sabitleyin.
  10. Göğüs boşluğunu açın ve kanülü kalbin sol ventrikülünün tabanına yerleştirin. Sağ atriyumu delin ve hemen buz gibi (0-1 °C) sakaroz-ACSF (50 mL / dakikada peristaltik bir pompa kullanarak) ile perfüzyona başlayın.
  11. Tam sıvı değişimi ve vücudun soğuması gerçekleştiğinde (<5 dakika), kanülü ve pimleri çıkarın ve ardından bir giyotin kullanarak kafasını çıkarın.
  12. Kemik makası ve Rongeur kemik aletleri kullanarak kafatasını dikkatli ve hızlı bir şekilde çıkarın (Şekil 1A,1B).
    1. Kemik makasını kullanarak foramen magnumdan 2 kez iki taraflı kesi yaparak başlayın ve kafatasını Rongeurs ile lambda dikişine çıkarın. Kemik makası ile orta hat sütürü boyunca gözlerin hemen arkasına kadar dikkatlice kesin.
    2. Kafatasından orta hatta dik olarak 2 kez iki taraflı kesik yapın. Rongeurs'u kullanarak kafatasını orta hat boyunca açın. İnce makas veya çengelli bir iğne kullanarak pia mater'i çıkarmak için ekstra özen gösterin.
  13. Künt bir spatula kullanarak beyni kafatasından çıkarın, kraniyal ve optik sinirleri yan yana sıkıştırarak kesin. Dilimlemeden önce beyni 1-2 dakika boyunca karbolene, yarı dondurulmuş (0-1 °C) sükroz-ACSF'ye yerleştirin.

2. Dorsal hipokampustan beyin dilimlerinin hazırlanması

  1. Perfüze edilmiş beyni yarı donmuş (0-1 °C) sakaroz-ACSF'den çıkarın ve filtre kağıdı ile kaplı bir cam Petri kabına koyun. Beyni ventral yüzeyine yerleştirin.
  2. Bir neşter (No. 22 bıçak) kullanarak, beyni sahneye yapıştırmak için düz bir yüzey oluşturmak için beynin arka kısmını ~10°'de dikeyden çıkarın (Şekil 1C).
  3. Vibratom aşamasına az miktarda siyanoakrilat yapıştırıcısı sürün. Beynin kesilen yüzeyinin kesit alanından yaklaşık% 50 daha büyük ince bir film yapmak için yapıştırıcıyı yayın.
  4. Beyni cam tabaktan bir spatula üzerine kaldırın, dokuyu yönlendirmek için bir boya fırçası kullanarak kesilmiş tarafı aşağı bakacak şekilde kaldırın. Fazla ACSF'yi çıkarmak için beyni bir doku parçasıyla kurulayın ve beyni, kesilmiş yüzeyi tutkalın merkezine kaydırın. Bir Pasteur pipeti kullanarak, yapıştırıcıyı beyin bloğundan uzaklaştırmak için beynin üzerine 1-2 mL buz gibi soğuk sükroz-ACSF ekleyin.
  5. Beyni dilimleme odasına yerleştirin ve yarı donmuş sükroz ACSF ile doldurun. Fazla buzu beyin bloğundan uzak tutmak için bir kaşık veya spatula kullanın ve ardından karbojenize edin (Şekil 1D).
  6. Vibratomun bıçağını yerine getirin: beynin dorsal yüzeyinden ~ 1 mm ve bregmanın dikey olarak ~ 1 mm önünde. Bıçağın tamamen suya daldırıldığından emin olun ve bir boya fırçası kullanarak kabarcıkları çıkarın.
  7. Beyni dilimlemeye başlayın. Dorsal hipokampusa kadar kesmek için, 1-1,5 mm'lik yatay bıçak hareketi ve ~90 Hz'lik karşılıklı salınım hızı ile 0,1-0,2 mm/s'lik bir hız kullanın. Dorsal hipokampusu dilimlerken, hızı 0.05-0.1 mm / s'ye düşürün.
  8. Beyin başına dorsal hipokampus dilimleri (nominal olarak 3-4 tam dilim veya 6-8 hemiseke dilim) toplayın. Uzunlamasına ventro-medial hipokampus dilimleri gerekiyorsa, dilimlemeye devam edin. Dorsal hipokampus dilimlendikten sonra, yaklaşık olarak 3. ventrikülün pozisyonunun ötesinde ekstra doku kesmeye gerek yoktur. Vibratomu durdurun, dilimi bükülmüş bir hipodermik iğne ile ayırın ve dilimleme odasının tabanında toplayın.
    NOT: Dilimler, deneysel gereksinimlere bağlı olarak 250-500 μm kalınlığında olabilir. Dorsal hipokampustan yapılan kayıtlar için, uygun mikroskopi koşullarına izin verirken yerel ağın çoğunu korumak için tipik olarak 400 μm kalınlığında dilimler kullanın.
  9. Dilimleri, diseksiyon mikroskobu altında yalnızca hipokampus ve üstteki korteksi içerecek şekilde kesin. Dilimleri, ön yüzeyi yukarı bakacak şekilde önceden ısıtılmış 35 ° C'lik odaya aktarın.
  10. Yapılacak deneye göre depolama haznesini belirleyin. Batık kayıt odalarında dilim yüzeyine yakın yüksek kaliteli tam hücre yama kelepçesi veya hücre dışı alan kayıtları elde etmek için, batık odalarda saklayın. Alternatif olarak, salınımlı ağ aktivitesinin kayıtları veya hücre dışı alan kayıtlarının arayüzü için bir sıvı/gaz arayüz odasında saklayın.
  11. Daldırılmış saklama koşulları için, dilimlerin saklama odasına giren son dilimden itibaren 30 dakika boyunca 35 ºC'de toparlanmasına izin verin. Bu, metabolik süreçlerin yeniden etkinleştirilmesine ve kesilmiş nöritlerin yeniden kapatılmasına izin verir. 30 dakika sonra saklama haznesini oda sıcaklığına aktarın.

3. Dorsal hipokampal nöronların kaydedilmesi

  1. Kılcal camdan kayıt yama pipetleri üretin. Bu protokolde 1,5 mm dış çap, 0,86 mm iç çap borosilikat cam kullanılır, bu da hücre içi çözelti ile doldurulduğunda 3-5 MΩ'luk bir uç direnci sağlar (Tablo 1). Enerjetik bileşenlerin bozulmasını önlemek için hücre içi çözeltileri buz üzerinde soğuk tutun ve kullanmadan önce filtreleyin (şırınga filtresi, gözenek boyutu: 0,2 μm).
  2. Karbojenat kaydı ACSF ve bir su banyosunda (35-40 ºC) önceden ısıtın. Karbojene edilmiş ve önceden ısıtılmış ACSF'yi peristaltik bir pompa tarafından desteklenen perfüzyon tüpü aracılığıyla kayıt odasına iletin. Bir dilimi hazneye aktarmadan birkaç dakika önce perfüzyona başlayın.
  3. Perfüzyonu durdurun ve bir beyin dilimini ön yüzeyi yukarı bakacak şekilde kayıt odasına aktarın. Dilimi, bir "arp" şekli oluşturmak için tek ipek lifleri eklenmiş bir platin halka ile yerinde tutun. Dilimleri, CA1'in stratum piramidali ilk kayıt pipetinin eksenine dik olarak çalışacak şekilde konumlandırın.
  4. Karbojene edilmiş ve önceden ısıtılmış (35-40 ºC) ACSF kaydını (Tablo 1) optimum 6-8 mL∙min-1 hızında yeniden başlatın.
    NOT: Yüksek akış hızları (6-8 mL∙min-1), dilimler32'deki ağ etkinliğini sürdürmek için idealdir. Daha düşük akış hızları (yani, 2-3 mL∙min-1), görüntüleme deneyleri için veya biyolojik olarak ilgili ağ aktivitesinin gerekli olmadığı yerlerde dilim stabilitesini korumak için kullanılabilir.
  5. 40x objektif büyütmeli (CCD kamera ile görselleştirilmiş) kızılötesi diferansiyel çıkarım kontrast (IR-DIC) optiklerini kullanarak dilim kalitesini değerlendirin. Str. piramidalde pürüzsüz ve hafif çukurlu bir yüzeyin altında 20-30 μm derinliklerde çok sayıda oval şekilli, orta derecede kontrastlı CA1 PC görülebiliyorsa, iyi dilim kalitesini varsayalım (Şekil 2A). Düşük kaliteli dilimler, düzgün olmayan bir dilim yüzeyine sahip, çok sayıda yüksek kontrastlı, büzülmüş veya şişmiş hücre içerir.
  6. Yayınlanan diğer verilerle karşılaştırmaya izin vermek için yama pipetlerini hücre içi bir çözeltiyle (örneğin, 24 mM'lik bir hücre içi [Cl-] bazlı) doldurun.
  7. Daha önce açıklandığı gibi tüm hücre yama kelepçesi kayıtlarını gerçekleştirin22. Kırılma üzerindeki membran potansiyeli (VM) -50 mV'den daha fazla depolarize olmuşsa hücreleri analizden çıkarın, seri direnç >30 MΩ'dur; veya seri direnç kayıt boyunca %>20 oranında değişir. Bu kayıt koşulları altında, seri direnç tipik olarak 8 – 25 MΩ aralığındadır ve 1 saate kadar stabildir.
  8. Dorsal hipokampustan CA1 içsel uyarılabilirliğini incelemek için, akım kelepçesi konfigürasyonunda aşağıdaki protokollerle tüm hücre kayıtlarıyla içsel fizyolojik özellikleri test edin:
    1. Öngerilim akımı uygulanmamış dinlenme membran potansiyelinden, 30 kez tekrarlanan küçük (-10 pA, 500 ms) akım adımlarını uygulayın.
    2. Öngerilim akımı uygulandığında -70 mV'dan, bir iz ailesinin 3 tekrarı ile 500 ms süreli (-100 ila +400 pA, 25 pA adım) depolarize edici akım adımlarına hiper uygulayın.
    3. 0,1 ila 20 Hz arasında değişken frekansla 100 pA tepeden tepeye genlikli bir sinüzoidal dalga uygulayın. 3 kez tekrarlayın.
    4. Aksiyon potansiyellerini 20, 40, 60, 80, 100 Hz'de sürmek için 5x 2 nA, 2 ms uyaran uygulayın. Frekans başına 10 tarama.
    5. -70 mV'luk bir voltaj kelepçesinden, kayıt için 5 dakikalık spontan uyarıcı postsinaptik akımlar (EPSC) uygulayın.
  9. Başarılı bir kaydın ardından histolojik analiz için hücreleri yeniden kapatmak için, yama pipetini yavaşça geri çekerek dıştan dışa yamalar üretin. -5 mV'luk bir test darbesi ile ölçüldüğü gibi deneysel seviyelerden >1 GΩ'a kadar seri dirençte bir artış gözlemlendiğinde, tutma potansiyelini -40 mV'a yükseltin ve pipeti tamamen geri çekin.
  10. Deney tasarımının gerekli istatistiksel gücünü karşılamak için aynı dilimde ek kayıtlar gerçekleştirin.
  11. Kaydedilmiş nöronları içeren beyin dilimlerini kayıt odasından çıkarın, 24 oyuklu plakaya yerleştirin, ACSF'yi %4 paraformaldehit (0.1 M fosfat tamponunda) ile değiştirin ve gece boyunca bırakın.
  12. Ertesi gün, PFA'yı 0.1 M fosfat tamponu ile değiştirin ve histolojik işleme kadar saklayın. Hücreleri daha önce tarif edildiği gibi floresan konjuge streptavidin ile görselleştirin22.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Yukarıda tarif edilen protokol, olgun sıçanlarda dorsal hipokampusun septal kutbundan canlı dilimlerin hazırlanmasına izin verir. Bu protokoldeki önemli bir faktör, dilim hazırlığından önce soğutulmuş sükroz-ACSF'nin perfüzyonudur ve bu da dilim yüzeyine proksimalde sağlıklı CA1 PC'leri ile sonuçlanır. Üretilen dilimin kalitesi, IR-DIC optiği altında görsel olarak değerlendirilir ve büyük, oval şekilli hücre gövdelerine sahip olduğu tanımlanan sağlıklı hücreler, kompakt tabakadan stratum oriens'e kadar strat...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, hipokampusun CA1'inin dorsal boyutundan yüksek kaliteli beyin dilimleri üretmek için bir protokol tanımlanmıştır ve bu bölgedeki birden fazla canlı nörondan kayıtlara izin verir. Koronal dilimlere yakın dilimlerden tüm hücre kaydının kombinatoryal yaklaşımı ve ardından nöron görselleştirmesi, hücre canlılığının ve kimliğinin doğrulanması için kritik öneme sahiptir.

Bu protokol, 2 ana nedenden dolayı güvenilir bir şekilde uygulanabilir dilimler üretir. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan eder.

Teşekkürler

Yazar, el yazması ve protokol optimizasyonu hakkındaki yararlı yorumları için Prof. David JA Wyllie, Dr. Emma Perkins, Laura Simoes de Oliveira ve Prof. Peter C Kind'e ve yayın maliyetlerini sağladığı için The Simons Initiative for the Developing Brain'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Edinme yazılımıMoleküler CihazlarpClamp 10
Yetişkin sıçanlarÇeşitliyokHerhangi bir yetişkin sıçan türü (60 gün ve üstü)
AmplifikatörMoleküler CihazlarAxopatch 700B
Analiz yazılımıÜcretsizStimfithttps://github.com/neurodroid/stimfit
Kemik MakasıFST16152-12Littauer tarzı
Kılcal CamHarvard Aparatı30-00601,5 mm dış çap, 0,86 mm iç çap filamentli borosilikat cam pipetler.
KarbojenBOCÇeşitli95 O2< / sub> / 5% CO2< / sub>
CCD kameraScientificaSciCamProhttps://www.scientifica.uk.com/products/
Kimyasallar / ReaktiflerSigma AldrichÇeşitliSigma Aldrich'ten temin edilen tüm laboratuvar reaktifleri.
Siyanoakrilat (yani RS Pro 3)RS Bileşenleri918-6872Jel bazlı siyanoakrilat formülasyonlarından kaçının
SayısallaştırıcıMoleküler CihazlarDigidata 1550B
Diseksiyon pimleri/iğneleriÇeşitliÇeşitli Kullanım16 gauge iğneler (yukarıda)
Elektrofizyoloji sistemiScientificaSliceScopehttps://www.scientifica.uk.com/products/ scientifica-slicescope
İnce iris makasıFST14568-12Tungsten-Karbür uçlu
Cam Petri kabıFisher Scientific12911408
Hipodermik iğnelerBD HealthcareÇeşitli16, 18 ve 22 gauge
İzofloran %100 W/W (yani IsoFlo)Zoetis50019100
Mayo tipi makasFST14110-17Kör uçlar
MikromanipülatörlerScientificaMicrostarhttps://www.scientifica.uk.com/products/scientifica-microstar-micromanipulator
Boya fırçasıSanat mağazasın/aYerel bir sanat dükkanından temin edilen ince kıllı bir boya fırçası.
Pasteur pipetiFisher Scientific11546963Bir cam Pasteur pipeti, ancak kör ucu pipeti aktarmak için kullanılacak şekilde kesilir.
Peristaltik pompaWatson Marlow12466260Tek kanallı peristaltik pompa
Pipet çektirme SutterInstrumentsP-97Diğer pipet üretim modelleri ve yöntemleri de aynı derecede iyi sonuç verecektir.
Plastik şırıngalar (1, 2, 5 mL)BD HealthcareÇeşitli
Rongeur kemik aletiFST16021-14
Dilim tutma haznesiEv yapımı
Dilim ağırlığı/arpHarvard AparatıSHD-22L/15Alternatifler uygun olacaktır.
Sodyum Pentobarbital (yani Pentoject)Animalcare Ltd10347/4014200 mg / mL; pentobarbitalin diğer formülasyonları uygun olacaktır
SpatulaBochem3213Fisher Scientific
Şırınga filtrelerindenFisher Scientific10482012Corning marka şırınga filtreleri, 0.22 ve mikro; m gözenek çapı.
VibtratomeLeica1491200S001Vibrocheck
Su BanyosuFisher Scientific151670155 Litre su banyosu ile VT1200S modeli, örneğin: Grant Instruments™ JBA5 scientifica-scicam-pro
% temin edilebilir

Kaynaklar

  1. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  2. Moser, M. B., Moser, E. I. Functional differentiation in the hippocampus. Hippocampus. 8 (6), 608-619 (1998).
  3. Babiec, W. E., Jami, S. A., Guglietta, R., Chen, P. B., O'Dell, T. J. Differential regulation of NMDA receptor-mediated transmission by SK channels underlies dorsal-ventral differences in dynamics of schaffer collateral synaptic function. Journal of Neuroscience. 37 (7), 1950-1964 (2017).
  4. Papatheodoropoulos, C. Striking differences in synaptic facilitation along the dorsoventral axis of the hippocampus. Neuroscience. 301, 454-470 (2015).
  5. O'Reilly, K. C., et al. Identification of dorsal-ventral hippocampal differentiation in neonatal rats. Brain Structure and Function. 220 (5), 2873-2893 (2015).
  6. Cembrowski, M. S., et al. Spatial gene-expression gradients underlie prominent heterogeneity of CA1 pyramidal neurons. Neuron. 89 (2), 351-368 (2016).
  7. Cembrowski, M. S., Wang, L., Sugino, K., Shields, B. C., Spruston, N. Hipposeq: a comprehensive RNA-seq database of gene expression in hippocampal principal neurons. elife. 5, 14997(2016).
  8. Leonardo, E., Richardson-Jones, J., Sibille, E., Kottman, A., Hen, R. Molecular heterogeneity along the dorsal–ventral axis of the murine hippocampal CA1 field: a microarray analysis of gene expression. Neuroscience. 137 (1), 177-186 (2006).
  9. Kheirbek, M. A., et al. Differential control of learning and anxiety along the dorsoventral axis of the dentate gyrus. Neuron. 77 (5), 955-968 (2013).
  10. Kjelstrup, K. B., et al. Finite scale of spatial representation in the hippocampus. Science. 321 (5885), 140-143 (2008).
  11. Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
  12. Booker, S. A., Vida, I. Morphological diversity and connectivity of hippocampal interneurons. Cell and Tissue Research. 373 (3), 619-641 (2018).
  13. Freund, T. F., Buzsaki, G. Interneurons of the hippocampus. Hippocampus. 6 (4), 347(1996).
  14. Pelkey, K. A., et al. Hippocampal GABAergic inhibitory interneurons. Physiological Reviews. 97 (4), 1619(2017).
  15. Barnes, C. A., Rao, G., Foster, T. C., McNaughton, B. L. Region-specific age effects on AMPA sensitivity: Electrophysiological evidence for loss of synaptic contacts in hippocampal field CA1. Hippocampus. 2 (4), 457-468 (1992).
  16. Potier, B., Jouvenceau, A., Epelbaum, J., Dutar, P. Age-related alterations of GABAergic input to CA1 pyramidal neurons and its control by nicotinic acetylcholine receptors in rat hippocampus. Neuroscience. 142 (1), 187-201 (2006).
  17. Ekonomou, A., Pagonopoulou, O., Angelatou, F. Age-dependent changes in adenosine A1 receptor and uptake site binding in the mouse brain: An autoradiographic study. Journal of Neuroscience Research. 60 (2), 257-265 (2000).
  18. Pyapali, G. K., Turner, D. A. Increased dendritic extent in hippocampal CA1 neurons from aged F344 rats. Neurobiology of Aging. 17 (4), 601-611 (1996).
  19. Blalock, E. M., et al. Gene microarrays in hippocampal aging: statistical profiling identifies novel processes correlated with cognitive impairment. Journal of Neuroscience. 23 (9), 3807-3819 (2003).
  20. Sakmann, B., Neher, E. Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes. Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).
  21. Bischofberger, J., Engel, D., Li, L., Geiger, J. R., Jonas, P. Patch-clamp recording from mossy fiber terminals in hippocampal slices. Nature Protocols. 1 (4), 2075(2006).
  22. Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell patch-clamp recordings from morphologically-and neurochemically-identified hippocampal interneurons. Journal of Visualized Experiments. (91), e51706(2014).
  23. Geiger, J., et al. Patch-clamp recording in brain slices with improved slicer technology. Pflügers Archive. 443 (3), 491-501 (2002).
  24. Aitken, P., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscience Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
  25. Siwani, S., et al. OLMα2 cells bidirectionally modulate learning. Neuron. 99 (2), 404-412 (2018).
  26. Dong, W. Q., Schurr, A., Reid, K. H., Shields, C. B., West, C. A. The rat hippocampal slice preparation as an in vitro model of ischemia. Stroke. 19 (4), 498-502 (1988).
  27. Dougherty, K. A. Differential developmental refinement of the intrinsic electrophysiological properties of CA1 pyramidal neurons from the rat dorsal and ventral hippocampus. Hippocampus. 30 (3), 233-249 (2020).
  28. Foggetti, A., Baccini, G., Arnold, P., Schiffelholz, T., Wulff, P. Spiny and Non-spiny Parvalbumin-Positive Hippocampal Interneurons Show Different Plastic Properties. Cell Reports. 27 (13), 3725-3732 (2019).
  29. Newman, G. C., Qi, H., Hospod, F. E., Grundmann, K. Preservation of hippocampal brain slices with in vivo or in vitro hypothermia. Brain Research. 575 (1), 159-163 (1992).
  30. Ting, J. T., Daigle, T. L., Chen, Q., Feng, G. Patch-Clamp Methods and Protocols. , Springer. 221-242 (2014).
  31. Ting, J. T., et al. Preparation of acute brain slices using an optimized N-methyl-D-glucamine protective recovery method. Journal of Visualized Experiments. (132), e53825(2018).
  32. Hajos, N., et al. Maintaining network activity in submerged hippocampal slices: importance of oxygen supply. European Journal of Neuroscience. 29 (2), 319-327 (2009).
  33. Papaleonidopoulos, V., Trompoukis, G., Koutsoumpa, A., Papatheodoropoulos, C. A gradient of frequency-dependent synaptic properties along the longitudinal hippocampal axis. BMC Neuroscience. 18 (1), 79(2017).
  34. Fuller, L., Dailey, M. E. Preparation of rodent hippocampal slice cultures. (10), Cold Spring Harbor Protocols. 4848(2007).
  35. Gee, C. E., Ohmert, I., Wiegert, J. S., Oertner, T. G. Preparation of slice cultures from rodent hippocampus. Cold Spring Harbor Protocols. 2017 (2), (2017).
  36. Andersen, P. Brain slices - a neurobiological tool of increasing usefulness. Trends in Neurosciences. 4, 53-56 (1981).
  37. Moyer, J. R., Brown, T. H. Patch-Clamp Analysis. , Springer. 135-193 (2002).
  38. Dougherty, K. A., et al. Differential expression of HCN subunits alters voltage-dependent gating of h-channels in CA1 pyramidal neurons from dorsal and ventral hippocampus. Journal of Neurophysiology. 109 (7), 1940-1953 (2013).
  39. Huang, S., Uusisaari, M. Y. Physiological temperature during brain slicing enhances the quality of acute slice preparations. Frontiers in Cellular Neuroscience. 7, 48(2013).
  40. Booker, S. A., et al. Presynaptic GABAB receptors functionally uncouple somatostatin interneurons from the active hippocampal network. Elife. 9, 51156(2020).
  41. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  42. Ordemann, G. J., Apgar, C. J., Brager, D. H. D-type potassium channels normalize action potential firing between dorsal and ventral CA1 neurons of the mouse hippocampus. Journal of Neurophysiology. 121 (3), 983-995 (2019).
  43. Arnold, E. C., McMurray, C., Gray, R., Johnston, D. Epilepsy-induced reduction in HCN channel expression contributes to an increased excitability in dorsal, but not ventral, hippocampal CA1 neurons. eNeuro. 6 (2), (2019).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Daha fazla makale keşfet

Hipokampal CA1Dorsal HipokampusTüm hücreli Yama kenetlemeTranskardiyal PerfüzyonModifiye Koronal KesitlerKemirgen ElektrofizyolojisiKesit HazırlamaHücresel ElektrofizyolojiBeyin Kesiti Hazırlama

Bu makale yayımlandı

Video yakında

Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.