Bu protokol, spontan keskin dalga dalgalanma aktivitesi sergileyen farelerden yatay hipokampal-entorhinal korteks (HEC) dilimlerinin hazırlanmasını açıklar. Dilimler basitleştirilmiş bir arayüz tutma odasında inkübe edilir ve kayıtlar, doku oksijenlenmesini ve ağ düzeyinde aktivitenin kendiliğinden ortaya çıkmasını teşvik etmek için hızlı akan yapay beyin omurilik sıvısı ile su altında koşullar altında gerçekleştirilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Spontan Hipokampal Ağ Aktivitesini Araştırmak için Akut Fare Beyin Dilimlemeyi
Bu makalede
Özet
Özet
Akut kemirgen beyin dilimlemesi, elektrofizyoloji, mikroskopi ve farmakoloji kullanarak tek hücreli çözünürlükle sinir devrelerinin organizasyonu ve işlevi hakkında fikir edinmek için çekişli deneysel bir yaklaşım sunar. Bununla birlikte, in vitro deneylerin tasarımında önemli bir husus, farklı dilim preparatlarının in vivo olarak gözlemlendiği gibi doğal sinirsel aktivite kalıplarını ne ölçüde yeniden özetlediğidir. Sağlam beyinde, hipokampal ağ, uyanık tüketici durumlar veya REM olmayan uyku sırasında meydana gelen keskin dalga dalgalanma komplekslerinin (SWR' ler) örneklediği gibi, hayvanın davranışsal durumunu yansıtan yüksek oranda senkronize popülasyon aktivitesi oluşturur. SWR'ler ve diğer ağ aktivitesi biçimleri, uygun koşullar altında izole hipokampal dilimlerde kendiliğinden ortaya çıkabilir. Hipokampal ağ aktivitesinin araştırılmasına güçlü beyin dilimi araç setini uygulamak için, doku sağlığını ve hipokampal ağ içindeki fonksiyonel bağlantının korunmasını optimize eden bir yaklaşım kullanmak gerekir. Fareler transkardiyal olarak soğuk sakkaroz bazlı yapay beyin omurilik sıvısı ile perfüzyona edilir. Hipokampus içeren yatay dilimler, sinaptik bağlantıyı korumak için 450 μm kalınlığında kesilir. Dilimler arabirim stili bir bölmede kurtarılır ve kayıtlar için batık bir odaya aktarılır. Kayıt odası, dilimin oksijenlenmesini iyileştirmek için yapay beyin omurilik sıvısının yüksek akış hızında çift yüzeyli süperfüzyonu için tasarlanmıştır. Bu protokol, karmaşık ve spontan ağ aktivitesinin in vitro araştırılmasına uygun sağlıklı doku sağlar.
Giriş
Canlı hipokampal dilimlerden in vitro elektrofizyolojik ölçüm, sayısız avantajı olan güçlü bir deneysel yaklaşımdır. Deneyci, dokudaki bireysel nöronlardan ölçümleri doğrudan görselleştirmek ve toplamak için bir mikroskop, mikromanipülatörler ve bir kayıt sistemi kullanabilir. Doku dilimleri ayrıca optogenetik, kemogenetik veya farmakolojik deneyler için fotostimülasyon veya ilaç teslimatı için çok erişilebilir.
Hipokampal ağ, hücredışı yerel alan potansiyeli 1 ,2,3,4,5'tesalınımlar ol....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Burada açıklanan tüm yöntemler Columbia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (AC-AAAU9451) tarafından onaylanmıştır.
1. Çözümler hazırlayın
- Tablo 1'de açıklandığı gibi dilimleme için sakkaroz kesme çözeltisi hazırlayın.
NOT: 1 L sakkaroz çözeltisi hazırladıktan sonra, bir buz tepsisinde az miktarda (yaklaşık 100-200 mL) dondurun. Bu donmuş sakkaroz buz küpleri buzlu bir bulamaç içine karıştırılacaktır (bkz. adım 4.3). - Tablo 2'de açıklandığı gibi kayıt için yapay beyin omurilik sıvısı (ACSF) hazırlayın.
- eser metalleri ve diğer safsızlıkları....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Burada, bu protokolde açıklandığı gibi hazırlanan HEC dilimlerinden temsili kayıtlar sunulmaktadır. Bir arayüz tutma odasında kurtarmadan sonra (Şekil 1C), dilimler tek tek su altında bir kayıt odasına aktarılır (Şekil 2B). Kayıt odası, peristaltik bir pompa kullanılarak karbojen doymuş ACSF ile birlikte verilir (Şekil 2A). Pompa ilk olarak ACSF'yi bir tutma kabından ısıtılmış bir hazneye çeker. Karbojen hatları, ortamın sürekli oks.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Doku sağlığını teşvik etmek ve spontan doğal ağ aktivitesinin ortaya çıkmasını desteklemek için tasarlanmış bu dilimleme protokolünde birkaç adım vardır: fare transkardiyel olarak soğutulmuş sakkaroz kesme çözeltisi ile perfüzyona sahiptir; yatay-entorhinal korteks (HEC) dilimleri ara veya ventral hipokampustan 450 μm kalınlığında kesilir; dilimler ısıtılmış ACSF ve nemlendirilmiş, karbojen bakımından zengin hava arayüzünde iyileşir; kayıt sırasında dilimler ACSF ile 32 ° C'ye ısıtılır ve batık bir kayıt odasında çift yü.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarın açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazar, Steve Siegelbaum'a destek için teşekkür eder. Finansman 5R01NS106983-02 ve 1 F31 NS113466-01 tarafından sağlanmaktadır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 3D yazıcı | Lulzbot | LulzBot TAZ 6 | |
| Akut beyin dilimi kuluçka tutucu | NIH 3D Baskı Değişimi | 3DPX-001623 | ChiaMing Lee tarafından tasarlanmıştır, https://3dprint.nih.gov/discover/3dpx-001623 |
| Adenozin 5′-trifosfat magnezyum tuzu | Sigma Aldrich | A9187-500MG | |
| Ag-Cl öğütülmüş peletler | Warner | 64-1309, (E205) | |
| agar | Becton, Dickinson | 214530-500g | |
| askorbik asit | Alfa Aesar | 36237 | |
| beher (250 mL) | Kimax | 14000-250 | |
| beher (400 mL) | Kimax | 14000-400 | |
| biocytin | Sigma Aldrich | B4261 | |
| blender | Oster | BRLY07-B00-NP0 | |
| Bonn makas, küçük | becton, Dickinson | 14184-09 | |
| filamentli borosilikat cam kılcal damarlar (OD 1,5 mm, ID 0,86 mm, uzunluk 10 cm) | Sutter Instruments | BF150-86-10HP | Ateşle cilalanmış kılcal damarlar tercih edilir. |
| kalsiyum klorür çözeltisi (1 M) | G-Biosciences | R040 | |
| kamera | Olympus | OLY-150 | |
| sıkıştırılmış karbojen gazı (%95 oksijen / %5 karbondioksit) | Airgas | X02OX95C2003102 | |
| basınçlı oksijen | Airgas | OX 200 | |
| sabit voltaj izole stimülatör | Digitimer Ltd. | DS2A-Mk.II | |
| lameller (22x50 mm) | VWR | 16004-314 | |
| siyanoakrilat yapıştırıcı | Krazy Glue | KG925 | için ideal olarak fırçalama formunu kullanın |
| Axograph | N/A | Herhangi bir eşdeğer yazılım (örn. pClamp) işe yarayacaktır. | |
| Dell Precision T1500 Tower İş İstasyonu Masaüstü | Dell | N/A | Katalog numarası belirli bir bilgisayara bağlıdır - herhangi bir bilgisayar, elektrofizyoloji edinme yazılımını çalıştırabildiği sürece çalışacaktır. |
| Digidata 1440A | Moleküler Cihazlar | 1-2950-0367 | |
| dijital zamanlayıcı | VWR | 62344-641 | 4 kanallı İzlenebilir zamanlayıcı |
| tek kullanımlık emici pedler | VWR | 56616-018 | |
| disektör makası | Güzel Bilim Araçları | 14082-09 | |
| çift kenarlı tıraş bıçağı | Personna | BP9020 | |
| çift otomatik sıcaklık kontrolörü | Warner Instrument Corporation | TC-344B | |
| çift yüzeyli veya laminer akışlı optimize edilmiş kayıt odası | N/A | N/A | Bu protokolde sunulan oda özel yapımdır. Ticari bir eşdeğeri, Warner Instruments'tan RC-27L olacaktır. |
| ekipman rafı | Automate Scientific | FR-EQ70 " | Bir raf kesinlikle gerekli değildir, ancak elektrofizyolojiyi düzenlemek için kullanışlıdır |
| Etilen glikol-bis (2-aminoetieter) - N, N, N ', N'-teetraasetik asit (EGTA) | Sigma Aldrich | 324626-25GM | |
| filtre kağıdı | Whatman | 1004 070 | |
| ince ölçekli | Mettler Toledo | XS204DR | |
| Alevli/Kahverengi mikropipet çektirme | Sutter Instruments | P-97 | |
| cam petri kabı (100 x 15 mm) | Corning | 3160-101 | |
| glikoz | Fisher Scientific | D16-1 | |
| Guanozin 5 birinci sınıf; -trifosfat sodyum tuzu hidrat | Sigma Aldrich | G8877-250MG | |
| buz kovaları | Sigma Aldrich | BAM168072002-1EA | |
| izofluran buharlaştırıcı | Genel Anestezik Hizmetleri | Tec 3 | |
| laboratuvar bandı | Fisher Scientific | 15-901-10R | |
| lens kağıdı | Fisher Scientific | 11-996 | |
| ışık kaynağı | Olympus | TH4-100 | |
| magnezyum klorür çözeltisi (1 M) | Kalite Biyolojik | 351-033-721EA | |
| manyetik karıştırma çubukları | Fisher Scientific | 14-513-56 | Katalog numarası, karıştırma çubuğunun boyutuna bağlı olacaktır. |
| mikromanipülatör | Luigs & Neumann | SM-5 | |
| mikromanipülatör (manuel) | Scientifica | LBM-2000-00 | |
| mikroskop | Olympus | BX51WI | |
| mikrospatula | Güzel Bilim Araçları | 10089-11 | |
| monitör | Dell | 2007FPb | |
| MultiClamp 700B Mikroelektrot Amplifikatörü | Moleküler Cihazlar | MULTICLAMP 700B | MultiClamp 700B, baş kısımları, pipet tutucular ve bir model hücresi içermelidir. |
| N- (2-Hidroksietil) piperazin-N & prim; - (2-etansülfonik asit), (HEPES) | Sigma Aldrich | H3375-25G | |
| iğne (20 gauge, 1.5 uzunluğunda) | Becton, Dickinson | 305176 | |
| naylon filament | YLI Wonder Görünmez İplik | 212-15-004 | boyut 0.004. Bu kedi. # Amazon.com |
| naylon ağdan | Warner Instruments Corporation | 64-0198 | |
| perstaltik pompa | Harvard Aparatı | 70-2027 | |
| Fosfokreatin di(tris) tuzu | Sigma Aldrich | P1937-1G | |
| pipet tutucular | Moleküler Cihazlar | 1-HL-U | |
| platin tel | Dünya Hassasiyeti | PT0203 | |
| polilaktik asit (PLA) filament | Ultimaker | RAL 9010 | |
| potasyum klorür | Sigma Aldrich | P3911-500G | |
| potasyum glukonat | Sigma Aldrich | 1550001-200MG | |
| potasyum hidroksit | Sigma Aldrich | 60377-1KG | |
| tıraş bıçağı | VWR | 55411-050 | |
| makaralı kelepçe | Dünya Hassas Aletler | 14041 | |
| ölçekli | Mettler Toledo | PM2000 | |
| neşter kolu | Güzel Bilim Araçları | 10004-13 | |
| dilim arp | Warner | SHD-26GH / 2 | |
| sodyum bikarbonat | Fisher Chemical | S233-500 | |
| sodyum klorür | Sigma Aldrich | S9888-1KG | |
| sodyum fosfat monobazik susuz | Fisher Chemical | S369-500 | |
| sodyum piruvat | Fisher Chemical | BP356-100 | |
| spatula | VWR | 82027-520 | |
| spatula/kaşık, büyük | VWR | 470149-442 | |
| steril neşter bıçakları | Tüy | 72044-10 | |
| karıştırıcı / sıcak plaka | Corning | 6795-220 | |
| musluk vanaları, 1 | World Precision Instruments | 14054 | |
| vana vanaları, 3 | World Precision Instruments | 14036 | |
| sakaroz | Acros Organics | AC177142500 | |
| döner kelepçeler için destek | Fisher Scientific | 14-679Q | |
| cerrahi makas, keskin/künt | Güzel Bilim Araçları | 14001-12 | |
| şırınga (1 mL) | Becton, Dickinson | 309659 | |
| şırınga (Luer-Lok ucu ile 60 mL) | Becton, Dickinson | 309653 | |
| üç uçlu kelepçe | Fisher Scientific | 05-769-8Q | |
| doku forsepsleri, büyük | Güzel Bilim Araçları | 11021-15 | |
| doku forsepsleri, küçük | Güzel Bilim Araçları | 11023-10 | |
| transfer pipetleri | Fisher Scientific | 13-711-7M | |
| boru | Tygon | E-3603 | ID 1/16 inç, OD 3/16 inç |
| boru | Tygon | R-3603 | ID 1/8 inç, OD 1/4 inç |
| vakumlu gres | Dow Corning | 14-635-5D | |
| titreşimli bıçak mikrotomu | Leica | VT 1200S | |
| faraday kafesli titreşim sönümleme masası | Micro-G / TMC-ametek | 2536-516-4-30PE | |
| hacimsel şişe (1 L) | Kimax | KIM-28014-1000 | |
| hacimsel şişe (2 L) | PYREX | 65640-2000 | |
| ılık su banyosu | VWR | 1209 |
Kaynaklar
- Buzsáki, G., Lai-Wo, S., Vanderwolf, C. H. Cellular bases of hippocampal EEG in the behaving rat. Brain Research Reviews. 6, 139-171 (1983).
- Buzsáki, G. Hippocampal sharp waves: Their origin and significance. Brain Research. 398, 242-253 (1986).
- Buzsáki, G.....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
