Method Article

Multipleks Floresan In Situ Hibridizasyonun Floresan İmmünohistokimya ile Taze Dondurulmuş veya Sabit Fare Beyin Kesitlerinde Birleştirilmesi

DOI:

10.3791/61709

⸱

June 25th, 2021

 ,  , 
1Department of Pharmacology, School of Medical Sciences, University of New South Wales

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, çok etiketli FISH ve floresan IHC sinyali elde etmek amacıyla hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyin bölümlerinde floresan in situ hibridizasyon (FISH) ve floresan immünohistokimyasını (IHC) birleştirmek için bir yöntemi açıklar. IHC, sitoplazmik ve membrana bağlı proteinleri hedefledi.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan in situ hibridizasyon (FISH), hücreler içindeki spesifik RNA transkriptlerinin varlığını ve uzamsal dağılımını tanımlayan moleküler bir tekniktir. Fonksiyonel olarak tanımlanmış nöronların nörokimyasal fenotiplemesi genellikle immünohistokimya (IHC) kullanılarak çoklu antikorlarla (hedefleme proteini) eşzamanlı etiketlemeyi ve in situ hibridizasyonun (RNA'yı hedefleme) birlikte optimizasyonunu gerektirir. Belirli nöronları karakterize etmek için bir "nörokimyasal imza" elde edilebilir, ancak karmaşık faktörler arasında, yöntemleri birleştirmeden önce FISH ve IHC hedeflerini doğrulama ihtiyacı ve aynı doku bölümü içinde aynı anda hedeflenebilecek sınırlı sayıda RNA ve protein bulunur.

Burada, hem taze dondurulmuş hem de sabit fare beyni preparatlarını kullanan, sırasıyla RNAscope FISH ve ardından floresan immün boyama kullanarak aynı beyin bölümündeki birden fazla mRNA'yı ve proteini tespit eden bir protokolü açıklıyoruz. İmmünohistokimyasal olarak tanımlanmış beyin sapı çekirdeklerinde düşük bolluklu mRNA'ların (örneğin, galanin reseptörü 1) ve yüksek bolluklu mRNA'ların (örneğin, glisin taşıyıcı 2) ekspresyon modelini tanımlamak için kombine yöntemi kullanıyoruz.

FISH tahlilinin çıkış yönündeki protein etiketlemesi için temel hususlar, doku hazırlığı ve FISH prob etiketlemesinin optimizasyonunun ötesine uzanır. Örneğin, antikor bağlanmasının ve etiketleme özgüllüğünün, FISH prob tahlili içindeki proteaz adımından zararlı bir şekilde etkilenebileceğini bulduk. Proteazlar, peptit bağlarının hidrolitik bölünmesini katalize ederek FISH probunun hücrelere girişini kolaylaştırır, ancak aynı zamanda sonraki IHC testi tarafından hedeflenen proteini sindirerek hedef bağlanma üretebilirler. Hedeflenen proteinin hücre altı yerleşimi, FISH prob testini takiben IHC başarısına katkıda bulunan bir başka faktördür. Hedeflenen protein membrana bağlandığında IHC özgüllüğünün korunduğunu gözlemledik, oysa IHC sitoplazmik proteini hedefleyen kapsamlı sorun giderme gerektirdi. Son olarak, slayta monte edilmiş sabit donmuş dokuların işlenmesinin taze donmuş dokudan daha zor olduğunu gördük, ancak IHC kalitesi, RNAscope ile birleştirildiğinde sabit donmuş doku ile genel olarak daha iyiydi.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöronların alt popülasyonlarını nörokimyasal olarak tanımlayan proteinler ve mRNA'lar genellikle sırasıyla immünohistokimya (IHC) ve/veya in situ hibridizasyon (ISH) kombinasyonu ile tanımlanır. ISH'nin IHC teknikleriyle birleştirilmesi, multipleks etiketleme kapasitesini en üst düzeye çıkararak fonksiyonel nöronlara özgü kolokalizasyon modellerinin karakterizasyonunu (nörokimyasal kodlama) kolaylaştırır.

RNAscope dahil olmak üzere floresan ISH (FISH) yöntemleri, radyoaktif ISH ve radyoaktif olmayan kromojenik ISH gibi önceki RNA tespit yöntemlerine kıyasla daha yüksek duyarlılık ve özgüllüğe sahiptir. FISH, tek mRNA transkriptleri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doku ön işleme adımlarının bir özeti Şekil 1'de bulunabilir. Tüm prosedürler, New South Wales Üniversitesi Hayvan Bakımı ve Etik Kurulu'na uygun olarak, hayvanların bilimsel amaçlarla kullanımı ve bakımı için yönergelere (Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi) uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

1. Taze donmuş beyin dokusunun örnek hazırlanması

  1. Transkardiyal Perfüzyon
    1. Heparinize (2500 U/L) 0.1 M fosfat tamponu (PB), pH 7.5 hazırlayın. Kuru buzu etanol ile karıştırarak kuru buz etanol bulamacı yapın. Bu, yaklaşık -72 °C'lik bir sıcaklığa sahip olacak ve hasat edilen dokunun hemen do....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, fare NTS'sinde sırasıyla taze dondurulmuş ve paraformaldehit sabit dokuları kullanarak GalR1 ve GlyT2 için mRNA ekspresyonunu lokalize etmek için multipleks FISH'i floresan IHC ile birleştirmek için bir yöntemi özetliyoruz. Yöntemlerde açıklanan doku işleme, FISH ve IHC prosedürlerinin bir boru hattı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmektedir. Tablo 1 , her şekilde kullanılan FISH probu ve antikor kombinasyonlarının bir özetini sunmaktadır.<.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sinirbilimde, FISH ve IHC, nöronal alt popülasyonlar içindeki mRNA veya proteinlerin uzamsal organizasyonunu ve işlevsel önemini araştırmak için rutin olarak kullanılır. Bu çalışmada açıklanan protokol, beyin bölümlerinde mRNA'ların ve proteinlerin aynı anda saptanması için kapasiteyi arttırır. Kombine multipleks FISH-IHC testimiz, hem taze dondurulmuş hem de sabit beyin preparatlarında NTS'deki farklı nöronal alt popülasyonların fenotipik olarak tanımlanmasını sağladı. Sabit donmuş doku preparatlarında FISH-IHC, güvenil.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Avustralya Araştırma Konseyi Keşif Projesi hibe DP180101890 ve Rebecca L Cooper Tıbbi Araştırma Vakfı proje hibe PG2018110

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
HAYVANLAR
C57BL/6 fareAvustralya BiyoKaynakları, Yosun VadisiMGI: 2159769
Phox2b-eGFP fareAvustralya BiyoKaynakları, Yosun VadisiMGI: 5776545
REAKTİFler
SiyanoakrilatLokitit
Etilen GlikolSigma-Aldrich324558
Heparin-SodyumClifford Hallam Sağlık 1070760Yerel veteriner tedarikçisine veya eczaneye danışın.
Lethabarb (Sodyum Pentabarbitol) Ötenazi EnjeksiyonuVirbac (Avustralya) Pty LtdN / ASodyum Pentabarbitol ile ilgili yerel farmasötik düzenlemeler için bir veterinere danışın
Moleküler dereceli agaroz tozuSigma Aldrich5077
OCT Bileşik, 118mLScigen Ltd4586
Paraformaldehit, prilled,% 95Sigma-Aldrich441244-1KG
Polivinilpirolidon, ortalama mol ağırlık 40.000  (PVP-40)Sigma-AldrichPVP40
ProLong Altın Antifade MountantInvitrogenP36930DAPI
RNAscope Multipleks Floresan Reaktif Kiti ile veya olmadan (3 plex'e kadar kapasite)Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)ADV320850 50x Yıkama tamponu ve Proteaz III
RNase AwayThermo-Fisher Scientific7003
Tris(hidroksimetil) içerirmoleküler biyoloji için aminometanSigma-Aldrich252859
Tween-20Sigma-AldrichP9416
EQUIPMENT
tezgah üstü inkübatörThermoline bilimsel mikro inkübatörModel: TEI-13G
Beyin Matrisi, Fare, 30g Yetişkin, Koronal, 1mmTed Pella15050
KriyostatLeicaCM1950
Çekme iğnesi (23 inç ölçer)BD0288U07
Hidrofobik BariyerKalem Vektör laboratuvarlarıH-4000
Kimtech Science Kimwipes Hassas Görev MendilleriKimberley Clark Professional34120
Olympus BX51OlympusBX-51
Peristaltik pompaColeparmer MasterflexL/S Serisi 
Retiga 2000R Dijital Fotoğraf MakinesiQImagingRET-2000R-F-CLRrenkli kamera
SuperFrost Plus Cam Slaytlar (Beyaz)Thermo-Fisher Scientific4951PLUS4
Titreşimli Mikrotom (Vibratom)LeicaVT1200S
Whatman kalitatif filtre kağıdı, Grade 1, 110 mm çapMerckWHA1001110
YAZILIMLAR
CorelDRAW Corel CorporationSürüm 7
FIJI (ImageJ Dağıtımı)Açık Kaynak/GNU Genel Kamu Lisansı (GPL)N/AImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, MC ve ark. (2017), "ImageJ2: Yeni nesil bilimsel görüntü verileri için ImageJ", BMC Biyoinformatik 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z    ve Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. ve ark. (2012), "Fiji: biyolojik-görüntü analizi için açık kaynaklı bir platform", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019 
< güçlü > BIRINCIL ANTIKORLAR< / güçlü >
Anti-Tirozin Hidroksilaz AntikoruMillipore SigmaAB1542Koyun poliklonal (1:1000 seyreltme), RRID: AB_90755
Anti-Tirozin Hidroksilaz Antikoru, klon LNC1Millipore SigmaMAB318Fare monoklonal (1:1000 seyreltme), RRID: AB_2201528
Anti-Veziküler Asetilkolin Taşıyıcı (VAchT) AntikoruSigma-AldrichABN100Keçi poliklonal (1:1000 seyreltme), RRID: AB_2630394
GFP AntikoruNovus BiologicalsNB600-308Tavşan poliklonal (1:1000 seyreltme), RRID: AB_10003058
Phox2b Antikoru (B-11)Santa Cruz Biotechnologysc-376997Fare monoklonal (1:1000 seyreltme), RRID: AB_2813765
İKİNCİL ANTİKORLAR
Alexa Fluor 488 AffiniPure Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Sıçan, Shp Sr Prot) Jackson ImmunoResearch711-545-152Eşek anti-Tavşan (1:400 seyreltme), RRID: AB_2313584
AMCA AffiniPure Eşek Anti-Koyun IgG (H + L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-155-147Eşek anti-Koyun (1:400 seyreltme), RRID: AB_AB_2340725
Cy5 AffiniPure Eşek Anti-Keçi IgG (H + L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Sıçan Sr Prot)Jackson ImmunoResearch705-175-147Eşek anti-Keçi (1:400 seyreltme), RRID: AB_2340415
Cy5 AffiniPure Eşek Anti-Fare IgG (H + L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Sıçan, Shp Sr Prot)Jackson ImmunoResearch715-175-151Eşek anti-Fare (1:400 seyreltme), RRID: AB_2619678
Cy5 AffiniPure Eşek Anti-Koyun IgG (H + L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Sıçan Sr Prot)Jackson ImmunoResearch713-175-147Eşek anti-Koyun (1:400 seyreltme), RRID: AB_2340730
RNASCOPE PROBES
Galanin Reseptörü 1 oligonükleotid probuACDBio448821-C1hedefleri bp 482 - 1669 (Gen bankası ref: NM_008082.2)
Glisin taşıyıcı 2 oligonükleotid probuACDBio409741-C3bp 925 - 2153'ü hedefler (Gen bankası ref: NM_148931.3)
Phox2b oligonükleotid probuACDBio407861-C2bp 1617 - 2790'ı hedefler (Genebank ref: NM_008888.3)
, ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  2. Annese, T., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence In Situ HybridizationImmunohistochemistryRNAscope FISHFresh Frozen TissueFixed Brain SectionsMultiplex LabelingProtein Subcellular LocalizationProtease TreatmentEpifluorescence MicroscopyBrainstem Nuclei

Related Articles