Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Julia Ratke; Franziska Krämer; Frederic Strobl

doi:10.3791/61713

Method Article

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

DOI:

10.3791/61713

⸱

September 9th, 2020

Julia Ratke*¹ , Franziska Krämer*¹ , Frederic Strobl¹

¹Physical Biology/Physikalische Biologie (IZN, FB15), Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes (CEF - MC), Goethe-Universität

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi gelişim biyolojisinde en değerli araçtır. Karşılaştırmalı çalışmalarda önemli bir konu ortam değişkenliğidir. Protokolümüz, birden fazla örneğin eşzamanlı canlı görüntülenmesi için deneysel bir çerçeveyi açıklar ve bu nedenle bu sorunu pro-aktif olarak ele alıp gidermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Işık tabakası bazlı floresan mikroskopisi, karmaşık süreçleri biyolojik olarak ilgili birden fazla ölçekte incelemek için verimli çözümler sunar. Numunenin üç boyutlu bütünlüğünü korumak için özel olarak tasarlanmış ve genellikle numune rotasyonu özelliğine sahip numune odası bazlı kurulumlar, gelişimsel biyolojide en iyi seçimdir. Örneğin, meyve sineği Drosophila melanogaster ve kırmızı un böceği Tribolium castaneum'untüm embriyonik morfogenezini belgelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, mevcut birçok canlı görüntüleme protokolü tek embriyolar için sadece deneysel çerçeveler sağlar. Özellikle karşılaştırmalı çalışmalar için, bu tür yaklaşımlar sakıncalıdır, çünkü ardışık olarak görüntülenmiş örnekler ortam varyansı tarafından etkilenir. Ayrıca, bu, belirli bir süre içinde test edilebilen numune sayısını sınırlar. Numune odası tabanlı kurulumlarda verimi artıran ve böylece tüm numuneler için benzer ortam koşulları sağlayan eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve sunuyoruz. İlk olarak, ışık tabakası floresan mikroskopları için bir kalibrasyon kılavuzu sunuyoruz. İkincisi, birden fazla embriyo için örnek rotasyonu ile uyumlu bir montaj yöntemi öneriyoruz. Üçüncü olarak, drosophilaörnek üç boyutlu canlı görüntüleme veri kümeleri sağlar Floresan etiketli çekirdekleri ile üç transgenik çizgi yan yana, yanı sıra Tribolium, hangi aynı transgene taşıyan üç transgenik alt çizginin performansını karşılaştırırız, ancak farklı genomik konumlarda. Protokolümüz, sıralı canlı görüntülemede her zaman mevcut olan ortam farkını pro-aktif olarak ele aldığı için karşılaştırmalı çalışmalar için özel olarak tasarlanmıştır. Bu, özellikle, örneğin nakavt deneylerinden kaynaklanan anormal fenotiplerin nicel analizleri ve karakterizasyonu için önemlidir. Ayrıca, ışık tabakası floresan mikroskoplarına erişim sınırlı olduğunda son derece uygun olan genel verimi arttırır. Son olarak, önerilen montaj yöntemi, temel olarak optimizasyon çabası olmadan diğer böcek türleri ve zebra balığı gibi diğer model organizmalar için uyarlanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Floresan mikroskopi, yaşam bilimlerinde, özellikle hücre ve gelişim biyolojisinde en temel görüntüleme tekniklerinden biridir. ^1990'larınortalarından beri üç boyutlu floresan görüntüleme için son teknoloji ürünü olan konfokal floresan mikroskoplar 1'de, florofor ekscitasyonu ve emisyon ışığı algılama için aynı lens kullanılır. Aydınlatma lazer ışını, aydınlatma/algılama ekseni boyunca tüm floroforları heyecanlandırır ve ilgili odak dışı sinyal bir iğne deliği tarafından algılanmadan önce ayırt edilir. Bu nedenle, her iki boyutlu görüntü için, tüm örnek aydınlatılır. Sonuç olarak, her üç boyutlu görüntü için, yani, mekansal olarak ardışık iki bo....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hazırlık çalışmaları

LSFM için bilimsel soruya uygun bir aydınlatma lensi/algılama lensi/kamera kombinasyonu seçin ve mikroskobu ayarlayın. Görüş alanının boyutu, kamera yongası boyutunun bölümü ve algılama lensinin büyüttürüdür. Aydınlatma lensi seçilmelidir, böylece tüm görüş alanı kabaca düzlemsal bir ışık levhası ile kaplanır³⁴. Önerilen üç kombinasyon Tablo 1'de listelenmiştir.
Agarose aliquots ve alma yemekleri hazırlamak için, 200 mL otomatik kapalı musluk suyuna 2 g düşük eriyik agarose ekleyin ve karışımı tüm agarose parçacıkları çözünene kadar mikrodalga fırında 600-800 W'da ısıtın. 1,5 mL veya ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokolümüz, örnek oda bazlı LSFM'lerde karşılaştırmalı floresan canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeveyi tanımlamaktadır. Örneğin, çerçeve (i) iki veya daha fazla türün embriyolarını, (ii) bir veya daha fazla genin nakavt edildiği çizgilerin embriyolarını ve vahşi tip kontrolleri, (iii) aynı transgenik çizgideki birden fazla embriyoyu, (iv) farklı transgenik çizgilerden embriyoları veya (v) aynı transjeni taşıyan alt hatlardan embriyoları yan yana getirmek için kullanılabilir. ama farklı genomik yerlerde. Bu bölüm.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LSFM'lerin münhasır uygulama alanlarından biri gelişimsel biyolojidir. Bu disiplinde, canlı örneklere bakmak önemlidir, aksi takdirde morfogenetik süreçler dinamik bir şekilde tarif edilemez. Örnek oda bazlı LSFM'lerde eşzamanlı canlı görüntüleme için deneysel bir çerçeve, burada açıklandığı gibi, iki ana nedenden dolayı uygundur.

Sıralı canlı görüntülemede kaçınılmaz olan ortam varyansı pro-aktif olarak ele alınabiliyor. Böcek embriyosu ile ilişkili canlı görüntülemede, örneğin aşağıdaki duya.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ernst H. K. Stelzer'e, kaynaklarını kullanma fırsatının yanı sıra el yazması ile ilgili değerli yorumları için, Tribolium canlı görüntüleme desteği için Anita Anderl'e, teknik destek için Sven Plath'a ve Bloomington Stock Center aracılığıyla transgenik Drosophila hatlarını paylaştıkları için Ilan Davis, Nicole Grieder ve Gerold Schubiger'e teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
6 oyuklu plaka	Orange Scientific	4430500
24 kuyulu plaka	Orange Scientific	4430300	Yalnızca Tribolium
>35-mm & Oslash içeren canlı görüntüleme için; Petri kabı	Fisher Scientific	153066	Yalnızca Drosophila içeren canlı görüntüleme için.
90 mm ve eğik çizgi; Petri kabı	Fisher Scientific	L9004575
100 & m ağ boyutu hücre süzgeci	BD Biosciences	352360
250 & m ağ boyutu elek	VWR International	200.025.222-038	Yalnızca Tribolium < / em >
300 ve mikro içeren canlı görüntüleme için; m ağ boyutu elek	VWR International	200.025.222-040	Yalnızca Tribolium < / em >
710 ve mikro içeren canlı görüntüleme için; m ağ boyutu elek	VWR International	200.025.222-050	Yalnızca Tribolium
800 ve mikro içeren canlı görüntüleme için; m ağ boyutu elek	VWR International	200.025.222-051	Yalnızca Tribolium
>405 ince buğday unu	Demeter e.V.	SP061006	Yalnızca Tribolium
ticari olarak temin edilebilen Drosophila ortamını	Genesee Scientific	66-115	Yalnızca Drosophila / Ismarlama Drosophila ortam ayrıca
floresan mikro küreler, 1.0 ve mikro da kullanılabilir; m & Oslash;	Thermo Fisher Scientific	T7282
inaktif kuru maya	Genesee Scientific	62-108
düşük eriyik agaroz	Carl Roth	6351.2
dar şişeler	Genesee Scientific	32-109	Yalnızca Drosophila
küçük boya fırçası	VWR International	149-2121
içeren canlı görüntüleme içinsodyum hipoklorit (NaOCl), ~%12 aktif Cl	Carl Roth	9062.3	Dikkat: sodyum hipoklorit aşındırıcı
tam buğday unudur	Demeter e.V.	SP061036	Yalnızca Tribolium / Birleşik Krallık içeren canlı görüntüleme için: kepekli un
genişliğinde şişeler	Genesee Scientific	32-110	Yalnızca Drosophila

içeren canlı görüntüleme için içeren canlı görüntüleme için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

St Croix, C. M., Shand, S. H., Watkins, S. C. Confocal microscopy: comparisons, applications, and problems. Biotechniques. 39 (6), Suppl 2-5 (2005).
Jonkman, J., Brown, C. M. Any way you slice it-A comparison of confocal microscopy techniques. Journal of....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles