Bal Arılarının Oral Enfeksiyonu için Virüs Bakımından Zenginleştirilmiş İnokulum Hazırlanması (Apis mellifera)

Özet

Burada iki protokolü tanımlıyoruz: birincisi, bal arısı pupalarını çıkarmak için bir yöntem de dahil olmak üzere, büyük miktarlarda bal arısı zarfsız virüs parçacıklarını yaymak, çıkarmak, saflaştırmak ve ölçmek ve ikincisi, yüksek oranda tekrarlanabilir, yüksek verimli bir kafes biyotahlili kullanarak viral enfeksiyonun etkilerini test etmek.

Özet

Bal arıları dünya çapında büyük ekolojik ve tarımsal öneme sahiptir, ancak viral patojenlere maruz kalma da dahil olmak üzere arı sağlığını olumsuz yönde etkileyen çeşitli baskılara maruz kalmaktadır. Bu tür virüsler çok çeşitli yıkıcı etkilere neden olabilir ve deneysel tedavilerin etkilerini önceden var olan arka plan enfeksiyonundan ayırmayı zorlaştıran çoklu faktörler nedeniyle incelenmesi zor olabilir. Burada, viral enfeksiyonu ve etkileri test etmek için yüksek verimli bir biyotahlil ile birlikte büyük miktarlarda virüs parçacıklarını seri olarak üretmek için bir yöntem sunuyoruz. Sürekli, virüssüz bir bal arısı hücre hattının mevcut eksikliğinin gerektirdiği viral parçacıklar, minimum stresli metodoloji kullanılarak kovandan büyük miktarlarda ekstrakte edilen bal arısı pupaları kullanılarak in vivo olarak çoğaltılır. Bu virüs parçacıkları daha sonra inoküla canlılığını test etmek için bal arısı kafesi biyotahlillerinde ve ayrıca beslenme, böcek ilaçları ve diğer patojenlerle etkileşimler de dahil olmak üzere çeşitli diğer virüs enfeksiyon dinamiklerinde kullanılabilir. Bu tür parçacıkları kullanmanın en büyük avantajı, enfekte arı hemolenfi veya homojenat yoluyla enfeksiyon gibi mevcut alternatiflerle karşılaştırıldığında, sonraki deneylerde bilinmeyen değişkenlerin ortaya çıkma şansını büyük ölçüde azaltmasıdır, ancak arıları tedarik ederken hala dikkatli olunmalıdır. Kafes tahlilleri, koloni düzeyinde virüs enfeksiyonu etkilerini test eden büyük ölçekli, saha gerçekçi deneylerin yerine geçmez, bunun yerine, yarı saf virüs parçacıkları ile kombinasyon halinde, bal arısı-virüsü fizyolojik etkileşimlerinin çeşitli boyutlarını incelemek için önemli araçlar olarak hizmet edebilecek temel viral yanıtları oluşturmak için bir yöntem olarak işlev görür.

Giriş

Bal arıları (Apis mellifera) modern küresel tarım alanında kritik bir rol oynamaktadır, ancak şu anda pestisit maruziyeti, zayıf yem, parazitler ve patojenler dahil olmak üzere biyotik ve abiyotik stresörlerin bir kombinasyonundan muzdariptir ^1,2. Endişe verici en önemli patojenlerden biri, birçoğu büyük bal arısı stresörlerinden biri olan parazitik Varroa akarı (Varroa yıkıcı) tarafından vektörleştirilen virüslerdir. Bu virüsler, bal arılarında azalmış yavru sağkalımı, gelişimsel kusurlar ve felç dahil olmak üzere bir dizi olumsuz etkiye neden olabilir ve bu da kışlama dönemlerinden önce ve ....

Protokol

1. Kütle arı ekstraksiyon seçeneği 1: larva kendi kendine çıkarma

1. Bir bal arısı kraliçesini boş, çizilmiş Langstroth çerçevesine kafesleyin ve onu kolonisine geri döndürün. Kraliçenin bu çerçeveye 24 saat boyunca yumurta bırakmasına izin verin.
   1. Tarak hücrelerinin çoğunun yeni yumurtlayan yumurtalar içerdiğinden emin olmak için çerçeveyi 24 saat sonra kontrol edin. Kraliçeye ve koloniye bağlı olarak, yumurtalar bazen ilk 24 saatte çok iyi döşenmez. Bu durumda, 24 saat daha bekleyin ve süreyi gerektiği gibi ayarlayın.
2. 24 saatlik yumurtlama döneminden sonra kraliçeyi serbest bırakın. Çerçeveyi açıkça işaretleyin ve koloniye geri gö....

Sonuçlar

Pupa enjeksiyonu ve viral ekstraksiyon için protokolleri (Şekil 1) başarıyla takip etmek, büyük miktarlarda virüs parçacıkları üretmelidir. Bununla birlikte, çeşitli kolonilerden elde edilen pupaların birden fazla zaman noktasında örneklenmesi ve enjekte edilmesi, düşük kontaminasyonla hedef virüs edinme şansını en üst düzeye çıkarır. Virüslerin bir bal arısı içinde çoğaldıkları ve birbirleriyle etkileşime girdikleri dinamikler iyi anlaşılmamıştır; Önceden var olan enfeksiyon olasılığı ile birleştiğinde,.......

Tartışma

Burada, larva toplama ve virüs yayılımı, ekstraksiyonu ve konsantrasyonunun yanı sıra kafes besleme deneyleri şeklinde viral tedavi de dahil olmak üzere virüs amplifikasyonu ve inokülum stok hazırlama sürecinin her adımını detaylandıran yöntemleri özetledik. Bu yöntemler, etkinliği yetişkinler için ölümcül olan virüsler için doz-yanıt mortalite testi ile tutarlı bir şekilde ölçülebilen yarı saf virüs parçacıklarının üretilmesine izin verir (Şekil 5). Enfektif ye.......

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
% 10 çamaşır suyu çözeltisi
24:1 kloroform: izoamil alkol	SigmaAldrich	C0549
% 70 etanol çözeltisi
Biyotahlil			Deneysel kuruluma bağlıdır
Combitips Advanced 0,1 mL	Eppendorf	30089405	Opsiyonel (enjektör aparatı yoksa)
Larva kendi kendine çıkarma			Kabaca 19" x 9-1 / 8" ölçülerinde olmalıdır (Langstroth derin çerçeve boyutları)
Forseps			Larva ayrılması için künt, yumuşak forsepsl; pupa eksizyonu için künt, sert forseps
Davlumbaz
İnkübatörü			34 º'yi koruyabilir; C ve %50 bağıl nem
Kimwipes	Fisher Scientific	06-666	Herhangi bir emici mendil işe yarayacaktır
Orta boy ağırlık tekneleri			Aşı tepsisi görevi görür
Biomax membranlı Microcon-100kDa	MilliporeSigma	MPE100025
NaCl
Nitril eldivenler
Fosfat tamponlu tuzlu su (PBS)	SigmaAldrich	P5119
Polietilen glikol 8000 (PEG)	SigmaAldrich	1546605
Soğutmalı tezgah üstü santrifüj			15.000 x g
Soğutmalı santrifüj			21.000 x g kapasiteli
Tekrarlayıcı M4 Multipipet	Eppendorf	4982000322	Opsiyonel (enjektör uygulaması yoksa mevcut)
RNAse Away	ThermoFisher	7000TS1
RNAse-less water	SigmaAldrich	W4502
Sucrose
TES	SigmaAldrich	T1375

için kafesler için kaplar kapasiteli