Method Article

Hücresel Canlılığı Koruyan Sihirli Açı Dönen Nükleer Manyetik Rezonans Spektrometresine Kriyojenik Örnek Yükleme

DOI:

10.3791/61733

⸱

September 1st, 2020

 ,  ,  , 
1Department of Biophysics, University of Texas Southwestern Medical Center, 2Center for Alzheimer's and Neurodegenerative Disease and Center for Systems Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, donmuş örneklerin dinamik nükleer polarizasyon (DNP) sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) probuna kriyojenik transferi için bir protokol sunulmaktadır. Protokol, deneyden önce rotor depolaması için yol tariflerini ve deneyden önce ve sonra uygulanabilirlik ölçümleri için yol tariflerini içerir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dinamik nükleer polarizasyon (DNP), sihirli açı eğirme (MAS) nükleer manyetik rezonans (NMR) spektroskopisinin hassasiyetini önemli ölçüde artırabilir. Sıcaklıklar azaldıkça bu hassasiyet artar ve çoğu ticari DNP donanımlı NMR spektrometresinin çalışma sıcaklıklarında (~100 K) çok düşük konsantrasyonlarda moleküllerin çalışmasını sağlayacak kadar büyüktür. Bu, kriptoopreze edilmiş hücreler üzerinde hücre içi yapısal biyolojinin, makromoleküller için kendi yerel ortamlarında endojen seviyelerinde olma olasılığına yol açar. Bununla birlikte, DNP MAS NMR için tipik numune kullanımı sırasında hücresel kriyoprezervasyon için gereken donma oranları aşılır ve bu da hücresel bütünlük ve canlılık kaybına neden olur. Bu makalede, donmuş bir memeli hücresi örneğinin MAS NMR spektrometresine hazırlanması ve kriyojenik transferi için ayrıntılı bir protokol açıklanmaktadır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sihirli açı dönen nükleer manyetik rezonans spektroskopisi için dinamik nükleer polarizasyonun tanıtılması MAS NMR'nin hassasiyetini çeşitli büyüklük sıralarıyla artırabilir. Bu, biyomoleküllerin fizyolojik konsantrasyonlarında veya yakınında tespitini sağlamıştır. DNP, karmaşık biyolojik ortamda endojen (~1 μM) konsantrasyonlarda izotopik olarak etiketlenmiş bir proteini tespit etmek için gereken hassasiyeti sağlayabilir ve sağlar1. İzotopik olarak etiketlenmiş molekülleri canlılıklarını etkilemeden etiketlenmemiş memeli hücrelerine tanıtmak için iyi kurulmuş protokoller olduğundan, bu, izotopik olarak zenginleştirilmiş biyomolekülleri kendi doğal ortamlarında endojen seviyelerinde inceleme imkanını açar. Ayrıca, DNP geliştirmeleri daha düşük sıcaklıklarda daha verimli olduğundan2,3,4, DNP MAS NMR için deneysel sıcaklıklar, canlı memeli hücrelerinin uzun süreli depolanması için gerekli olanlarla düzgün bir şekilde hizalanır5. Bununla birlikte, bir numuneyi DNP MAS NMR spektrometresine aktarmanın geleneksel yöntemi, onu memeli hücrelerini yırtan sıcaklık dalgalanma oranlarına maruz bırakmaz.

MAS NMR deneyleri, örneğin sıfıra ortalaması için anisotropik etkileşimin büyüklüğüne eşit veya daha büyük frekanslarda sihirli açı hakkında döndürülmesi gerekir, genellikle en az 4 kHz ve genellikle çok daha yüksek6,7,8,9. Bu nedenle, numuneler, rotorun dönüşünü bir gaz akışıyla yönlendirmek için kullanılan ve diğer ucunda bir işarete sahip olan kanatlı bir ucu olan rotorlara paketlenmiştir, böylece dönüş frekansı bir takometre ile izlenebilir. Çoğu MAS NMR cihazı için numune transferi, rotorun cihazın dış kısmından NMR probunun sonundaki statora kuru hava veya azot gazı akışı ile enjekte ederek gerçekleştirilir. Rotor, rotoru sihirli açıda tutan statora ulaştıktan sonra, numune dönüşü bir hava türbini mekanizması tarafından tahrik edilir. Ayrı gaz akışları rotorun sıcaklığını destekler, iter ve kontrol eder. NMR spektrometresine bir rotor takmak ve kararlı MAS eğirme elde etmek, ince işlenmiş tahrik uçları ve ayrı gaz akışlarının sıcaklığının ve basıncının sıkı kontrolünü gerektirir. Bu teknik taleplere rağmen, oda sıcaklığı uygulamaları için ticari MAS NMR probları için kararlı MAS ekleme ve elde etme büyük ölçüde otomatikleştirilmiştir.

Ancak, düşük sıcaklık uygulamaları için durum daha karmaşıktır. Düşük sıcaklık uygulamaları için numuneler tipik olarak oda sıcaklığında spektrometreye yerleştirilir ve statorda dondurulur. İlk dakikada, numune sıcaklığı hızla azalır (> −100 °C/dk) ve sistem sıcaklığının dengeye girmesi birkaç dakika sürer. Sıcaklık ve basıncın etkileşimi nedeniyle, istenen MAS'ın yerleştirilmesi ve yaklaşması genellikle düşük sıcaklık uygulamaları için manuel olarak ele alınır. Manuel müdahale gereksinimine rağmen, rotorun cihazın içinde dondurulması faydalıdır, çünkü başarılı eğirme için kritik olan prob içine su ve yoğuşma girişini en aza indirir. Sadece ortam nem bloğu gaz hatlarından yoğuşma ve buz birikmesi, rotorun kendisi üzerindeki yoğuşma veya don MAS'ı mekanik olarak önleyebilir. Bu nedenle, düşük sıcaklık MAS NMR örnekleri genellikle cihazın içinde -100 °C/dk'yi aşan oranlarda dondurulur.

Memeli hücreleri, soğutma 5 , 10 ,11,12,1°C / dak'tan eşit veya daha yavaş bir hızda yavaşsa, donma-çözülme döngüsü ile bütünlüklerini koruyabilirler. Alternatif olarak, soğutma hızı ultra hızlıysa hücreler de bütünlüğünü korur13,14,15 ,104 °C/dak'tan daha hızlı bir hızda. Bu iki uç noktaya orta oranlar, kriyoprotektif ajanların varlığında bile, hücrelerin içinde ve dışında buz kristali oluşumu nedeniyle memeli hücrelerini yırtıyor ve öldürüyor16. Önceden soğutulmuş bir probun içindeki bir oda sıcaklığı rotorunun numune soğutma oranları bu iki uç nokta arasına düşer, böylece kriyogenik olarak korunmuş bozulmamış canlı memeli hücrelerini incelemek için, numuneler cihaza aktarılmadan önce dondurulmalı ve rotordaki don örneğine veya birikmesine zarar verebilecek sıcaklık dalgalanmaları olmadan cihaza aktarılmalıdır. Protokol, kriyojenik bir MAS NMR sistemine donmayan, önceden soğutulmuş rotor yerleştirme için kriyogenik olarak korunmuş bozulmamış canlı memeli hücre örneklerinin incelenmesi için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan kriyojenik örnek transferi, canlı sağlam hücrelerin NMR karakterizasyonu için geliştirilmiştir. Bununla birlikte, sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sistem için geçerlidir. Bu, sıkışmış reaksiyon ara maddelerinin kimyasal ve yapısal karakterizasyonu için dondurulan söndürülen reaksiyonlar17 , 18,enzymoloji19,20 veya protein katlama21,22gibi çeşitli karmaşık sistemleri içerir.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Memeli hücrelerinin kültürü ve kriyoproteksiyon

  1. Kültür ve hasat memeli hücreleri
    1. Donmuş insan embriyonik böbrek hücrelerinin bir aliquot'unun çözülmesi (HEK 293).
    2. Büyüme ortamlarında Kültür HEK 293 hücreleri (örneğin, %10 fetal sığır serumu ve %1 Pen-Strep ile DMEM) 37 °C'de iki ila üç pasaj(7-10 gün) boyunca 100 mm plakalarda %5 CO 2 ile.
    3. Hücreler% 90-95 izdiah elde edene kadar hücreleri ve kültürü 150 mm'lik bir plakada bölün.
      NOT: 3,2 mm çapında iki safir rotorun doldurulması için %90 > 150 mm'lik bir plaka yeterli olacaktır.
    4. 4 mL tripsin (bkz. Malzeme Tablosu)ve 10 mL ortam kullanarak hücreleri hasat edin. Süspansiyonu oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 673 x g (1000 rpm) sıcaklıkta steril 15 mL konik ve santrifüje aktarın. Üsttekini çıkarın.
    5. Hücre peletini fosfat tamponlu salin (PBS) ile yıkayın (pH 7.4, −CaCl2, −MgCl2).
  2. Hücrelerin kriyoproteksiyon
    1. Bir mikrosantrifüj tüpünde 50 μL hücre pelet toplayın. Ayrı bir tüpte 50 μL PBS ve 18 μL gliserol karışımı hazırlayın.
    2. Gliserol-PBS karışımını peletin üstüne ekleyerek ve küme kalmayana kadar tüpün kenarına hafifçe dokunarak peleti yeniden oluşturarak 50 μL hücre peletini 68 μL gliserol-PBS karışımı ile hafifçe karıştırın.
      NOT: Hücreyi yeniden canlandırmak için nazik pipetleme de kullanılabilir, ancak hücresel bütünlüğün tehlikeye atılmamasını sağlamak için.

2. NMR rotorunda memeli hücrelerinin kriyoprezervasyonu

  1. Hücrelerin 3,2 mm safir rotora aktarılması.
    1. Huni yapmak için 200 μL pipet ucu kesin ve kesilmiş pipet ucunun dar ucunu 3,2 mm rotoraya yerleştirin.
    2. Hücreleri rotorda oturan huniye aktarın. Rotorun huni ile birlikte bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında 2-3 dakika boyunca 673 x g'da santrifüjleme ile rotorun dibine peletin.
    3. Süpernatant ve fazla numuneyi rotordan çıkarın. Rotor hücrelerle tamamen dolu olana kadar bu iki adımı tekrarlayın.
      NOT: İsteğe bağlı olarak, donmadan önce numunenin hücresel canlılığını belirleyin. 100 μL FBS içermeyen DMEM'de fazla hücre peletinin 10 μL'sini yeniden boşaltın. Süspansiyonun 10 μL'sini % 0,4 trypan mavi çözelti ile karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlılığı hemen değerlendirin. Serum trippan mavisi boyamaya müdahale ettiği için hücreleri seyreltmek için sadece FBS ücretsiz medya kullanın.
    4. Rotoru piyasada bulunan paketleme aletini kullanarak silikon bir fişle kapatın.
    5. Rotorunu dikey olarak aşağı doğru bastırarak seramik tahrik ucuyla kapatın. Tahrik ucunun yan tarafındaki hassas yüzgeçlere dokunmaktan kaçının.
    6. Rotorun alt kenarının yarısını gümüş kalıcı bir işaretleyici ile, diğer yarısını da rotorun alt kenarının diğer yarısını siyah kalıcı bir işaretleyici ile işaretleyin, böylece rotorun spektrometrenin içindeki dönmesinin doğru bir şekilde izlenmesini sağlar.
      NOT: Rotorun işaretlenmesindeki kusurlar, eğirme frekansının doğru sayımını önleyecek ve kararlı eğirme elde edilmemesine neden olacaktır. İşaretleyiciler donmuş bir rotoraya yazmayacağından ve rotor ısınması numune bütünlüğünü tehlikeye attığından, rotoru donmadan önce işaretlemek kritik bir adımdır.
  2. 3,2 mm safir rotor içindeki hücrelerin kriyoprezervasyonu.
    1. Kapağın altına ve kriyojenik şişenin altına bir parça mendil veya kağıt havlu ile yapılmış bir yastık yerleştirin (bkz. Malzeme Tablosu).
      NOT: Kağıt mendil, rotor işaretini kriyojenik şişelerin yanlarına çarparak oluşan hasarlardan korur.
    2. 3,2 mm safir rotorunu, kriyojenik şişenin altına bakan ucu işaretli kağıt mendille yastıklanmış kriyojenik şişeye yerleştirin.
    3. Kriyojenik şişeyi kontrollü hız (-1 °C/dk) soğutma kabına yerleştirerek rotoru yavaşça dondurun ve kabı en az 3 saat boyunca -80 °C dondurucuya yerleştirin.
    4. Donmuş rotoru içeren kriyojenik şişeyi sıvı azot depolamaya aktarın.

3. Donmuş bir numunenin NMR spektrometresine kriyojenik transferi

  1. Donmuş numuneyi NMR tesisine taşıyın.
    1. Donmuş rotoru içeren kriyojenik şişeyi NMR tesisine taşınmak üzere sıvı nitrojenle dolu küçük bir dewar'a aktarın.
  2. Donmuş rotorun sıvı nitrojen banyosuna aktarılması.
    1. Kuru, termal yalıtımlı geniş ağız köpük dewar'ı 500 mL – 1 L sıvı azotla doldurun.
    2. Rotoru kriyojenik şişeden sıvı nitrojenle dolu geniş ağız köpük dewar'a aktarın.
      1. Kriyojenik şişeyi eldeki transfer dewar'ından alın ve atmosferden korumak için sıvı nitrojenin yüzeyinin hemen üzerinde tutun.
      2. Kriyojenik şişeyi ağzı hafifçe aşağı bakacak şekilde tutarken, kapağı sökün ve rotorun sıvı azot banyosuna kaymasına izin verin.
        NOT: Kapak söküldükten sonra, kondenslerin rotorda toplanmasını önlemek için rotor kriyojenik şişeden sıvı azot banyosuna hızlı bir şekilde (1 saniyenin altında) düşmelidir. Sıvı nitrojenin buharlaşması, geniş ağız köpüğünde bir "azot bulutu" oluşturur ve sıvı nitrojene batırılmadan önce rotorda yoğuşmayı önler. Rotorun havaya daha uzun süre maruz kalması, rotor duvarlarındaki nemin yoğunlaşmasına neden olabilir ve bu da yeniden yoğunlaşarak buza dönüşebilir.
  3. Rotorun NMR örnek yakalayıcıya kriyojenik transferi.
    1. Prechill, sıvı nitrojen banyosuna batırarak 1,5 mL mikrosantrifüj tüpü. Tüpü kapatmayın.
      NOT: Mikrosantrifüj tüpüne transfer etmeden önce rotorun incelensin. Cımbız kullanarak, rotoru sıvı nitrojenin yüzeyinin hemen altında tutun ve rotor işaretlerinin sağlam olup olmadığını, duvarlarında buz birikintisi oluşmadığını ve tahrik ucunun sağlam olup olmadığını kontrol edin. Rotor duvarlarındaki buz kristali birikintileri beyaz toz olarak görünür. Rotoru her zaman tahrik ucuyla değil, gövdesinden tutmaya dikkat edin. Rotordaki işareti cımbız uçlarıyla çizmeyin.
    2. Sıvı azot banyosunun yüzeyinin altında, rotoru mikrosantrifüj tüpünün altına bakan tahrik ucu ve tüpün açılmasına bakan işaretler ile mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için cımbız kullanın.
      NOT: Sıvı nitrojene batırmadan veya rotora dokunmadan önce her zaman cımbız kurulayın.
    3. Cımbız kullanarak, rotoru içeren tüpü boynundan sıvı nitrojen altında tutun.
    4. Elinizde ikinci bir çift cımbızla, NMR numune tutucusunu sıvı azot banyosuna batırmaya ve mikrosantrifüj tüpüne göre akut bir açıyla eğimli olacak şekilde tutmaya hazır olun.
      NOT: O-ringin donmasını önlemek için numune tutucunun sıvı nitrojenle temas ettiği süreyi en aza indirin. O-ring donarsa, yakalayıcıyı spektrometreye yerleştirmek çok zor olacaktır.
  4. NMR numune tutucudan NMR spektrometresine kriyojenik rotor transferi
    NOT: Bu adım, biri kriyosbiyeni çalıştırmak ve biri sıvı nitrojenden prob içine numuneyi aktarmak için iki kişi gerektirir.
    1. Kabin üzerinde 'EJECT' tuşuna basarak kriyobineti çıkarma moduna yerleştirin.
      NOT: Fırlatma modu, atmosferik nemin girişini önlemek için probdan atmosfere yüksek basınçta kuru ve soğuk azot gazı akışını temizler.
    2. Rotorun NMR örnek yakalayıcıya aktarılması.
      1. NMR numune tutucunun açık ucunun açık ucunun sıvı nitrojenin yüzeyinin altındayken mikrosantrifüj tüpüne yerleştirilmesi.
      2. Rotorun numune tutucuya düşmesini sağlamak için hem mikrosantrifüj tüpünü hem de NMR numune tutucuyu kaldırın. Rotorun numune tutucunun kenarına sıkışması durumunda NMR numune tutucuyu ve mikrosantrifüj tüpünü sallayın.
      3. Rotorun havadan korunması için boş mikrosantrifüj tüpünü NMR numune tutucusunun üzerine bırakın.
    3. Diğer boş NMR numune tutucuyu probundan çıkarın ve yere yatırın.
    4. Rotor içeren NMR numune tutucuyu serbest elinize aktarın, mikrosantrifüj tüpünü çıkarın ve hemen prob içine yerleştirin.
      NOT: O-ring donarsa, numune tutucuyu sıkmak zor olacaktır. Yerine kayana kadar kuvvet uygulamaya devam edin.
    5. Kriyobinet'i işleten kişiye 'EJECT'i DURDUR' ve 'INSERT' için sinyal ver.
      NOT: Ekleme modu rotorun numune yakalayıcıdan probun içine yönlendirir.
    6. Kriyobinet tarafından kontrol edilen rulman ve sürüş akış basıncını ayarlayarak numuneyi istediğiniz eğirme hızına (örneğin, 12 kHz) döndürün. (örneğin, rulman gazını derhal ~200 mBar'a ve tahrik gazını 10 mBar'a çıkarın. Numune döndükten sonra rulman gazını 1000 mBar'a çıkarın ve gazı 200 mBar'a sürün. İplik stabilize oldukça, rulmanı 2400 mBar'a çıkarın ve ardından tahrik gazını birkaç dakika içinde 200 mBar'dan 1700 mBar'a çıkarın. VT soğutma gazı ~1070 L/h'de sabittir.)
      NOT: Mikrosantrifüj tüpünü ve NMR numune tutucuyu sıvı nitrojen banyosundan çıkarırken, mikrosantrifüj tüpünün rotoru çevrelemesi için yeterli sıvı nitrojen olduğundan emin olun. Rotorun NMR numune yakalayıcıya aktarılması ile NMR numune tutucusuna spektrometreye yerleştirilmesi arasındaki süreyi en aza indirin. 3.4'teki tüm adımlar 30 s içinde tamamlanmalıdır.

4. Numunenin NMR spektrometresinden kriyojenik olarak çıkarılması

  1. Sıvı azot banyosu ve kriyojenik şişenin hazırlanması
    1. Geniş ağız köpüğü dewar içine 500 mL - 1 L sıvı azot dökün ve banyoyu spektrometrenin altına yerleştirin.
    2. Kriyojenik şişeyi önceden soğutun. Sıvı nitrojen banyosuna bir parça kağıt içeren boş kriyojenik şişeyi batırın.
  2. Rotorun probdan kriyojenik şişeye kriyojenik transferi
    1. Sürüş ve rulman gazı akışını azaltarak eğirme hızını 0 kHz'e düşürün ve fırlatma moduna geçerek rotordan dışarı çiyin.
    2. Fırlatma modunu açık tutun, numune tutucuyu probdan çıkarın, rotoru doğrudan sıvı nitrojen içeren geniş ağız köpük dewar'a bırakın.
    3. Önceden soğutulmuş cımbız kullanarak rotoru sıvı nitrojen yüzeyinin altındaki önceden soğutulmuş kriyojenik şişeye aktarın.
    4. Kriyojenik şişeyi kapla. Kriyojenik şişe kapağını sıvı nitrojene batırarak ön kontrol edin. Rotor ve sıvı nitrojen içeren kriyojenik şişeyi banyodan çıkarın ve tüpü önli benlikli kapakla kaplayın. Buharlaştırıcı nitrojenin güvenli bir şekilde salınabilmesi için kapağı sıkmayın.
    5. Kriyojenik şişeyi sıvı nitrojene yeniden batırın. Numune daha uzun süreli sıvı azot depolamaya aktarılabilir veya daha fazla analiz için hemen açılabilir.

5. Rotor ve canlılık ölçümlerinin açılması

  1. Rotorların açılması ve canlılığın ölçülmesi
    1. Önceden ısınan serumsuz ortam (DMEM) veya PBS ila 37 °C.
    2. Rotoru sıvı nitrojenden çıkarın. Sürücü ucunu ve silikon fişi çıkarın.
      NOT: Safir mükemmel bir ısı iletkenidir. Rotora parmaklarınızla dokunmaktan kaçının, çünkü ısı transferi hücresel canlılığı tehlikeye atan yerel donma-çözülme olaylarına neden olabilir.
  2. Canlılığı ölçme
    1. Rotordaki donmuş hücre peletine 20 μL sıcak ortam ekleyin ve hücreleri yeniden depolayın. Süspansiyonu pipetle çıkarın ve süspansiyonu 100 μL ortamla karıştırın.
    2. 10 μL hücre süspansiyonu çıkarın ve % 0,4 trippan mavi çözeltisi (v / v) eşit hacimde karıştırın. Oda sıcaklığında 30 s ila 1 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Otomatik hücre sayacı kullanarak canlılığı ölçün.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli hücrelerinin önceden dondurulmuş örneklerinin NMR spektrometresine kriyojenik olarak yerleştirilmesi, NMR deneyi boyunca canlılığı destekler. Donmuş bir numunenin önceden soğutulmuş bir NMR probuna kriyojenik transferinin şemaları Şekil 1'degösterilmiştir. Hücresel canlılık ve sağlamlık çeşitli yöntemler kullanılarak değerlendirilebilir. Burada, diğer yöntemlerle iyi hizalanan standart bir boya bazlı membran bütünlüğü ölçüsü kullandık23. Sağlam hücreler maviyi denemek için geçirimsizken, membran bütünlüğü bozulabilir. Trippan mavi geçirgen ve geçirimsiz hücrelerin sayısı otomatik bir hücre sayacı kullanılarak hızla değerlendirilebilir. Burada açıklanan protokolü kullanarak, MAS NMR'den sonra memeli hücrelerinin trypan mavi geçirgenliği (yani 5.2.3 noktasında), herhangi bir sıcaklık değişiminden önce memeli hücrelerinin trypan mavi geçirgenliğine benzer (yani, nokta 2.1.3). Bununla birlikte, hücreler yavaş donmuşsa, yerleştirmeden önce oda sıcaklığına ısıtılırsa (yani soğutulmuş prob içine sokmadan önce rotorun oda sıcaklığına ısınmadan önce 3 noktasına kadar protokolü takip ederek), trypan mavisi tarafından değerlendirilen hücresel canlılık hücrelerin% 10'undan daha azına düşer(Şekil 2). Böylece, spektrometre içindeki hücrelerin dondurulması hücresel zar bütünlüğünün kaybına neden olurken, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin kriyojenik olarak yerleştirilmesi NMR deneyi boyunca hücre canlılığını destekler.

figure-results-1
Şekil 1: Donmuş bir numunenin önceden soğutulmuş bir NMR probuna kriyojenik transferinin şeması. (A) Sıvı nitrojenin yüzeyine yaklaşın ve kriyojenik şişenin üst kısmını sökün. (B) Rotoru sıvı azot banyosuna kaydırın. (C) Bir mikrosantrifüj tüpünü cımbız kullanarak batırın ve tamamen soğuyana kadar yerinde tutun. (D) Rotorunu, tahrik ucu tüpün altına bakacak şekilde mikrosantrifüje yerleştirin. Cımbızla tutmak yerine itin. (E) Mikrosantrifüj tüpünü sıvı azot banyosunun yüzeyinin hemen altında tutun ve donmayan ve iyi işaretlenmiş olduğundan emin olmak için rotoru görsel olarak inceleyin. (F) Numune tutucuyu yüzeyin üzerinde bir açıyla tutun. (G) Numune tutucuyu ve tüpü mikrosantrifüj tüpünün içine girer girmez sıvı nitrojenden çıkarın. (H) Rotor janta takılırsa numune tutucuyu sallayın. (I) Boş numune tutucuyu probundan çıkarın ve yere yatırın. (J) Mikrosantrifüj tüpünü rotor içindeyken numune tutucudan çıkarın, yerleştirin, probdaki numune tutucuyu sıkın ve kontrol konsolunda "INSERT" tuşuna basın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Önceden dondurulmuş bir memeli hücresi örneğinin kriyojenik olarak yerleştirilmesi, hiç dondurulmamış memeli hücre örneklerine benzer hücresel bozulma ölçümleriyle sonuçlanır. Hiç dondurulmayan örnekler için trypan mavi geçirimsiz hücrelerin yüzdesi (örneğin adım 2.1.3), MAS NMR'den sonraki örnekler için hücrelerinkine benzer (örneğin, 12 kHz MAS ile 5.2.3 adımı). 100 K'ya önceden soğutulan NMR cihazına takılmadan önce oda sıcaklığına ısıtılan yavaş donmuş hücreler (örneğin adım 3), 12 kHz MAS ile MAS NMR'den sonra bozulmamış hücrelerin çok daha düşük yüzdelerine sahipti. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Donmuş numunelerin bir NMR spektrometresine kriyojenik transferi, NMR veri toplama yoluyla donmuş memeli hücrelerinin canlılığını korumada başarılıdır. Bu metodolojinin başarısı MAS NMR öncesi ve sonrası canlılık ölçümlerinde gösterilmiştir. Bu yaklaşım, sıcaklık dalgalanmalarının numune bütünlüğünü tehlikeye atabileceği herhangi bir sistem için başarılı ve genelleştirilebilir. Şu anda sunulan protokol HEK 293 hücre hattı ile gerçekleştirilir. Birçok memeli hücre hattı için kriyoprezervasyon koşulları çok benzer olduğundan, burada bildirilen koşulların diğer hücresel sistemlere çevrilebilir olması muhtemeldir; ancak, aynı sonuçları elde etmek için kriyoprotektanların, numune hacimlerinin ve donma oranlarının daha fazla optimizasyonu gerekebilir.

Bu metodoloji, rotorun NMR sonrası daha hızlı bir şekilde açılmasıyla geliştirilebilir. Bu adım şu anda alt optimal ve yürütülmesi hücrelerin uygulanabilirliğini etkiler. Hücrelerin ortama yeniden kullanılabilmesi için önce tahrik ucu ve silikon fişin rotordan çıkarılması gerekir. Tahrik ucunun çıkarılması sırasında rotor tutulduğunda numune düzensiz bir şekilde çözülür ve silikon fiş çok daha kısa rotor kullanım süreleri daha yüksek canlılıklara neden olur. Rotor tutucuların veya diğer aletlerin geliştirilmesi, tahrik ucunun ve silikon fişin düzgün çözülmesini ve hızlı bir şekilde çıkarılmasını kolaylaştırmak için NMR sonrası canlılık değerlendirmesini daha doğru hale getirmeye yardımcı olacaktır.

Bu makalede açıklanan kriyojenik numune yükleme yaklaşımı, NMR mıknatısının deliğinde bulunan prob ile numune ekleme ve çıkarmayı destekleyen NMR probları ile sınırlıdır. Harici numune ekleme ve çıkarma ticari DNP sistemleri için standart olsa da, özel problar her zaman bu seçeneğe sahip değildir. Ayrıca, kriyojenik numune yüklemeye yönelik bu yaklaşım, farklı boyutlu rotorlarla uyumlu olacak şekilde oluşturulmuş NMR probları için bazı değişiklikler gerektirebilir. Bu protokol 3,2 mm rotorlar için optimize edilmiştir ve numune tutucunun dış çapı bir mikrosantrifüj tüpünün iç çapını aşarsa (örneğin, adım 3.4.2) değişiklik gerektirebilir.

DNP'nin MAS NMR'ye uygulanmasıyla, endojen fizyolojik konsantrasyonlarda proteinleri ve diğer biyomolekülleri tespit etmek artık mümkündür24,25,26. Bu, biyomolekülleri kendi ortamlarında inceleme olasılığını açar. Deney boyunca hücresel bütünlüğün ve canlılığın korunması, spektroskopinin deneysel sonuçlarını biyolojik olaylara bağlamada kritik öneme sahip olacaktır. Saflaştırılmış proteinler veya hücresellyatlar içeren numunelerin kontrolsüz dondurulması tipik olarak numune kalitesinden ödün vermez7,27, ancak saflaştırılmış sistemlerde bile donma oranının önemli bir değişken olabileceğine dair bazı göstergeler vardır28. Bununla birlikte, hücresel sağlamlığı ve canlılığı korumak yorum için önemliyse, memeli hücrelerinin örneklerinin kontrollü bir hızda dondurulması gerekir. Burada, memeli hücrelerinin donmuş örneklerinin dondurulması ve önceden soğutulmuş bir DNP MAS NMR cihazına aktarılması için potansiyel olarak zarar verici sıcaklık dalgalanmalarını önleyen ve uygulanabilir hücreler üzerinde ölçümü destekleyen bir protokol sunuyoruz.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Teksas Kanser Araştırma Önleme ve Araştırma Enstitüsü [RR150076], Ulusal Bilim Vakfı [1751174]; Ulusal Sağlık Enstitüleri [NS-111236], Welch Vakfı [1-1923-20170325]; Lupe Murchison Vakfı, Ted Nash Uzun Yaşam Vakfı ve Akrabalık Vakfı (Searle Scholars Programı) K.K.F.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
% 0.4 Tripan mavisi lekeInvitrogenT10282
100 mm hücre kültürü kabıThomas Scientific430167
150 mm hücre kültürü kabıNunc157150
3.2 mm safir rotorBruker
45 & derece açılı forsepsHampton ResearchHR4-859
AMUPolCortecnet
Siyah ve Gümüş işaretleyiciSharpie
Cap çıkarma aracıBrukerHZ16913
Hücre kültürü sınıfı suHyCloneSH30529.03
Seramik kapakCortecnetHZ12372
CoolCellCorning / BiocisionUX-04392-00 (Corning) / BCS-405 (Bioscion)
Kontes Hücre Sayma Odası SlaytlarıInvitrogenC10288
Kontes II otomatik hücre sayacıInvitrogenAMQAF1000
Kriyojen tüpleriNalgene03-337-7Y
d8-gliserolAldrich447498
Döteryum oksit, %99,8 atom DAldrich756822-1
DMEMGibco10569-010
Frekans uyumlu jiroskoplu DNP NMR sistemiBruker
Köpük dewarSpearlabFD-800
KimwipesKimwipes
Paketleme aletiBruker
Pen-StrepGibco15140-122
Toz PBSVWRVWRRV0780
Protonlanmış PBSGibco10010-023
Silikon tapaBrukerB7089
Standart Damar forseps
Tryp-LGibco12605010
C010P005

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Costello, W. N., Xiao, Y., Frederick, K. K. DNP-Assisted NMR Investigation of Proteins at Endogenous Levels in Cellular Milieu. Methods Enzymology. 615 (1), 373-406 (2019).
  2. Hall, D. A., et al. Polarization-Enhanced NMR Spectroscopy of Biomolecules in Frozen Solution. Science. 276 (5314), 930-932 (1997).
  3. Akbey, Ü, Oschkinat, H. Structural biology applications of solid state MAS DNP NMR. Journal of Magnetic Resonance. 269 (1), 213-224 (2016).
  4. Matsuki, Y., et al. Helium-cooling and -spinning dynamic nuclear polarization for sensitivity-enhanced solid-state NMR at 14T and 30K. Journal of Magnetic Resonance. 225 (1), 1-9 (2012).
  5. Miyamoto, Y., Ikeuchi, M., Noguchi, H., Hayashi, S. Long-term Cryopreservation of Human and other Mammalian Cells at -80 °C for 8 Years. Cell Medicine. 10 (1), 1-7 (2018).
  6. Lopez del Amo, J. M., Schneider, D., Loquet, A., Lange, A., Reif, B. Cryogenic solid state NMR studies of fibrils of the Alzheimer's disease amyloid-β peptide: perspectives for DNP. Journal of Biomolecular NMR. 56 (4), 359-363 (2013).
  7. Gupta, R., et al. Dynamic nuclear polarization enhanced MAS NMR spectroscopy for structural analysis of HIV-1 protein assemblies. The Journal of Physical Chemistry B. 120 (2), 329-339 (2016).
  8. Lim, B. J., Ackermann, B. E., Debelouchina, G. T. Targetable Tetrazine-Based Dynamic Nuclear Polarization Agents for Biological Systems. ChemBioChem. 21 (9), 1315-1319 (2020).
  9. Jaudzems, K., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced biomolecular NMR spectroscopy at high magnetic field with fast magic-angle spinning. Angewandte Chemie International Edition. 57 (25), 7458-7462 (2018).
  10. Chaytor, J. L., et al. Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology. 22 (1), 123-133 (2012).
  11. Mazur, P. Kinetics of water loss from cells at subzero temperatures and the likelihood of intracellular freezing. The Journal of General Physiology. 47 (2), 347-369 (1963).
  12. Lovelock, J. E., Bishop, M. W. H. Prevention of Freezing Damage to Living Cells by Dimethyl Sulphoxide. Nature. 183 (4672), 1394-1395 (1959).
  13. Bald, W. B. The relative merits of various cooling methods. Journal of Microscopy. 140 (1), 17-40 (1985).
  14. Akiyama, Y., Shinose, M., Watanabe, H., Yamada, S., Kanda, Y. Cryoprotectant-free cryopreservation of mammalian cells by superflash freezing. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (16), 7738-7743 (2019).
  15. Shi, M., et al. High-throughput non-contact vitrification of cell-laden droplets based on cell printing. Scientific Reports. 5 (1), 17928(2015).
  16. Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 1257, 3-19 (2015).
  17. Ramilo, C., et al. Detection of the covalent intermediate of UDP-N-acetylglucosamine enolpyruvyl transferase by solution-state and time-resolved solid-state NMR spectroscopy. Biochemistry. 33 (50), 15071-15079 (1994).
  18. Jeon, J., Thurber, K. R., Ghirlando, R., Yau, W. M., Tycko, R. Application of millisecond time-resolved solid state NMR to the kinetics and mechanism of melittin self-assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (34), 16717(2019).
  19. Pievo, R., et al. A rapid freeze-quench setup for multi-frequency EPR spectroscopy of enzymatic reactions. Chemphyschem. 14 (18), 4094-4101 (2013).
  20. Cherepanov, A. V., de Vries, S. Microsecond freeze-hyperquenching: development of a new ultrafast micro-mixing and sampling technology and application to enzyme catalysis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics. 1656 (1), 1-31 (2004).
  21. Hu, K. N., Tycko, R. What can solid state NMR contribute to our understanding of protein folding. Biophysical Chemistry. 151 (1), 10-21 (2010).
  22. Hu, K. N., Yau, W. M., Tycko, R. Detection of a transient intermediate in a rapid protein folding process by solid-state nuclear magnetic resonance. Journal of the American Chemical Society. 132 (1), 24-25 (2010).
  23. Johnson, S., Nguyen, V., Coder, D. Assessment of cell viability. Current Protocols in Cytometry. 64 (1), 1-26 (2013).
  24. Frederick, K. K., et al. Sensitivity-enhanced NMR reveals alterations in protein structure by cellular milieus. Cell. 163 (3), 620-628 (2015).
  25. Van Der Cruijsen, E. A. W., et al. Biomolecular DNP-supported NMR spectroscopy using Site-directed spin labeling. Chemistry. 21 (37), 12971-12977 (2015).
  26. Schlagnitweit, J., et al. Observing an antisense drug complex in intact human cells by in-cell NMR spectroscopy. ChemBioChem. 20 (19), 2474-2478 (2019).
  27. Debelouchina, G. T., et al. Dynamic nuclear polarization-enhanced solid-state NMR spectroscopy of GNNQQNY nanocrystals and amyloid fibrils. Physical Chemistry Chemical Physics : PCCP. 12 (22), 5911-5919 (2010).
  28. Schmidt, T., et al. Submillisecond freezing permits cryoprotectant-free EPR doubled electron-electron resonance spectroscopy. ChemPhysChem. 21, 1224-1229 (2020).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cryogenic Sample LoadingMagic Angle Spinning NMRDynamic Nuclear PolarizationCellular Viability PreservationLiquid Nitrogen TransferSapphire Rotor HandlingControlled Rate CoolingNMR Spectrometer OperationMammalian Cell CryopreservationSample Integrity Maintenance

Related Articles