Method Article

Bakteriyel Endoftalmitin Fare Modelinde İntravitreal Enjeksiyon ve Enfeksiyon Parametrelerinin Niceliği

DOI:

10.3791/61749

⸱

February 6th, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Ophthalmology, Dean McGee Eye Institute, 3Dean McGee Eye Institute, 4Department of Cell Biology and Department of Family and Preventive Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada bakteriyel endoftalmitin fare modelinde intravitreal enjeksiyon ve sonraki bakteriyel nicel bir yöntem tanımladık. Bu protokol, konak bağışıklık yanıtlarını ve bakteriyel ve konak gen ekspresyonunu ölçmek için genişletilebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Göz içi bakteriyel enfeksiyonlar görme için bir tehlike vardır. Araştırmacılar, uygun terapötik hedefleri belirlemek ve körlüğü önlemek için ilaçları test etmek için, konak ve bakteriyel faktörleri ve enfeksiyonla ilişkili bağışıklık yanıt yollarını araştırmak için hayvan modellerini kullanırlar. Intravitreal enjeksiyon tekniği organizmalar, ilaçlar veya diğer maddeler doğrudan gözün arka segmentinde vitreus kavite içine enjekte etmek için kullanılır. Burada, fare gözüne enfeksiyonu başlatmak için bu enjeksiyon tekniğini ve göz içi bakterileri ölçme tekniğini gösterdik. Bacillus cereus beyin kalp infüzyon sıvı ortamda 18 saat boyunca büyüdü ve bir konsantrasyon 100 koloni oluşturan birimleri (CFU)/0.5 μL için yeniden askıya alındı. Bir C57BL/6J fare ketamin ve ksilazin kombinasyonu kullanılarak anestezi edildi. Pikolitre mikroenjektör ve cam kılcal iğneler kullanılarak Fare gözünün orta vitreusuna Bacillus süspansiyonunun 0.5°L'si enjekte edildi. Kontralateral kontrol gözüne steril ortam (cerrahi kontrol) enjekte edildi ya da enjekte edilmedi (mutlak kontrol). Enfeksiyon sonrası 10 saat fareler ötenazi yapıldı ve gözler steril cerrahi cımbız kullanılarak hasat edildi ve 400 μL steril PBS ve 1 mm steril cam boncuk içeren bir tüpiçine yerleştirildi. ELISA veya miyeloperoksidaz tahlilleri için tüplere proteinaz inhibitörü eklenmiştir. RNA ekstraksiyonu için uygun lisis arabelleği eklendi. Gözler bir doku homogenizer 1-2 dakika homojenize edildi. Homojenatlar PBS'de 10 kat seri olarak seyreltildi ve agar plakaları üzerine seyreltildi. Homojenlerin geri kalanı ek tahliller için -80 °C'de saklandı. Plakalar 24 saat boyunca kuluçkaya yatırıldı ve göz başına CFU ölçüldü. Bu teknikler fare gözlerinde tekrarlanabilir enfeksiyonlara neden olur ve canlı bakterilerin nicelliğini kolaylaştırır, konak immün yanıt, konak ve bakteriyel gen ekspresyonunun omikleri.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bakteriyel endoftalmit inflamasyona neden olan yıkıcı bir enfeksiyondur, ve, düzgün tedavi edilmezse, görme veya körlük kaybına neden olabilir. Endophthalmitis göz iç içine bakteri girişi sonuçları1,2,3,4,5. Bir kez göz, bakteri çoğaltmak, toksinler ve diğer zararlı faktörler üretmek, ve hassas retina hücreleri ve dokularda geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. Göz hasarı da inflamasyon neden olabilir, göz iç içine inflamatuar hücre akını yol açan inflamatuar yolların aktivasyonu nedeniyle

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm işlemler, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Rehberi ile Görme ve Oftalmoloji Araştırma Derneği'nin Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımına İlişkin Bildirim'deki tavsiyelere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Protokoller Oklahoma Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (protokol numaraları 15-103, 18-043 ve 18-087) tarafından onaylanmıştır.

1. Steril cam iğneler

  1. İğne pipetçekmecesini açın.
  2. Isıtıcı tonuzunu ekran 12,6 gösterene kadar ayarlayın.
  3. Kapıyı açın ve 5 μL'lik kılcal tüpü üst kelepçe ve ısıtıcı f....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tekrarlanabilir bir inokül ve intravitreal enjeksiyon prosedürüdoğruluğu üreten mikrobiyal endoftalmit modelleri geliştirmede önemli adımlardır. Burada, Gram-pozitif Bacillus cereuskullanarak intravitreal enjeksiyon prosedürü gösterdi. Beş C57BL6 farenin orta vitreusuna 100 CFU/0.5 μL B. sereus enjekte ettik. 10 saat sonrası enfeksiyon sonrası B. sereus'un göz içi büyümesini yaklaşık 1.8 x 105 CFU/göz olarak gözlemledik. Şekil 1, bakterileri fare gözleri.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Güçlü antibiyotikler, anti-inflamatuar ilaçlar ve vitrektomi cerrahisi durumu bile, bakteriyel endofalmit bir hasta kör olabilir. Klinik çalışmalar endofalmit in incelenmesinde yararlı olmuştur; ancak, endoftalmit deneysel modelleri, bakım standardında ilerlemeye çevrilebilen hızlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlar ve bu da hastalar için daha iyi görsel sonuçlar sağlar.

Fare gözünün vitreus hacmi yaklaşık 7 μL40'tır. Bu küçük hacim sadece sınırlı miktarda malzemenin en.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak mali bir çatışmaları yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Dr Feng Li ve Mark Dittmar (OUHSC P30 Canlı Hayvan Görüntüleme Çekirdek, Dean A. McGee Göz Enstitüsü, Oklahoma City, Tamam, ABD) yardımları için teşekkür ederiz. Araştırmamız Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir R01EY028810, R01EY028066, R01EY025947 ve R01EY024140. Araştırmamız ayrıca P30EY21725 (Canlı Hayvan Görüntüleme ve Analizi, Moleküler Biyoloji ve Hücresel Görüntüleme için NIH CORE hibesi) tarafından desteklenmiştir. Araştırmamız ayrıca NEI Vision Science Pre-doctoree programı 5T32EY023202, Presbiteryen Sağlık Vakfı Araştırma Desteği hibesi ve Körlüğü Önlemek Için Araştırma'dan Dean A. McGee Göz Enstitüsü'ne sınırsız bir hibe ile destek....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
2-20 ve mikro; L pipetRANINL0696003GNA
37oC İnkübatörFisher Scientific11-690-625DNA
Bacto Beyin Kalp İnfüzyonuBD90003-032NA
Hücre MikroenjektörüMicroData Instrument, Inc.PM2000NA
İnce uçlu forsepsThermo Fisher Scientific12-000-122NA
Cam boncuklar 1.0 mmBioSpec11079110NA
İnkübatör ÇalkalayıcıNew Brunswick ScientificNB-I2400NA
Mikrokapiler Pipetler 5Mikrolitre Kimble71900-5NA
Mikro Pipet BevelerSutter Instrument Co.BV-10
NA Mikroskop, Axiostar PlusZeissNA
Mikroskop, OPMI Lumera, ZeissNA
Mini-Beadbeater-16BioSpecModel 607NA
Çok Kanallı pipet, 30-300 ve mikro; LBiohit15626090NA
Çok Kanallı pipet 5-100 & mikro; LBiohit9143724NA
İğne / Pipet Çektirme Kopf730NA
PBSGIBCOMoleküler dereceli
Proteaz İnhibitörü KokteylRoche4693159001Moleküler sınıf
Ters etkili forsepsKatenaK5-8228NA
, , , 1897315

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ramadan, R. T., Ramirez, R., Novosad, B. D., Callegan, M. C. Acute inflammation and loss of retinal architecture and function during experimental Bacillus endophthalmitis. Current Eye Research. 31 (11), 955-965 (2006).
  2. Callegan, M. C., Booth, M. C., Jett, B. D., Gilmore, M. S.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Intravitreal InjectionBacterial EndophthalmitisMouse ModelCFU QuantitationTissue HomogenizationSerial DilutionAgar Plate IncubationColony Forming UnitsProtease InhibitorGlass Capillary Needle

Related Articles