Method Article

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarda yetiştirilen bir doku veya tıbbi bir cihazın bir bireye implante edilmesinin başarısı, alıcı konağın bağışıklık tepkisine bağlıdır. Bir implantı yabancı bir cisim olarak kabul etmek, düşmanca ve düzensiz bir bağışıklık tepkisi implantın reddedilmesine neden olabilirken, düzenlenmiş bir yanıt ve homeostazın yeniden kazanılması, kabulüne yol açabilir. İn vivo veya ex vivo ortamlarda diseke edilen implantların mikro ortamlarının analiz edilmesi, sonuçta yeni nesil biyomateryallerin geliştirilmesine yardımcı olabilecek bağışıklık tepkisi modelinin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerini ve alt kümelerini hücre yüzey belirteçlerine göre karakterize etmek için iyi bilinen bir tekniktir. Bu derlemede, diseke edilmiş implant dokusundan tek tip hücre süspansiyonlarının izolasyonu için manuel küp küp doğrama, enzimatik sindirim ve bir hücre süzgecinden filtrasyona dayalı bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, bu izole edilmiş hücreleri akış sitometrisi ile karakterize etmek ve ölçmek için ilk sitometre ayarları için adımlarla birlikte çok renkli bir akış sitometrisi boyama protokolü açıklanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tıp alanındaki gelişmeler, hasarlı dokunun işlevini veya yeniden büyümesini desteklemek için implante edilen malzemelerin sıklıkla kullanılmasına yol açmıştır 1,2. Bunlar arasında kalp pilleri, rekonstrüktif kozmetik implantlar ve kemik kırığı fiksasyonu için kullanılan ortopedik plakalar gibi cihazlar bulunur 3,4. Ancak bu implantları yapmak için kullanılan materyaller ve implante edildikleri yerler bu implantların başarısını belirlemede önemli rol oynamaktadır 5,6,7

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Şekil 1 , akış sitometrisi protokolüne genel bir bakış sunar.

1) Reaktif hazırlama

  1. Enzimleri seyreltmek ve doku kültürü için ortam hazırlayın.
    1. 500 mL RPMI ortamına 5 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın. Ortamı daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Enzim çözeltisinin hacmini hesaplayın.
    NOT: Enzim çözeltisinin hacmi, 6 oyuklu plakalarda doğranmış dokuyu sindirmek için gerekli olacak enzimleri (kollajenaz ve DNaz I) içeren ortamın hacmidir; Numune sayısına bağlıdır.
    1. Gerekli hacmi hes....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmün analiz için akış sitometrisi panellerinin geliştirilmesi süreci genellikle sonuçların mevcut verilerle ve alandaki literatürle karşılaştırılmasına dayanır. Popülasyonların akış sitometrisinde nasıl bulunabileceğinin bilinmesi, verilerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Ne olursa olsun, popülasyonlar ve hücre tipleri farklı dokularda farklı görünebilir, bu nedenle bazı değişkenlikler beklenebilir. İyi tanımlanmış kontrol dokuları bağlamında, bu tür boyama optimizasyonu,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu derleme, tek tip bir hücre süspansiyonu elde etmek için biyomateryal implantlardan hücreleri izole etmek için ayrıntılı bir metodolojiyi açıklamaktadır. Ek olarak, çok renkli akış sitometrisi için hücre süspansiyonunun boyanması için ayrıntılı bir protokol ve optimum sonuçlar için bir akış sitometresi yapılandırma adımları sağlanmıştır. Hücre izolasyon yöntemleri, dokudaki hücre dışı matrisi ayrıştırmak ve tek tek hücreleri dokudan serbest bırakmak için hücre-hücre bağlantılarını bozmak için genellikle manuel doku dis.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü de dahil olmak üzere NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Feragatname: NIH, yetkilileri ve çalışanları herhangi bir şirketi, ürünü veya hizmeti önermez veya onaylamaz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL konik tüplerFisher Scientific14-432-22
6 Kuyulu PlakaFisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655Sadece hücreleri sabitlemek için
Sığır serum albüminiMillipore SigmaA7906FACS hazırlamak için boyama tamponu
CD11b AF700Biolegend101222Klonu: M1 / 70
CD11c PerCP / Cy5.5Biolegend117325Klonu: N418
CD197 PE / Dazzle594Biolegend120121Klonu: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207Klonu: Ba13
CD206 PEBiolegend141705Klonu: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778Klon: 104 / A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199Klon: GL1
CD8a BV421Biolegend100737Klon: 53-6.7
Comp Bead anti-fareBD Biosciences552843Kompanzasyon kontrolü için
DNase IMillipore Sigma11284932001Sığır pankreas deoksiribonükleaz I (DNase I
)F4/80 PE/Cy7Biolegend123113Klon: BM8
Fc BlokBiolegend101301Klon: 93
Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm KitiBD Biosciences554714Hücrelerin sabitlenmesi ve geçirgenliği için.
HEPES tamponuThermo Fisher15630080Hücre ortamını desteklemek için tampon
LiberaseMillipore Sigma5401127001Saflaştırılmış Kollajenaz I ve Kollajenaz II Karışımı
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke KitiThermo FisherL23105Canlı boya
Ly6c AF488Biyoefsane128015Klon: HK1.4
Ly6g BV510Biyoefsane127633Klon: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894Klon: M5 / 114.15.2
Fosfat tampon salinThermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176Hücre kültürü ortamı
Siglec F BV605BD Biosciences740388Klon: E50-2440
V-tabanlı 96 oyuklu plaka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

Related Articles