Method Article

Diseke İmplant Dokularının İmmün Fonksiyon Analizi için Yüksek Boyutluluk Akış Sitometrisi

DOI:

10.3791/61767

⸱

September 15th, 2021

 , 
1Section on Immuno-Engineering, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi ile karakterizasyonu, implantlara karşı immün yanıt paterninin anlaşılmasına önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu makale, diseke implantlardan hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrik analizi için boyanması için kesin bir yöntemi açıklamaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Laboratuvarda yetiştirilen bir doku veya tıbbi bir cihazın bir bireye implante edilmesinin başarısı, alıcı konağın bağışıklık tepkisine bağlıdır. Bir implantı yabancı bir cisim olarak kabul etmek, düşmanca ve düzensiz bir bağışıklık tepkisi implantın reddedilmesine neden olabilirken, düzenlenmiş bir yanıt ve homeostazın yeniden kazanılması, kabulüne yol açabilir. İn vivo veya ex vivo ortamlarda diseke edilen implantların mikro ortamlarının analiz edilmesi, sonuçta yeni nesil biyomateryallerin geliştirilmesine yardımcı olabilecek bağışıklık tepkisi modelinin anlaşılmasına yardımcı olabilir. Akış sitometrisi, bağışıklık hücrelerini ve alt kümelerini hücre yüzey belirteçlerine göre karakterize etmek için iyi bilinen bir tekniktir. Bu derlemede, diseke edilmiş implant dokusundan tek tip hücre süspansiyonlarının izolasyonu için manuel küp küp doğrama, enzimatik sindirim ve bir hücre süzgecinden filtrasyona dayalı bir protokol açıklanmaktadır. Ayrıca, bu izole edilmiş hücreleri akış sitometrisi ile karakterize etmek ve ölçmek için ilk sitometre ayarları için adımlarla birlikte çok renkli bir akış sitometrisi boyama protokolü açıklanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tıp alanındaki gelişmeler, hasarlı dokunun işlevini veya yeniden büyümesini desteklemek için implante edilen malzemelerin sıklıkla kullanılmasına yol açmıştır 1,2. Bunlar arasında kalp pilleri, rekonstrüktif kozmetik implantlar ve kemik kırığı fiksasyonu için kullanılan ortopedik plakalar gibi cihazlar bulunur 3,4. Ancak bu implantları yapmak için kullanılan materyaller ve implante edildikleri yerler bu implantların başarısını belirlemede önemli rol oynamaktadır 5,6,7. Yabancı cisimler olarak, bu implantlar konakçıdan reddedilmeye veya toleransa yol açabilecek bir bağışıklık tepkisi oluşturabilir8. Bu faktör, implantasyondan sonra istenen bağışıklık tepkisini çekebilecek materyaller üretmek için biyomateryal araştırmalarını yönlendirmiştir 9,10,11,12.

Bağışıklık tepkisi, hasarlı bir doku veya organın değiştirilmesi için bir laboratuvarda bir doku veya organın bir biyomateryal iskeleti (iskele) etrafında büyütüldüğü rejeneratif tıp alanında temel bir gerekliliktir13,14,15,16. Rejeneratif tıpta amaç, her biri bağışıklık tepkileri tarafından büyük ölçüde modüle edilebilen hücreler, sinyaller ve iskeleler kullanarak eksik veya hasarlı dokuyu değiştirmektir17. Ayrıca, immün yanıt eksikliği istendiğinde bile, çok nadiren istenen düzenleyici bir profilin varlığından ziyade immün aktivitenin yokluğudur18. Akış sitometrisi gibi teknikler, implant cihazlarını kaplamak veya doku mühendisliği için iskele geliştirmek için kullanılan çeşitli biyomalzemelere karşı bağışıklık tepkisi modelini karakterize etmede önemli bir rol oynayabilir19.

Bu bilgi, sonuçta, bağışıklık sistemi tarafından iyi tolere edilebilen implantlar için biyomateryallerin geliştirilmesine veya doku mühendisliğinde yapıcı bir rol oynayabilecek iskelelerin geliştirilmesine yardımcı olacaktır. Akış sitometrisi ile analiz için numunelerin uygun şekilde hazırlanması, floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması yoluyla immün karakterizasyonda yanlış sonuçlardan kaçınmak için önemli bir adımdır20,21. Bu nedenle, bu derleme, hücrelerin iskele dokusundan izolasyonu, hücre süspansiyonunun boyanması ve akım sitometrisi ile analizi için kullanılabilecek ayrıntılı bir metodoloji sunmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Şekil 1 , akış sitometrisi protokolüne genel bir bakış sunar.

1) Reaktif hazırlama

  1. Enzimleri seyreltmek ve doku kültürü için ortam hazırlayın.
    1. 500 mL RPMI ortamına 5 mL 4- (2-hidroksietil) -1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) tampon çözeltisi ekleyin ve iyice çalkalayın. Ortamı daha fazla kullanana kadar 4 °C'de saklayın.
  2. Enzim çözeltisinin hacmini hesaplayın.
    NOT: Enzim çözeltisinin hacmi, 6 oyuklu plakalarda doğranmış dokuyu sindirmek için gerekli olacak enzimleri (kollajenaz ve DNaz I) içeren ortamın hacmidir; Numune sayısına bağlıdır.
    1. Gerekli hacmi hesaplamak için aşağıdaki denklemi kullanın:
      (Sindirilecek numune sayısı) × 10 mM HEPES tamponu ile 5 mL serumsuz RPMI
      NOT: Örneğin, 0.1 ila 0.3 g disseke dalak için, enzim çözeltisini hazırlamak için 5 mL ortam kullanın. Bu yazıda tarif edilen enzimatik sindirim protokolü, esas olarak beyin, böbrek, deri, karaciğer, akciğerler, dalak, kaslar ve ayrıca sentetik malzemelerden veya hücre dışı matriks proteinlerinden yapılmış deri altı implantların etrafındaki kapsülleri içeren farelerden diseke edilen yumuşak dokular (0.1 ila 1 g arasında değişen) içindir. Sert kıkırdaklı dokuların sindirilmesi, yalnızca optimizasyonla tespit edilebilen farklı koşullar ve hacimlerde sindirim enzimleri gerektirebilir.
    2. Enzim çözeltisi için ihtiyacım olan kollajenaz ve DNaz miktarını hesaplayın.
      NOT: Bu protokolde 0.25 mg/mL kollajenaz ve 0.2 mg/mL DNaz I kullanılmıştır. Kollajenaz ve DNaz için gerekli çalışma konsantrasyonları, farklı doku tipleri için değişebilir19.
  3. 999 μL fosfat tamponlu saline (PBS) 1 μL canlılık boyası ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyerek 1:1000 canlılık boya çözeltisi hazırlayın ve çözeltiyi girdaplayın. Çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  4. 100 mL PBS'ye 1 g sığır serum albümini (BSA) ekleyerek boyama tamponunu hazırlayın ve BSA tamamen eriyene kadar çözeltiyi vorteksleyin. Çözeltiyi daha fazla kullanılana kadar 4 °C'de saklayın.

2) Enzimatik sindirim plakalarının ayarlanması

  1. Her kuyucukta 70 μm hücre süzgeci bulunan 6 oyuklu bir plaka oluşturun. Her bir oyuğa adım 1.1.1'den 3 mL hazırlanan ortam ekleyin ve buz üzerinde inkübe edin.
  2. Hesaplanan kollajenaz ve DNaz I miktarını süspanse etmek için kalan ortamı (2 mL/kuyu) 37 °C'de bir inkübatörde veya su banyosunda saklayın (adım 1.2.2).

3) Hücrelerin izolasyonu

  1. Kesilen implantları/dokuyu plakalara yerleştirin ve makas kullanarak ince ince doğrayın. Alternatif olarak, bir doku ayrıştırıcı veya el tipi homojenizatör kullanarak mekanik bir parçalama yöntemi kullanın. Çok sayıda lökosit nedeniyle, her çalışmada boyama kontrolü olarak kullanmak için dalağı inceleyin.
    NOT: Bazı materyaller daha yüksek fibroz seviyelerine neden olduğundan, bu protokol hem yüksek fibrotik hem de minimal fibrotik materyaller için geçerlidir. Bununla birlikte, her işleme yöntemi, boyamadan önce sindirimden sonra hem hücre verimi hem de canlılık açısından değerlendirilmelidir. Diseksiyon sırasında periferik kan kontaminasyonundan kaçının.
  2. 37 ° C'ye ısıtılmış kalan RPMI'ye (2 mL) kollajenaz ve DNaz I (adım 1.2.2'de hesaplanan hacim) ekleyin. Her oyuğa 2 mL tam enzim çözeltisi ekleyin.
  3. Plakaları 37 °C ve 100 rpm'de 45 dakika inkübe edilmiş bir çalkalayıcıya yerleştirin.
    NOT: Uygun ısı transferini engelleyebileceğinden plakaları istiflerken dikkatli olun.
  4. Bu arada 1000 μL'lik bir ucun ucundan makasla 3-4 mm doğrayarak süspansiyon dağıtma ucu hazırlayın. İnkübasyondan sonra, doğranmış ucu kullanarak iyice karıştırmak için süspansiyonu kuyucuklarda yukarı ve aşağı pipetleyin. Hücre süzgecini 50 mL'lik konik bir tüpün üstüne yerleştirin ve sindirilmiş çözeltiyi hücre süzgecinden geçirin.
    NOT: 70 μm hücre süzgeci, hücreleri aljinat gibi implante edilmiş biyomateryalden ayırmak için yeterlidir. Daha fazla saflık gerekiyorsa, zenginleştirilmiş bir lökosit popülasyonu elde etmek için yoğunluk gradyan ayrımı gibi işlemleri kullanın.
  5. Kuyucukları 1x PBS solüsyonu ile durulayın ve durulama hacmini süzgeçten aktarın, ardından tüpteki hacim 50 mL'ye ulaşana kadar süzgecin yıkamalarını 1x PBS solüsyonu ile ekleyin.
    NOT: Sindirimin viskozitesinde herhangi bir artışı önlemek ve santrifüjleme sırasında hücre peletlenmesine izin vermek için 1x PBS oda sıcaklığında olmalıdır.
  6. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Santrifüjlemeyi takiben, peleti bozmadan serolojik bir pipet kullanarak süpernatanı dikkatlice aspire edin. Peleti 1000 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve süspansiyonu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
  7. 10 μL hücre süspansiyonunu 10 μL tripan mavisi ile karıştırın ve süspansiyonu, otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücreleri saymak için sayma odası slaytlarına veya mikroskop altında geleneksel yöntemle saymak için bir hemositometreye yükleyin. Alternatif olarak, akış sitometrisi hücre sayma boncukları kullanın.

4) Akış sitometrisi için boyama

  1. 2 numune, floresan eksi bir (FMO) kontrolleri, kompanzasyon kontrolleri ve tamamen lekeli dalak numune kontrolü ile 14 renkli bir deney için örnek bir plaka düzeni için Şekil 45'ye bakın. Toplam hücre sayısını tahmin ettikten sonra, her numune için 1 × 10 6 hücreyi ve her kompanzasyon ve FMO kontrolü için 0,5 × 106 hücreyi boyamak için gereken hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. Hücre süspansiyonunun gerekli hacmini V-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına dağıtın ve hacmi 1x PBS ile 100 μL'ye çıkarın.
    NOT: Örnek olarak, adım 3.6'da elde edilen 1000 μL hücre süspansiyonu 40 × 10 6 hücre içeriyorsa, 1 × 10 6 hücre için 1000/40 × 106 = 25 μL hücre süspansiyonu gerekecektir.
  2. Plakayı 300 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı aspire edin ve daha sonra 100 μL 1:1000 canlılık boyası çözeltisi ile canlılığı belirlemek için numune kuyucuklarında ve bir dengeleme kontrol kuyusunda hücreleri yeniden süspanse edin (bkz.
  3. Diğer kompanzasyon kuyularının yanı sıra FMO ve boyanmamış kuyulardaki hücreler için, bunları 100 μL 1x PBS ile yeniden süspanse edin.
  4. Hücreleri karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin.
  5. Bu arada, numuneyi ve FMO kontrollerini boyamak için bir yüzey antikor kokteyli hazırlayın: numune başına 50 μL veya FMO. Antikor kokteyli örneği için Tablo 1'e bakınız.
  6. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 100 μl 1x PBS ekleyin, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da döndürün.
  7. Süpernatanı aspire edin ve 200 μL boyama tamponunda (1x PBS +% 1 BSA) yeniden süspanse edin; 300 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  8. Süpernatanı aspire edin ve 50 μL 1x PBS ile kompanzasyon, FMO ve boyanmamış kuyucuklardaki hücreleri yeniden süspanse edin. İlgili numune kuyucuklarına ve FMO kuyucuklarına 50 μL antikor kokteyli ekleyin. İlgili antikorları farklı kompanzasyon kuyularına ekleyin.
  9. Plakayı karanlıkta 4 °C'de 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa 150 μL boyama tamponu ekleyin ve hücre süspansiyonunu 300 ° C'de 5 dakika boyunca 4 × g'da santrifüjleyin.
  10. Süpernatanı aspire edin, hücreleri 200 μL boyama tamponu ile yeniden süspanse edin ve hücre süspansiyonunu 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
  11. Numuneleri fiksasyon olmadan analiz ediyorsanız, bunları 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin ve sitometre kurulumu ve numune analizi ile ilgili bölüm 6'ya geçin. Hücreleri sabitliyorsanız, yıkadıktan sonra süpernatanı aspire edin ve% 4 paraformaldehit gibi 100 μL bir fiksatif ekleyin. Hücre içi belirteçler için boyama yapıyorsanız, hücre içi boyama ile ilgili bölüm 5'e geçin ve hücreleri sabitleyin ve geçirgen hale getirin (bkz. Hücreleri karanlıkta 4 ° C'de 20 dakika inkübe edin.
    NOT: Fiksasyon, bazı floroforların floresan yoğunluğunu etkileyebileceğinden, her paneli hem fiksasyonlu hem de fiksasyonsuz olarak değerlendirin.
  12. İnkübasyondan sonra, 100 μL 1x PBS ekleyin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin, 1x PBS'de yeniden süspanse edin ve 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin.
  13. Hücreleri 200 μL boyama tamponunda tekrar süspanse edin ve akış sitometrik analizinden önce 4 ° C'de saklayın.

5) Hücre içi boyama

  1. Hücre içi belirteçler için fiksasyon ve geçirgenlik için adım 4.11'den devam ederek, 100 μL uygun tampon ekleyin. Hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri 200 μL fiksatif-geçirgen ajan çözeltisinde yeniden süspanse edin; hücreleri 350 × g'da 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı aspire edin ve peletleri uygun tamponda seyreltilmiş hücre içi antikorlarla yeniden süspanse edin.
    NOT: Antikor tipleri ve dilüsyonları hedef hücrelere bağlı olacaktır. Örneğin, yaygın bir hücre içi belirteç, düzenleyici T hücreleri için sıklıkla 1:100 seyreltmede kullanılan çatal başlı kutu P3'tür.
  2. Hücre süspansiyonunu karanlıkta 4 °C'de 45 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 150 μL uygun tampon ekleyin ve süspansiyonu 350 × g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  3. Süpernatanı aspire edin ve hücreleri 200 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin, ardından 4 ° C'de 5 dakika boyunca 300 × g'da santrifüjleyin. Akış sitometrik analizi için hücreleri 200 μL boyama tamponunda aspire edin ve yeniden süspanse edin.

6) Sitometre ve kompanzasyon kurulumu

  1. Numuneleri çalıştırmadan hemen önce, hücre bazlı kompanzasyon yerine boncuk bazlı kompanzasyon kullanılıyorsa, kompanzasyon boncukları hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
    1. Her florokrom konjuge antikor için ayrı mikrosantrifüj tüplerini etiketleyin ve her tüpe 100 μL 1x PBS ve ardından bir tam damla anti-fare negatif kontrol kompanzasyon boncuğu ve bir damla pozitif kontrol kompanzasyon boncuğu ekleyin. Her ayrı tüpe 1 μL uygun antikor ekleyin. Vorteks yapın ve satın almadan önce 5 dakika inkübe edin.
      NOT: BUV737 gibi bazı boyalar boncuklara bağlanamadığından, hücre tabanlı bir kontrol kullanın.
  2. Sitometre kurulumunu izleme boncuklarıyla çalıştırarak her deneyden önce akış sitometresini kalibre edin ve her deney için akış sitometresi ayarlarını koruyun.
  3. Numuneyi analiz etmeden önce, hücre popülasyonu grafiğin ortasına düşecek ve ölçek dışı olmayacak şekilde bir yan saçılma (SSC) ve ileri dağılım (FSC) grafiğindeki hücre popülasyonunu ayarlamak için boyanmamış bir numune çalıştırarak akış sitometresini ayarlayın.
  4. Hiçbir olayın her kanalın logaritmik ölçeğinin dışına çıkmadığından emin olmak için FSC ve SSC voltajlarını ve her kanal için ayarlamak üzere lekeli örneği kısa bir süre çalıştırın. Her kompanzasyon kontrolü için 5.000 olay kaydedin, ardından pozitif ve negatif popülasyonların geçitlenmesi izleyin. Ücret matrisini hesaplayın ve ardından ilgili popülasyonlar için en az 1.000 olay toplayarak örnekleri çalıştırın.
    NOT: Otomatik ücretlendirme aşırı veya eksik ücretlendirmeye eğilimli olabileceğinden, daha büyük renkli panellerdeki dengeleme doğrulanmalıdır. Aşırı veya eksik telafi belirtilerini izlemek için her parametrenin grafiği diğer tüm parametrelere göre grafiklendirilmeli ve her tek renkli kontrol değerlendirilmelidir. Daha büyük renkli deneylerin karmaşık telafisi, bir işbirlikçinin veya kapsamlı akış sitometrisi deneyimine sahip bir çekirdek tesisin yardımıyla gerçekleştirilmelidir. Spektral sitometreler gibi daha yeni akış sitometreleri, tek başına standart kompanzasyona kıyasla daha temiz bir floresan örtüşme ayrımı sağlayabilen, spektral karıştırma olarak bilinen bir işlem yoluyla bir floroforun tam spektrumunu kullanır22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İmmün analiz için akış sitometrisi panellerinin geliştirilmesi süreci genellikle sonuçların mevcut verilerle ve alandaki literatürle karşılaştırılmasına dayanır. Popülasyonların akış sitometrisinde nasıl bulunabileceğinin bilinmesi, verilerin doğru yorumlanması için kritik öneme sahiptir. Ne olursa olsun, popülasyonlar ve hücre tipleri farklı dokularda farklı görünebilir, bu nedenle bazı değişkenlikler beklenebilir. İyi tanımlanmış kontrol dokuları bağlamında, bu tür boyama optimizasyonu,...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu derleme, tek tip bir hücre süspansiyonu elde etmek için biyomateryal implantlardan hücreleri izole etmek için ayrıntılı bir metodolojiyi açıklamaktadır. Ek olarak, çok renkli akış sitometrisi için hücre süspansiyonunun boyanması için ayrıntılı bir protokol ve optimum sonuçlar için bir akış sitometresi yapılandırma adımları sağlanmıştır. Hücre izolasyon yöntemleri, dokudaki hücre dışı matrisi ayrıştırmak ve tek tek hücreleri dokudan serbest bırakmak için hücre-hücre bağlantılarını bozmak için genellikle manuel doku dis...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu araştırma kısmen, Ulusal Biyomedikal Görüntüleme ve Biyomühendislik Enstitüsü de dahil olmak üzere NIH'nin Intramural Araştırma Programı tarafından desteklenmiştir. Feragatname: NIH, yetkilileri ve çalışanları herhangi bir şirketi, ürünü veya hizmeti önermez veya onaylamaz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
50 mL konik tüplerFisher Scientific14-432-22
6 Kuyulu PlakaFisher Scientific07-000-646
BD Brilliant Stain Buffer PlusBD Biosciences566385
BD CytofixBD Biosciences554655Sadece hücreleri sabitlemek için
Sığır serum albüminiMillipore SigmaA7906FACS hazırlamak için boyama tamponu
CD11b AF700Biolegend101222Klonu: M1 / 70
CD11c PerCP / Cy5.5Biolegend117325Klonu: N418
CD197 PE / Dazzle594Biolegend120121Klonu: 4B12
CD200R3 APCBiolegend142207Klonu: Ba13
CD206 PEBiolegend141705Klonu: C068C2
CD45 BUV737BD Biosciences612778Klon: 104 / A20
CD86 BUV395BD Biosciences564199Klon: GL1
CD8a BV421Biolegend100737Klon: 53-6.7
Comp Bead anti-fareBD Biosciences552843Kompanzasyon kontrolü için
DNase IMillipore Sigma11284932001Sığır pankreas deoksiribonükleaz I (DNase I
)F4/80 PE/Cy7Biolegend123113Klon: BM8
Fc BlokBiolegend101301Klon: 93
Fiksasyon/Geçirgenleştirme Çözüm KitiBD Biosciences554714Hücrelerin sabitlenmesi ve geçirgenliği için.
HEPES tamponuThermo Fisher15630080Hücre ortamını desteklemek için tampon
LiberaseMillipore Sigma5401127001Saflaştırılmış Kollajenaz I ve Kollajenaz II Karışımı
CANLI/ÖLÜ Sabitlenebilir Mavi Ölü Hücre Leke KitiThermo FisherL23105Canlı boya
Ly6c AF488Biyoefsane128015Klon: HK1.4
Ly6g BV510Biyoefsane127633Klon: 1A8
MHCII BV786BD Biosciences742894Klon: M5 / 114.15.2
Fosfat tampon salinThermo FisherD8537
RPMIThermo Fisher11875176Hücre kültürü ortamı
Siglec F BV605BD Biosciences740388Klon: E50-2440
V-tabanlı 96 oyuklu plaka

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Joung, Y. H. Development of implantable medical devices: from an engineering perspective. International Neurourology Journal. 17 (3), 98-106 (2013).
  2. Langer, R., Folkman, J. Polymers for the sustained release of proteins and other macromolecules. Nature. 263 (5580), 797-800 (1976).
  3. Rolfe, B., et al. The fibrotic response to implanted biomaterials: implications for tissue engineering. Regenerative Medicine and Tissue Engineering-Cells and Biomaterials. Eberli, D., et al. , IntechOpen. (2011).
  4. Erdem, S., Gür, M., Kaman, M. O. Static and dynamic analyses of fracture fixation bone-plate systems for different plate materials and dimensions. Bio-Medical Materials and Engineering. 29 (5), 611-628 (2018).
  5. Kang, C. -W., Fang, F. -Z. State of the art of bioimplants manufacturing: part I. Advances in Manufacturing. 6 (1), 20-40 (2018).
  6. Sadtler, K., et al. Divergent immune responses to synthetic and biological scaffolds. Biomaterials. 192, 405-415 (2019).
  7. Sadtler, K., et al. Design, clinical translation and immunological response of biomaterials in regenerative medicine. Nature Reviews Materials. 1 (7), 16040(2016).
  8. Hubbell, J. A., Thomas, S. N., Swartz, M. A. Materials engineering for immunomodulation. Nature. 462 (7272), 449-460 (2009).
  9. Badylak, S. F., Valentin, J. E., Ravindra, A. K., McCabe, G. P., Stewart-Akers, A. M. Macrophage phenotype as a determinant of biologic scaffold remodeling. Tissue Engineering Part A. 14 (11), 1835-1842 (2008).
  10. Wolf, M. T., et al. Polypropylene surgical mesh coated with extracellular matrix mitigates the host foreign body response. Journal of Biomedical Material Research Part A. 102 (1), 234-246 (2014).
  11. Zhang, L., et al. Zwitterionic hydrogels implanted in mice resist the foreign-body reaction. Nature Biotechnology. 31 (6), 553-556 (2013).
  12. Sussman, E. M., Halpin, M. C., Muster, J., Moon, R. T., Ratner, B. D. Porous implants modulate healing and induce shifts in local macrophage polarization in the foreign body reaction. Annals of Biomedical Engineering. 42 (7), 1508-1516 (2014).
  13. Tan, H., Marra, K. G. Injectable, Biodegradable hydrogels for tissue engineering applications. Materials. 3 (3), 1746-1767 (2010).
  14. Lee, D. C., Lamm, R. J., Prossnitz, A. N., Boydston, A. J., Pun, S. H. Dual polymerizations: untapped potential for biomaterials. Advance Healthcare Materials. 8 (6), 1800861(2019).
  15. Sadtler, K., et al. Developing a pro-regenerative biomaterial scaffold microenvironment requires T helper 2 cells. Science. 352 (6283), 366-370 (2016).
  16. Gower, R. M., et al. Modulation of leukocyte infiltration and phenotype in microporous tissue engineering scaffolds via vector induced IL-10 expression. Biomaterials. 35 (6), 2024-2031 (2014).
  17. Graney, P. L., Lurier, E. B., Spiller, K. L. Biomaterials and bioactive factor delivery systems for the control of macrophage activation in regenerative medicine. ACS Biomaterials Science & Engineering. 4 (4), 1137-1148 (2018).
  18. Kontos, S., Grimm, A. J., Hubbell, J. A. Engineering antigen-specific immunological tolerance. Current Opinion Immunology. 35, 80-88 (2015).
  19. Sadtler, K., Elisseeff, J. H. Analyzing the scaffold immune microenvironment using flow cytometry: practices, methods and considerations for immune analysis of biomaterials. Biomaterials Science. 7 (11), 4472-4481 (2019).
  20. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. Journal of Immunological Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  21. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. , Wiley. (2003).
  22. Nolan, J. P., Condello, D. Spectral flow cytometry. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 1, Unit 1.27 (2013).
  23. Wolf, M. T., et al. A biologic scaffold-associated type 2 immune microenvironment inhibits tumor formation and synergizes with checkpoint immunotherapy. Science Translational Medicine. 11 (477), (2019).
  24. Kahng, J., et al. Flow cytometric white blood cell differential using CytoDiff is excellent for counting blasts. Annals of laboratory medicine. 35 (1), 28-34 (2015).
  25. Sionov, R. V., et al. Isolation and characterization of neutrophils with anti-tumor properties. Journal of Visualized Experiments. (100), e52933(2015).
  26. Lay, J. C., Peden, D. B., Alexis, N. E. Flow cytometry of sputum: assessing inflammation and immune response elements in the bronchial airways. Inhalation Toxicology. 23 (7), 392-406 (2011).
  27. Brooks, C. R., van Dalen, C. J., Hermans, I. F., Douwes, J. Identifying leukocyte populations in fresh and cryopreserved sputum using flow cytometry. Cytometry Part B: Clinical Cytometry. 84 (2), 104-113 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Flow CytometryImmune Function AnalysisImplant Tissue DissectionCell Isolation ProtocolEnzymatic DigestionMulticolor StainingCell Surface MarkersImmune Cell CharacterizationBiomaterial Immune ResponseSpectral Unmixing

Related Articles