Bu protokolün amacı, ilaç tarama çalışmaları için kullanılabilecek 3D meme endotelyal ortak kültür modellerini hızla oluşturmak için önceden oluşturulmuş endotel ağlarına çok hücreli sferoidler olarak meme epitel hücrelerini doğrudan biyobaskılamaktır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
3D Çok Hücreli Meme Sferoidlerinin Endotel Ağlarına Doğrudan Biyobaskı
Bu makalede
Özet
Özet
Biyobaskı, in vivo doku mimarisinin kritik özelliklerini daha iyi yeniden toplayan 3D insan kanseri modelleri imal etmek için umut verici bir araç olarak ortaya çıkıyor. Mevcut katman katman ekstrüzyon biyobaskısında, tek tek hücreler hiyerarşik doku kendini birleştirmeyi teşvik etmek için karmaşık mekansal ve zamansal ipuçları ile birlikte bir biyoinkte ekstrüde edilir. Bununla birlikte, bu biyofabrikasyon tekniği hücreler, biyoinksler ve biyokimyasal ve biyofiziksel ipuçları arasındaki karmaşık etkileşimlere dayanır. Bu nedenle, kendi kendine montaj günler hatta haftalar sürebilir, belirli biyoinksler gerektirebilir ve her zaman birden fazla hücre tipi söz konusu olduğunda ortaya çıkmayabilir. Bu nedenle, çeşitli biyoinkslerde önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidlerini doğrudan biyobaskılamak için bir teknik geliştirdik. Biyobaskı önceden oluşturulmuş 3D meme epitel sferoidleri baskıdan sonra canlılıklarını ve polarize mimarilerini sürdürdüler. Ayrıca 3D sferoidleri vasküler endotel hücre ağlarına yazdırarak ortak kültür modeli oluşturduk. Böylece, yeni biyobaskı tekniği hızla daha düşük maliyetle ve geleneksel biyobaskı tekniklerinden daha yüksek esneklikle daha fizyolojik olarak ilgili bir 3D insan meme modeli oluşturur. Bu çok yönlü biyobaskı tekniği, ek biyoinkslerde diğer dokuların 3D modellerini oluşturmak için tahmin edilebilir.
Giriş
3D in vitro vasküler tümör modelleri kanser büyümesi ve metastazının mekanistik çalışması için gerekli araçlardır. Özellikle meme kanseri için, Matrigel'de kültürlenen meme epitel hücreleri, in vivo meme acinus mimarisine daha yakından benzeyen polarize sferoidler halinde organize edilir1,2,3 ,4,5,6,7,8. 3D meme epitel hücre kültürü de hücre fonksiyonunu etkiler, 3D kültürler epidermal büyüme faktörü (EG....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Meme Epitel Hücre Büyümesi ve Assay Medya
- MCF10A meme epitel hücreleri
NOT: Tümörojenik olmayan ölümsüzleştirilmiş meme epitel hücre hattı fibrokistik hastalığı olan bir hastadan türetilmiştir43. Hücreler östrojen reseptörü ifade etmez.- 20 μg/mL epidermal büyüme faktörü (EGF) hazırlamak için, 200 μg/mL EGF yapmak için 500 μL steril dH2O'da 100 μg lyophilized EGF çözün. 20 μg/mL EGF stok çözeltisi yapmak için dH 2 O'da 4,5 mL steril%0,1 BSA'ya 500 μL 200 μg/mL EGF ekleyin. Mağaza 12 aya kadar -20 °C'de 20 μg/mL EGF aliquots hazırladı.
- 500 μg/mL hidrokortizon hazırlamak için, 1 mg hidrokort....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Meme epitel hücreleri matris çözeltisi üzerinde 5-8 günlük kültürden sonra ve % 2 matris çözeltisi ile kültür ortamında 3D sferoidler halinde kendi kendine organize edilmelidir. Tümörijenik olmayan MCF10A meme epitel sferoidleri yuvarlak görünmeli ve entegre α6 sferoidin dış kenarına polarize edilmiş içi boş bir merkeze sahip olmalıdır(Şekil 1, inset içi içi boş merkezleri gösterir). Son derece invaziv MDA-MB-231 meme kanseri epitel hücreleri düzensiz sferoidler oluşturur. Küreseller yaklaşı.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, 3D mimarilerinde de endotel hücreleriyle ortak kültür için 3D mimarilerinde sferoidleri biyobaskılamak için türünün ilk örneğidir. Kritik protokol adımları meme epitel sferoidlerinin ve HUVEC ağlarının ilk oluşumunu içerir. Meme epitel sferoidlerinin beslenmesinde çok dikkatli olunmalıdır, çünkü matris çözeltisinden kolayca bozulurlar. Benzer şekilde, meme epitel sferoidleri matris çözeltisi dışında pipetlendiğinde ve ağlara karıştırıldığında dikkatli bir şekilde tedavi edilmelidir. HUVEC ağları, sırasıyla b.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu araştırma NIH 1R01HL140239-01 tarafından AMC'ye finanse edildi. Drexel Üniversitesi Hücre Görüntüleme Merkezi'ne teşekkür ederiz.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 37&derece; C inkübatör, %5 CO2 ve %95 nem | Sanyo | MCO-20AIC | Hücre inkübasyonu |
| 3D Biyo yazıcı | ısmarlama | Yok Biyobaskı | için kullanılır |
| 8 kuyulu odacıklı slaytlar | VWR, Radnor, PA | 53106-306 | sferoidleri tohumlamak için |
| 25 gauge iğne | Sigma, St. Louis, MO | Z192406-100EA | biyobaskı şırınga iğnesi |
| Mutlak etanol (200 kanıt | Sigma, St.Louis, MO | E7023-500ML | medya bileşenlerinin yeniden yapılandırılması |
| Affinipure F(ab′)2 parçalı keçi anti-fare IgG | Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA | 115006020 | ikincil blok - İmmünofloresan |
| Alexa Fluor 488 (1:200) | Thermo Fisher, Waltham, MA | A-11006 | İkincil antikor-İmmünofloresan |
| Sığır insülini | Sigma, St.Louis, MO | I-035-0.5ML | MCF10A Medya katkı maddesi |
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma, St.Louis, MO | A2153-500G | Bloke edici ajan -İmmünofloresan |
| Falcon 70 & mikro; m Hücre Süzgeci | Corning, Corning, NY | 352350 | Büyük veya kümelenmiş sferoidleri çıkarın |
| CellTracker™ Kırmızı CMTPX | Boya Thermo Fisher, Waltham, MA | C34552 | HUVEC tüpleri için ön boyama |
| Kompakt Santrifüj | Hermle-Labnet, Edison, NJ | Z206A | Hücre santrifüjleri için |
| Kolera Toksin | Sigma, St.Louis, MO | C8052-.5MG | MCF10A Medya katkı maddesi |
| Konik tüpler 15 mL | VWR, Radnor, PA | 62406-200 | Hücrelerin toplanması ve askıya alınması |
| Kontes II-FL Hücre sayacı | Thermo Fisher, Waltham, MA | AMQAF1000 | sayma hücreleri |
| Cam pipetler (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 76184-746 | hücre resüspansiyonu |
| DMEM F:12 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 11320033 | MCF10A bazal medya |
| DMEM 1X | VWR, Radnor, PA | 10-014-CV | MDA-MB-231 bazal medya |
| Endotelyal Bazal Ortam-2 (EBM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3156 | HUVEC bazal medya |
| Endotelyal Büyüme Ortamı-2 (EGM-2) | Lonza, Durham, NC | CC-3162 | Bir Bulletkit ile birlikte (büyüme faktörleri içeren) |
| Alexa Fluor & trade; 488 Phalloidin | Thermo Fisher, Waltham, MA | Etiketleme MDA-MB-231 sferoidleri | |
| Fetal Sığır serumu | Cytiva, Logan, UT | SH30071.03 | HUVEC / MDA-MB-231 medya katkı maddesi |
| Keçi serumu | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16210064 | İmmünofloresan etiketleme bileşeni |
| Glycine | Sigma, St.Louis, MO | G8898-500G | immünofloresan tampon bileşeni |
| Hoescht 33342 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 62249 | Çekirdek lekesi immünofloresan |
| At Serumu | Thermo Fisher, Waltham, MA | 16050130 | MCF10A Medya katkı maddesi |
| Hidrokortizon | Sigma, St.Louis, MO | H0888-5G | MCF10A Medya katkı maddesi |
| İnsan Umblikal Ven Endotel hücreleri (HUVEC'ler) | Hücre uygulamaları, San Diego, CA | 200-05f | Endotel hücre hatları |
| Integrin ve alfa; 6 | Millipore, Billerica, MA | MAB1378 | İmmünofloresan küresel etiketleme bileşeni |
| Canlı Ölü tahlil | Thermo Fisher, Waltham, MA | L3224 | Hücre canlılığı için canlı ve ölü hücre leke deneyi |
| LSM 700 Konfokal mikroskop | Zeiss, Thornwood, NY | Hücreleri görselleştirmek için kullanılır | |
| Matrigel - büyüme faktörü 10 mg / ml azaltıldı | VWR, Radnor, PA | 354230 | Küresel oluşumu |
| MCF10A hücreleri | ATCC | CRL-10317 | Meme hücre hattı |
| MDA-MB-231 hücreleri | ATCC | HTB-26 | Meme hücre hattı |
| Paraformaldehit | Sigma, St.Louis, MO | 158127-500G | hücre fiksatif |
| Penisilin ve streptomisin | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15140122 | MCF10A / MDA-MB-231 / HUVEC Medya katkı maddesi |
| Fosfat Tamponlu Tuzlu 1X (PBS) | Thermo Fisher, Waltham, MA | 7001106 | Tripsinizasyondan önce hücreler için yıkama tamponu |
| Fosfat tampon salin 10X | Thermo Fisher, Waltham, MA | AM9625 | immünofloresan tampon bileşeni |
| Altın antifadesini uzatın | Thermo Fisher, Waltham, MA | P36934 | immünofloresan montaj ortamı |
| Rekombinant İnsan Epidermal Büyüme Faktörü, EGF | Peprotech, Rocky Hill, NJ | AF-100-15 | MCF10A / tahlil ortamı bileşeni |
| Sodyum Azide | Sigma, St.Louis, MO | S2002-25G | immünofloresan tampon bileşeni |
| Steril şırınga (10 mL) | VWR, Radnor, PA | 75846-757 | biyobaskı işlemi |
| Doku kültürü kabı (10cm) | VWR, Radnor, PA | 25382-166 | tek katmanlı hücre kültürü |
| Triton X-100 | Sigma, St.Louis, MO | T8787-250ML | immünofloresan tampon bileşeni |
| Tripan mavisi% 0.4 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 15250061 | hücre sayacı katkı maddesi |
| Tripsin-EDTA% 0.05 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 25300054 | hücre dekolmanı |
| Tween -20 | Thermo Fisher, Waltham, MA | 85113 | immünofloresan tampon bileşeni |
| Vasküler Endotelyal Büyüme faktörü (VEGF165) | Peprotech, Rocky Hill, NJ | 100-20 | HUVEC tüp katkı maddesi |
| Volocity 6.3 hücre görüntüleme yazılımı | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Z yığın sıkıştırıcı |
Kaynaklar
- Barcellos-Hoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. Functional differentiation and alveolar morphogenesis of primary mammary cultures on reconstituted basement membrane. Development. 105 (2), 223-235 (1989).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
