Aşağı Akış İmmünasyon Analizleri için Fare Seminifer Epitel Döngüsünün Belirli Aşamalarının Transilluminasyon Destekli Diseksiyonu

Özet

Bu protokol, seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden yetişkin fare seminifer tübüllerinin segmentlerinin transilluminasyon destekli mikroseksiyonunu ve buradaki hücre tiplerini ve daha sonra kabak preparatlarının ve bozulmamış tübül segmentlerinin immünostainasyonunu açıklar.

Özet

Spermatogenez, sonuçta vücudun en farklı hücre türlerinden biri olan sperme yol açan benzersiz bir farklılaşma sürecidir. Mikrop hücrelerinin farklılaşması, 4 ila 5 nesil mikrop hücresine aynı anda ev sahipliği yapan ve gelişimlerini koordine eden ve senkronize eden somatik Sertoli hücrelerinin sitoplazmik ceplerinde gerçekleşir. Bu nedenle, bir kesit içindeki mikrop hücre tiplerinin bileşimi sabittir ve bu hücre ilişkileri seminifer epitel döngüsünün aşamaları (I–XII) olarak da bilinir. Daha da önemlisi, aşamalar, transilüminasyon ile ortaya çıkan diferansiyel ışık emilimi / saçılma özelliklerine ve aşamaların tübül boyunca birbirini sayısal bir sırada takip etmesine bağlı olarak bozulmamış seminifer tübüllerden de tanımlanabilir. Bu makalede, fare seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden seminifer tübül segmentlerinin izolasyonu için transilluminasyon destekli bir mikrodispeksiyon yöntemi açıklanmaktadır. Seminifer tübüllerin ışık emme deseni önce diseksiyon mikroskobu altında incelenir ve daha sonra belirli aşamaları temsil eden tübüle segmentleri kesilir ve aşağı akış uygulamaları için kullanılır. Burada, aşamaya özgü kabak preparatları ve sağlam tübül segmentleri için immünostaining protokollerini açıklıyoruz. Bu yöntem, bir araştırmacının spermatogenezin belirli aşamalarında gerçekleşen biyolojik olaylara odaklanmasını sağlar, böylece spermatogenez ve alttaki moleküler mekanizmaların gelişimsel, toksikolojik ve sitolojik çalışmaları için benzersiz bir araç sağlar.

Giriş

Erkek mikrop hücrelerinin diploid spermatogonia'dan olgun haploid spermatozoa, yanispermatogenez'e farklılaşması, cinsel olarak olgunlaşmış bir bireyin testislerinde seminifer tübüllerin epitelinde gerçekleşen karmaşık bir süreçtir¹. A1 spermatogonia'nın mitotik torunları, farklılaşmaya bağlı popülasyonu genişletmek için önce beş kez bölünür, daha sonra sonuçta haploid spermatidlere yol açan spermatositler olarak meyoza girerler. Yuvarlak spermatidlerin spermatozoa, yanispermiogenez olarak farklılaştırılması, nükleer sıkıştırma ve akrozom ve flagellum gibi sperme özgü yapıların inşası da dahil olmak üzere hücresel morfolojide karmaşık değişiklikler içerir. Farede, spermatogenezin tüm sürecinin tamamlanması 35 gün sürer^2,3.

Herhangi bir lokalde, seminifer epitel, farklılaşan mikrop hücrelerinin beş kohortunun yanı sıra germline kök / progenitör hücreler ve somatik Sertoli hücreleri^1'ekadar barındırır. Farklılaşan mikrop hücreleri, bileşimi öngörülebilir olan eşmerkezli katmanlar oluşturur ve belirli bir gelişim adımındaki haploid hücreler her zaman belirli spermatosit türleri ve spermatogonia^4,5ile ilişkilendirilir. Bu nedenle, bir tübüllerin herhangi bir kesiti, sabit bir bileşimin mikrop hücrelerinin kohortlarını barındırır. Bu spesifik hücre ilişkileri seminifer epitelyumun evreleri olarak tanımlanır. Kendi başına aşamalar durgun kontrol noktası benzeri durumlar sunmaz, ancak mikrop hücre kohortlarının farklılaşması senkron 1 ,^2,6'dailerledikçe sürekli olarak gelişir. Farelerde, seminifer tübülünün boyuna ekseni boyunca segmental bir şekilde düzenlenmiş¹² aşama (I-XII) 2 vardır ve birbirlerini mantıksal bir düzende takip ederler, böylece seminifer epitel dalgasını veya spermatojenik dalga 7^,8,9 (Şekil 1)oluştururlar. Spermatogenezin tamamlanması dört döngü sürer ve herhangi bir seminifer tübül kesiti içindeki farklılaşan mikrop hücrelerinin hiyerarşik katmanları veya kohortları zamansal olarak birbirinden bir seminifer döngüsüdir. Döngünün uzunluğu türlere bağlıdır ve farede her döngü 8,6 gün^{sürer 10}.

Aşamalar histolojik testis bölümleri⁵ (Şekil 1 ve Şekil 2)üzerinde seminifer epitel hücresel bileşimi ve organizasyonu temelinde tanımlanabilir. Bununla birlikte, histolojik analiz zahmetli, zaman alıcıdır ve sabitleme ve lekeleme gerektirir ve bu nedenle canlı dokuya uygulanamaz. Daha da önemlisi, döngünün farklı aşamaları tarafından sergilenen farklı ışık emme/saçılma desenlerinden yararlanılarak diseksiyon mikroskobu altında canlı doku üzerinde de evreleme yapılabilir (Şekil 2). Her aşamanın ışığı emme ve dağıtma yeteneği, herhangi bir aşama konakçısının geç meyotik spermatidlerin kromatin yoğuşma seviyesine ve bu hücrelerin^{demetler halinde paketlenmesine}göredir 7^,11. Spermatid farklılaşması, yanispermiogenez, 8 adım yuvarlak spermatid (adım 1-8) ve 8 adım spermatid (adım 9-16) farklılaşması (Şekil 1)dahil olmak üzere 16 gelişimsel adıma ayrılmıştır. Adım 9-11 uzamış spermatidler (aşama IX-XI) sadece düşük miktarda kromatin yoğuşması gösterir ve bu da düşük miktarda ışığın emilmesine neden olur. Kromatin yoğuşması adım 11 spermatidlerde (aşama XI) başlar ve adım 15-16 uzun spermatidler (aşama IV-VIII) tamamen yoğun kromatin içerir ve bu nedenle maksimal ışık emilimi sergiler (Şekil 3). Kromatin sperm kafasına sıkıca paketlenmesi için yoğunlaştırılmalıdır. Işık emilim paternine katkıda bulunan ek faktörler, epitel içindeki spermatidlerin uzama yeridir (bazal ve apikal) ve uzun spermatidlerin bundling 'idir (aşama II-V'de telaffuz edilir)¹¹ (Şekil 3). Demetler, tübüllerin ortasında ve bir diseksiyon mikroskobu altında kenarlarda çizgiler olarak görülür ve kromatin ne kadar yoğunlaştıysa, nokta / şerit¹¹daha koyudur.

Bu makalede, seminifer epitel döngüsünün belirli aşamalarını temsil eden seminifer tübül segmentlerinin izolasyonu için transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon yönteminin kullanımı açıklanmaktadır. İzole edildikten sonra, aşamalı tübül segmentleri biyokimyasal RNA ve protein analizleri^{12 , 13,14}, 15^,akış sitometrisi^16, ex vivo tübül kültürü¹⁷ve immünostaining¹⁸ dahil olmak üzere çeşitli aşağı akış analizlerine tabi tutulabilir. Burada ayrıca, canlı hücre morfolojik analizi ve sonraki immünostaining için sahnelenmiş tübül segmentlerinin ezilmiş monolayerlerini ve tübül segmentlerinin tam montajlı immünostaininglerini hazırlamak için ayrıntılı aşağı akış protokolleri sunuyoruz. Şekil 4'teaçıklanan özetle iş akışı.

Transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon yöntemi, aşamaların senkronize hücresel bileşimi sayesinde mikrop hücrelerinin belirli farklılaşma adımlarında doğru tanımlanmasını ve izolasyonunu sağlar. Daha da önemlisi, spermatogenez sırasında evreye bağlı olayların canlı doku üzerinde incelenmesini sağlar. Spermatogenez için ölçeklenebilir in vitro modellerin eksikliği göz önüne alındığında, bu yöntem aynı zamanda sahneye özgü tübül segmentleri üzerinde hedeflenen kısa vadeli gelişimsel ve toksikolojik çalışmalara izin vermenin benzersiz bir avantajına sahiptir ex vivo^12,17. Burada fare için yöntemi açıklarken, aynı prosedür sıçan 4 , 7^{,15 , 19,20}gibiseminifer epitel aşamalarının boyuna ve segmental düzenlemesine sahip herhangi bir^memelitürüne uygulanabilir.

Protokol

Laboratuvar farelerinin bakımı ve tüm hayvan deneyleri Türkü Üniversitesi'nde laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına yönelik ilgili kılavuz ve yönetmeliklere uygun olarak yapılmıştır.

1. Mikrodisseksiyon için seminifer tübüllerin hazırlanması

1. Co 2 boğulması ve ardından servikal çıkık yoluyla yetişkin bir erkek fareyi (≥8 haftalık, suş ve yaşa bağlı olarak testis_80-120 mg) kurban edin.
   NOT: Fare cinsel olarak olgun ve tercihen en az 8 haftalık olmalıdır. Yavru farelerin transilluminasyon deseni yetişkinden farklıdır, çünkü seminifer epitel dalgası henüz tam olarak belirlenmemiştir ve ilk spermatogenez dalgasının zamanlaması^{21,22 'dir.} <4 haftalık erkek farelerde uzun süreli spermatid eksikliği, transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon için kullanımlarını engeller. Normal spermatogenez içeren tüm fare suşları kullanılabilir.
2. Ventral karına% 70 etanol püskürtün. Abdominopelvic boşluğunu steril makas kullanarak açın, V şeklinde bir açıklık açın.
3. Epididimal yağ yastığını steril epekslerle çekerek testisleri bulun, makas kullanarak parçalara ayırın ve PBS içeren steril 100 mm Petri kabına yerleştirin.
   NOT: Steriliteyi korumak için tüm labware ve cerrahi aletlerin steril olduğundan emin olun.
4. İnce uçlu makas kullanarak testisleri kapsülleyen kalın lifli levha olan tunica albuginea'dabir yarık keserek testislerin başını koparın. Sonra bir çift yaban arısı kullanarak tunicayı yırtın. Tübülleri tokalarla bastırarak dışarı çıkmaya zorlayın ve tunicayı atın.
   NOT: Tunica atılırken, arteri testislerinin tunica ile birlikte çıkarılması bazı aşağı akış uygulamaları için yararlı olabilir. Seminifer tübüllere zarar vermekten kaçının.
5. Seminifer tübülleri yeni bir Petri kabına taşıyın ve Petri kabının altını kaplayacak kadar steril PBS dökün. Daha sonra, tübülleri yavaşça ayırın, ancak tübüllere zarar vermekten kaçının.
   NOT: Çok fazla mekanik stres transilluminasyon paternini etkileyecek ve dokunun canlılığını ve hücresel mimarisini etkileyecektir. Tübüller ayrıca bu noktadan itibaren tüm montajlı immünostainingler için evreleme olmadan işlenebilir (3B). Bazen SALL4, c-KIT ve DNMT3A^18,23gibi spermatogonianın ayırt edilmesinde ifade edilen proteinlere karşı antikorları dahil ederek aşamayı retrospektif olarak tanımlamak yeterlidir. Spermatogonia yoğunluğu nispeten güvenilir bir aşama göstergesidir (Şekil 2).

2. Transilluminasyon destekli mikrodiseksiyon

1. Petri kabını sahneye bantlayarak sıkıca bir diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
   NOT: Toplanan kademeli seminifer tübül segmentlerinin karıştırılmasına neden olabilecek hareketini önlemek için Petri kabını iyi bantlamak önemlidir.
2. Odak altındaki seminifer tübüllerin ışık emme desenini ortaya çıkarmak için, numunenin aşağıdan aydınlatıldığından ve ışığın numuneden geçtiğinden, yanitransilüme olduğundan emin olun.
   NOT: Emilen / saçılan ışık miktarı, uzun spermatidlerdeki kromatin yoğuşma seviyesine ve seminifer tübül içindeki tomurcuklanmalarına göredir: ne kadar yoğun olursa, o kadar fazla ışık emilir, yanidaha koyu görünür.
3. İnce tokalar kullanarak tübül demetlerini dikkatlice hareket ettirerek Şekil 2, Şekil 5A ve Şekil S1'de açıklandığı gibi farklı aşamaların ışık emme desenini tanıyın.
   NOT: Aşamalar her zaman birbirini mantıksal bir düzende takip ederek seminifer epitel dalgasını oluşturur. Bununla birlikte, spermatojenik dalganın yönünün zaman zaman tersine döndüğünü ve daha sonra tekrar geri döndüğünü bilmek önemlidir (modülasyonlar olarak da bilinir^4,9), bazen prosedürü zorlaştırır. Ayrıca, her aşamanın uzunluğu, kaç mm tübül açısından önemli ölçüde değişir.
4. Kancalı uçlu önseçimleri kullanarak ilgi borularını dikkatlice kaldırın ve ardından mikrodiseksiyon makası kullanarak uygun uzunlukta bir segment kesin (bkz. Ek Video 1). Yabanatı ucundaki bir kanca, bir tübül kaldırmayı ve tutmayı kolaylaştırır ve sıkmaktan kaçınmaya yardımcı olur.
   NOT: Kesilecek parçaların uzunluğu aşağı akış uygulamalarına bağlıdır. Protein veya RNA analizi^{12 , 13}(II–V, VII–VIII ve IX–XI, Şekil 5B)için belirli bir aşamanın havuzlu tübüle parçalarının toplanması için uzunluk tipik olarak 2-5 mm'dir. Standart fenol-kloroform ekstraksiyonu kullanıldığında, 1 mm tübülden yaklaşık 200 ng RNA elde edilebilir. Kademeli tübül parçalarının tam montajlı boyanması için, parçaların uzunluğu >5 mm olmalıdır. Kabak preparatları için segmentlerin uzunluğu 1-2 mm'yi geçmemelidir, çünkü segmentin ortasındaki hücreler çok uzunsa çıkamayabilir. Boru uzunluğunun doğru ölçümü için Petri kabının altında bir mm ölçek kullanın.

3. Farklı preparatların immünostaining

1. Kabak hazırlama: aşama doğrulaması ve immünostaining
   NOT: Aşamaya özgü tübül parçaları, faz kontrastlı mikroskopi ve sonraki immünostaining ile canlı hücrelerin morfolojik analizini yapmak için bir kapak camı ile mikroskop kaydırağı üzerinde ezilebilir. Transillumination destekli mikrodiseksiyon yöntemi ile tanışırken aşamaları doğrulamak için yeni başlayanların bu yaklaşımı kullanması önerilir.
   1. Segmenti pipet kullanarak 10 μL hacimde toplayın ve mikroskop slaydına taşıyın.
   2. Tübül üzerine dikkatlice bir kapak camı (20 mm x 20 mm) yerleştirerek tübülleri ezin. Sonuç olarak, hücreler tübülden akacak ve canlı hücreli bir monolayer oluşturacaktır. Hücrelerin yayılmasını kolaylaştırmak için kapak camının kenarına bir filtre kağıdı yerleştirin. Hücreleri hayatta tutmak için çok fazla ezmekten kaçının.
   3. Mikroskop altında yayılan hücreyi izleyin. Mevcut hücre tiplerini inceleyerek sahne tanımayı doğrulamak için 40x hedefinde bir faz kontrastı mikroskobu kullanın (Şekil 2, Şekil S2).
   4. Hücreler tübüllerin her iki ucundan yuvarlak bir monolayer oluşturmak için yayıldıktan sonra, kaydırağı forsepsle tutarken sıvı azot içeren bir kaba batırın. 10 sn su altında tutun. Alternatif olarak, kaydırağı donmak için kuru bir buz plakasına yerleştirin.
   5. Kapak camını neşter kullanarak kapatarak çıkarın.
   6. Gecikmeden, sabitleme işlemine devam edin ve slaydı 2-5 dakika boyunca% 90 etanol içeren bir kaba hızlı bir şekilde yerleştirin.
      NOT: % 90 etanol'e yerleştirmeden önce kabak hazırlığının çözülmediğinden emin olun. Aseton gibi diğer fiksatifler de 10 dakika boyunca kullanılabilir.
   7. Hava kurutun ve oda sıcaklığında (RT) (bazı günlere kadar) veya -80 °C'de (uzun süreli) saklayın.
   8. İmmün yetinme için, örnekleri RT'de 10 dakika boyunca% 4 paraformaldehitte (PFA) düzeltin.
   9. PBS'de durulayın ve PBS'de %0,1 Triton X-100 ile 5 dakika geçirgenlik sağlar.
   10. PBS'de durulayın ve her kabak örneğinin etrafına bir gres halkası çizin.
   11. Gres halkasının içine PBS'de (PBST) %0,1 Araya %10 BSA (sığır serum albümini) 50–100 μL ekleyin ve RT'de 30 dakika boyunca örnekleri engelleyin.
   12. BSA çözeltisini çıkarın ve PBST'de % 10 BSA'da seyreltilmiş birincil antikorla RT'de 1 saat boyunca kuluçkaya yatırın.
   13. PBST ile 5 dakika boyunca 3x yıkayın.
   14. PBST'de %10 BSA'da seyreltilmiş ikincil bir antikor ile kuluçkaya yatır.
       NOT: Acrosomes leke için, örnekler rhodamin etiketli Yer fıstığı agglutinin antikoru (PNA, 1:1000) ile pbst%10 BSA'da 1 saat rt(Şekil S3)yerine spesifik primer ve sekonder antikorlar yerine inkübe edilebilir.
   15. PBST ile her biri 5 dakika boyunca 3x yıkayın, PBS ile durulayın ve DAPI içeren bir montajcı ile monte edin.
2. Seminifer tübüllerin tüm montajlı immünostainingi
   NOT: Aşağıdaki protokol, aşamalı (adım 2.4'ten itibaren) tübül segmentleri için tam montajlı boyamayı açıklar. Bir araştırmacı evreleme yapmadan tam montajlı boyama yapmak istiyorsa (adım 1.5'ten itibaren), 3.2.1 ve 3.2.7'deki notlara dikkat edin.
   1. Pipet kullanarak, tübül parçalarını (adım 2.4'ten itibaren) buz gibi PBS'deki 15 mL konik bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tortulanmalarını sağlar.
      NOT: 1,5.'den itibaren etiketlenmemiş tübüller kullanıyorsanız, bir Petri kabındaki tübülleri birkaç kez eğik bir tabağa borulayarak ayırın. Kesik uçlu 1 mL pipet kullanın. Bu adım, dokunun yapısını açmak için tasarlanmıştır. Ancak, tübüllere zarar verebileceğinden çok fazla pipetlemeden kaçının. Tübüllerin çökeltilmesi birkaç saniye sürecektir. Küçük tübül parçaları, interstisyel hücreler ve hücre kalıntıları süpernatantta kalır.
   2. Borulama veya aspiratör ile süpernatant (SN) dikkatlice çıkarın. 10 mL buz gibi PBS ekleyin ve ters çevrilerek karıştırın.
   3. Tortuya izin verin ve daha önce olduğu gibi SN'yi çıkarın.
   4. %4 PFA'nın 5 mL'sini ekleyin ve +4 °C'de dönen bir masaya (20-30 rpm) 5 saat sabitleyin.
      NOT: Fiksasyon süresi, ilgi çekici proteinlere ve bunların hücre altı lokalizasyonuna bağlıdır. Nükleer ve sitoplazmik proteinler için, 2 saat fiksasyon tipik olarak yeterlidir, ancak GFRα1 (GDNF aile reseptörü alfa 1; Şekil 6A,B), 6 saate kadar daha uzun bir fiksasyondan yararlanın.
   5. Tortuya izin verin, SN'yi (PFA) daha önce olduğu gibi çıkarın ve 10 mL PBS ekleyerek ve tüpü ters çevirerek kısa bir süre durulayın.
   6. Tortuya izin verin, SN'yi daha önce olduğu gibi çıkarın ve PBS yıkama adımını +4 °C'de dönen bir masada her biri en az 10 dakika boyunca üç kez tekrarlayın ve boyamaya devam edin veya +4 °C'de saklayın.
      NOT: Çalışma koşulları sterilse ve temizlenirse numuneler en az birkaç hafta saklanabilir ve kullanılabilir. Alternatif olarak, +4 °C'de depolamadan önce tübüllerin korunmasına yardımcı olmak için% 2 stok çözeltisinden% 0.02 (w / v) nihai konsantrasyona Sodyum Azide ekleyin.
   7. 1 mL pipet kullanarak, 10-20 sabit boru segmentini 2 mL yuvarlak tabanlı bir tüpe taşıyın. Tortuya izin verin ve SN'yi çıkarın.
      NOT: Sahnelendirilmemiş uzun tübüllerle çalışıyorsanız, tübülleri bir Petri kabına dökün ve mikrodiseksiyon makası ve yaklaşık 5-20 mm'lik kesme parçaları kullanarak. Boyama işlemi sırasında çok uzun segmentler karışırken, çok kısa segmentler kolayca kaybolur.
   8. PBS'de (PBSX) %0,3 Triton X-100'e %2 BSA + %10 FBS (fetal sığır serumu) 1 mL ekleyin. RT'de dönen bir masada (20-30 rpm) en az 1 saat boyunca bloklayın.
   9. 1 mL PBSX ile durulayın, pipetleme ile SN'yi çıkarın ve PBSX'te % 1 BSA'da seyreltilmiş 250 μL birincil antikor ekleyin (1:100–1:2000 seyreltme). RT'de 2 saat veya dönen bir masada (20-30 rpm) +4 °C'de gece boyunca kuluçkaya yatırın.
   10. Antikor çözeltisini pipetleme ile çıkarın ve tübülleri yukarıdaki gibi 1 mL PBSX ile durulayın. PBSX'te RT'de dönen bir masada (20-30 rpm) 1 saat boyunca üç kez yıkayın.
       NOT: Bu ilk yıkamadan sonra numune gerekirse gece boyunca +4 °C'de bırakılabilir.
   11. SN'yi çıkarın ve PBSX'te % 1 BSA'da seyreltilmiş 250 μL ikincil antikor ekleyin (tipik olarak floresan etiketli bir antikorun 1:500 seyreltilmesi). Folyoya örtün ve 1 saat boyunca RT'de dönen bir masada (20-30 rpm) kuluçkaya yatırın.
   12. 3.2.10'ı tekrarlayın.
   13. Son olarak SN'yi çıkarın ve tübülleri bir mikroskop slaydına dökün. Jel yükleme uçlarını kullanarak tübülleri doğrusal şeritler halinde hafifçe ayırın ve düzenleyin. Fazla tamponu boşaltın ve montaj ortamı ve kapak kılıfı ekleyin.
       NOT: Tübülleri düzenlerken kurutmaktan kaçının. Çekirdeklerin DAPI ile karşı lekelenmesi çoğu durumda gerekli değildir. Numunenin kurumasını ve bozulmasını önlemek için kapak kapağının kenarını oje ile kapatın. Slaytlar görüntülemeden önce +4 °C'de 1-2 hafta saklanabilir.

Sonuçlar

Fare seminifer tübüllerinin başarılı bir transilluminasyon destekli evrelemesi ve mikro dezenfeksiyonu, öncelikle uygun aydınlatma koşullarını ve uygun bir diseksiyon mikroskobu ve her aşamayı karakterize eden belirli özellikleri tanıma yeteneğine bağlıdır. Vii-VIII aşamaları homojen bir şekilde karanlık görünür, çünkü epitelin apikal yüzeyine hizalanmış çok sayıda tam yoğunlaştırılmış uzun spermatid içerirler (Şekil 5A ve Şekil S1). Olgun spermatozoa spermiasyonda lümene salındıktan sonra, tübül epitelde yoğunlaştırılmış uzun spermatidlerin bulunmaması nedeniyle IX-XI aşamalarında çok solgun görünür. Transilluminated tübüllerde tanımlanması en kolay özellik spermiasyon noktasıdır (Şekil 5A ve Şekil S1'dekiyıldız işareti), yani karanlık bölgeden (VII-VIII) soluk bölgeye (IX–XI) ani geçiştir. Soluk bölgeyi zayıf nokta bölgesi (XII-I) takip ediyor. Sivilceli görünüm, demetler halinde yoğunlaştırılmış kromatin ile uzun spermatidlerin organizasyonundan kaynaklanır. Demetler aşağıdaki güçlü nokta bölgesinde (II-V) çok belirgin hale gelir. Ayrıca, spermatid demetleri bazal laminaya yakın bulunan Sertoli hücre çekirdeklerine doğru göç eder, bu da transilüme edildiğinde aşama II-V tübülünün çizgili görünümü olarak yansır (Şekil 2, Şekil 5A,B ve Şekil S1). Demetler sonunda vi aşamasında dağılır ve yoğunlaşan uzun spermatidler, viii aşamasında epitelden salınacak lümene yakın hareket eder.

Tübül segmentinin tam aşaması, kabak preparatlarının faz kontrastlı mikroskopisi ile doğru bir şekilde doğrulanabilir (Şekil 2 ve Şekil S2). Kabak preparatlarındaki spesifik aşamalar, adım 1-8 yuvarlak spermatidlerin akrozomal gelişimi, uzun spermatidlerde kromatin yoğuşma durumu ve spermatid demetlerinin varlığı¹⁶ (Şekil 3 ve Şekil S2)temelinde kabul edilir. Ayrıca, morfolojik özelliklerine dayanarak tanınabilen B tipi spermatogonia ve leptoten veya zigoten spermatositler gibi daha erken hücre tiplerinin varlığı, evre tanımayı desteklemek için kullanılabilir. Pachytene spermatosit çekirdeğinin büyüklüğü, vi evre civarında artar ve bu da evrelemede ek yardım sağlayabilir.

Aşamalı kabak preparatları, immünostaining kullanılarak seminifer epitelde ilgi çekici proteinlerin ekspresyonunu ve lokalizasyonunu incelemek için kullanılabilir. Bu, her aşamada iyi tanımlanmış hücresel bileşim nedeniyle hücre tipine özgü ifadenin çok doğru analizini sağlar. Evreye özgü ifade, yuvarlak spermatid farklılaşmasının farklı adımlarının görselleştirilmesini sağlayan akrozomun(örneğinPNA ile) birlikte boyanmasıyla daha da arttırılabilir. Çeşitli aşamalarda PNA lekeli akrozomların temsili görüntüleri Şekil S3 'te verilmiştir. Akrozomal lekeleme, aşamayı geriye dönük olarak tanımlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, transilluminasyon destekli evreleme, istenmeyen parçaları gelişigüzel bir şekilde kullanmaktansa istenen aşamayı bulmak için oldukça kolay ve hızlı bir yöntemdir.

Seminifer tübül bütün montajlı boyama tipik olarak tübüler tarafta (spermatogonia, preleptotene spermatositler ve Sertoli hücreleri) seminifer epitelin bodrum zarı ile temas eden hücre tiplerini incelemek için kullanılır; Şekil 6A,B) veya geçiş tarafı (peritubuler miyoid hücreler ve peritubuler makrofajlar); Şekil 6C ve Şekil S4A)²⁴. Bununla birlikte, yöntem, kan testis bariyeri (Espin, Şekil S4B)veya postmeiotik mikrop hücreleri (akrozom belirteci PNA, Şekil S4C)gibi epitelde daha derinde bulunan hücreleri veya yapıları incelemek için de kullanılabilir. Etiketlenmemiş tübül segmentleri kullanıyorsanız, spermatogonia (A1, A2, A3, A4, In ve B; toplu olarak A_diff)ayırt edici olarak ifade edilen bir proteine karşı antikor kullanarak belirli bir aşamayı retrospektif olarak tahmin etmek mümkündür (Şekil 2). Evreleme daha sonra, spermatojenik farklılaşmanın ilk döngüsü¹sırasında sahneye bağlı bir şekilde altı mitotik bölünmeye maruz kalan bir fark yoğunluğuna dayanır, bu nedenle her bölümden sonra syncytia'daki A_diff spermatogonia sayısını iki katına çıkarır^1,25. Bununla birlikte, geriye dönük evreleme, transilluminasyon destekli hazırlamadan daha az doğrudur, çünkü farklı A_dif nesilleri için belirli bir belirteç yoktur ve A_fark yoğunluğunun değerlendirilmesi hataya eğilimli olabilir.

Şekil 1: Fare spermatogenezinin evrelemesi için seminifer epitel döngüsü haritası. Dikey sütunlar, seminifer epitel döngüsünün farklı aşamalarında hücre ilişkilerini gösterir (Roma rakamları I–XII ile işaretlenmiştir). En olgunlaşmamış mikrop hücreleri altta, en farklılaşmış hücreler ise en üsttedir. Mikrop hücre farklılaşmasındaki ilerlemeyi takip etmek için soldan sağa ve aşağıdan yukarıya doğru hareket etmek zorundadır. Seminifer epitel döngüsü, birbirini sayısal olarak takip eden eksiksiz bir aşama serisidir. _Und, farklılaşmamış spermatogonia; A1–4, tip A1–A4 spermatogonia; in, ara spermatogonia; B, B tipi spermatogonia; Pl, preleptoten spermatositler; L, leptoten spermatositler; Z, zigoten spermatositler; P, pachytene spermatositler; D, diploten spermatositler; 2°, sekonder spermatositler artı meiotik bölünmeler. Arap rakamları 1-16 meiotik spermatid olgunlaşma sonrası basamakları (spermiogenezis) ifade eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Fare seminifer epitel döngüsünün aşamalarında hücre ilişkileri. Seminifer epitel döngüsünün aşamaları birbirini mantıksal bir düzende takip eder ve böylece seminifer bir tübülünün boyuna ekseni boyunca spermatojenik dalgayı oluşturur. Üst panel, mikrop hücre ilişkilerini farklı aşamalarda ve hücre tiplerinin seminifer epiteldeki Sertoli hücrelerinin sitoplazmik cepleri (açık gri) içindeki konumunu göstermektedir. Seminifer tübül çizimi, soluk, zayıf nokta, güçlü nokta ve karanlık bölgelerin spermatojenik dalgasını ve spesifik transilluminasyon kalıplarını görselleştirir. Belirtilen her aşamadan, kabak preparatlarının temsili canlı hücre faz kontrast görüntüleri ve periyodik asit-Schiff (PAS) lekeli testis kesitleri gösterilir. Alt iki panel, transilluminasyondan sonra seminifer tübül segmentlerini gösterir (üstte) veya SALL4 (kırmızı, pan-spermatogonial belirteç) ve DNMT3A'ya (yeşil, bir_fark işaretleyicisi) karşı antikorlarla (altta) lekelenme. IX-XI, XII ve VI aşamaları için transilluminasyon desenleri kutulu alanlarla vurgulanır. Seminifer döngüsünün (yaklaşık) aşamasını tanımlamak için hem ışık emme deseni (üstte) hem de DNMT3A pozitif farklılaşan spermatogonia (altta) yoğunluğu kullanılabilir. Ardışık A_dif nesilleri A1-A4 tipi, orta (in) ve B tipi spermatogonia olarak adlandırılır. Her birinin bölünmesi spermatogoniyel hücre yoğunluğunun iki katına çıkmasına neden olur. Seminifer epitelin bodrum zarındaki en yüksek hücre yoğunluğu, meiotik preleptoten spermatositler (Pl) gözlendiğinde VI–VIII evrelerinde görülür. Ölçek çubukları: kabak hazırlığı 10 μm, diğerleri 50μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Spermiogenez adımları. Spermiogenezin farklı adımlarında spermatidlerin ayırt edici özellikleri. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Bu çalışmanın iş akışı. Transillumination deseni yetişkin (>8 haftalık) bir farede tam olarak oluşturulmuştur. Fareyi feda edin ve gecikmeden testis diseksiyonu ve kafa kesme ile devam edin. Tübülleri bir Petri kabında yavaşça çekin. Tüm montajlı lekeler için tübülleri sabitlenin veya transilluminasyona devam edin. Transillumination 1) kabak preparatları (kalite kontrolü veya immünostaining için) için belirli aşamaların kısa tübüle segmentlerini kesin veya 2) RNA ve proteomik analizler, doku kültürü veya tam montajlı boyamalar için sahne havuzlarını toplamak için daha uzun segmentler kesin. Kısa tübül parçalarını 10 μL PBS hacminde mikroskop slaydına aktarın. Hücreleri zorlamak ve canlı bir hücre monolayer oluşturmak için segmente bir kapak kayması yerleştirin. Mikroskop altında hücre tiplerini gözlemleyin, sonra düzeltin ve lekeleyin. WMS, bütün montajlı boyama. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 5: Transilluminasyon mikroskopisi altında görüldüğü gibi yetişkin bir farenin seminifer tübül. (A) Transilluminasyon altında görüldüğü gibi seminifer epitel dalgasını gösteren uzun bir seminifer tübül segmenti. Spermatidlerde kromatin sıkışması ve epitel içindeki lokalizasyonlarına göre dört farklı bölge tanımlanabilir: karanlık bölge (aşama VII–VIII), soluk bölge (aşama IX-XI), zayıf nokta bölgesi (aşama XII-I) ve güçlü nokta bölgesi (aşama II-VI). Yıldız, spermiasyon noktası. Oklar, zayıf nokta bölgesinde tübül üzerindeki mekanik stres nedeniyle soluk bir görünüme sahip iki kısa segmenti gösterir. Ölçek çubuğu: 500 μm. 1–5 iç kesimleri, seçilen tübül segmentlerinden daha yüksek büyütmelerdir. (B) II–V (güçlü nokta bölgesi), VII–VIII (karanlık bölge) ve IX–XI (soluk bölge) aşamalarını temsil eden seminifer tübüllerin havuza alınan parçaları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 6: Spermatogonial, Sertoli hücre ve peritubuler makrofaj belirteçleri kullanılarak tüm montajlı immünostainingler. (A) GFRα1 (kırmızı), SALL4 (yeşil) ve DNMT3B (mavi) karşı antikorlarla evre XI–II'yi temsil eden bir segment için tam montajlı boyama. Boyama üç farklı spermatogonia popülasyonunu ortaya koymaktadır: tekil olarak izole edilmiş (A_s)veya eşleştirilmiş (A_pr)farklılaşmamış kök spermatogonia (GFRα1⁺/ SALL4⁺/ DNMT3B^-; beyaz noktalı alanlar), kısa senktial (burada 4 hizalanmış hücre; A_al4) progenitör spermatogonia (GFRα1^-/SALL4⁺/DNMT3B^-; sarı noktalı alanlar) ve farklılaşan spermatogonia (GFRα1^-/SALL4⁺/DNMT3B⁺). SALL4⁺/DNMT3B⁺ hücreler A3–A4 spermatogonia tiplidir. (B) GFRα1 (kırmızı), USF1 (yeşil) ve SOX9 (mavi) karşı antikorlar ile tüm mount seminiferöz tübül boyama. GFRα1 spermatogonia'nın kök alt kümesini lekeler. USF1 hem spermatogonia hem de SOX9⁺ Sertoli hücreleri ile ifade edilir. (C) Yetişkin farelerde peritubuler makrofajlar hem F4/80 (kırmızı) hem de MHCII (mavi) için pozitiftir. DAPI DNA lekeleri (yeşil). Parlak büyük çekirdekler peritubular miyoid hücre çekirdekleridir. Ölçek çubukları: 50 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil S1: Transilluminasyon altında görüldüğü gibi seminifer epitel dalgasını gösteren uzun bir seminifer tübül segmenti. Spermatidlerde kromatin sıkışması ve epitel içindeki lokalizasyonlarına göre dört farklı bölge tanımlanabilir: zayıf nokta bölgesi (aşama XII-I), güçlü nokta bölgesi (aşama II-VI), karanlık bölge (aşama VII-VIII) ve soluk bölge (aşama IX-XI). Spermiasyon noktası (yıldız işareti), karanlık bölge aniden soluk bölgeye geçerken tanınabilir. Ölçek çubuğu: 500 μm. 1–4 iç kesimleri, seçilen tübül segmentlerinden daha yüksek büyütmelerdir. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S2: Seminifer epitel döngüsünün farklı aşamalarındaki canlı hücreli monolayerlerin faz kontrastlı mikroskopisi. (A) Evre I. Adım 1 yuvarlak spermatidler hala akrozomal yapıdan yoksundur. Ayırt edici tek bir kromomer (beyaz oklar) ile küçük bir yuvarlak çekirdek (kırmızı daireler) ile karakterize edilirler. Kromatoid gövde sitoplazmada nükleer membranla (mavi oklar) yakın temas halinde koyu bir granül olarak görülebilir. Sertoli hücre çekirdeği (beyaz daire) üç karanlık odak içerir: iki uydu kromosente sahip büyük bir çekirdek. Sertoli hücreleri kabak preparatlarında görülmez, ancak zaman zaman mikrop hücreleriyle birlikte tübülden akarlar. (B) Aşama II–IV. 4. adım yuvarlak spermatidlerde (kırmızı daireler), akrozomal yapı (kırmızı oklar) nükleer zarfa bağlı beyaz hafif düzleştirilmiş bir veziklin olarak görünür. Uzun spermatidler demetler oluşturur ve sperm kuyruğunun orta parçasında mitokondriyal kılım varlığını gösteren kalın bir flagelluma (beyaz oklar) sahiptir. Pachytene spermatositlerinin (PSpc) çekirdekleri yuvarlak spermatidlerden yaklaşık iki kat daha büyüktür ve çekirdeğe dağılmış koyu kromatin bölgeleri ile karakterizedir. (C) Aşama V–VI. 5-6. adımda yuvarlak spermatidler (kırmızı daire), akrozom daha da düzleştirilir ve çekirdeğe (kırmızı oklar) yayılır. Nükleer zarfın akroza bakan bölgesi, akrozomal membran ile nükleer membran arasında protein bakımından zengin bir plaka olan akroplaxome varlığı nedeniyle karanlık görünür. Uzun spermatidler demetlerden (beyaz oklar) salınır. Pachytene spermatositler (PSpc) epitelde sıklıkla görülür. (D) Sahne VII-VIII. Beyaz gölgeli nükleer zarf üzerinde koyu bir astar olan akrozom (kırmızı oklar) tamamen genişletilmiştir ve 7-8. Bu aşama, kabak hazırlığının birçok yerinde bol miktarda bulunan olgun spermatidler (beyaz oklar) ile karakterizedir. Pachytene spermatositlerinin (PSpc) çekirdeği gelişim sırasında büyür ve vii-VIII evresinde önceki aşamalara göre daha büyük görünür. Pachytene spermatositlerinin (PSpc) çekirdeğinin içindeki koyu kromatin alanları, yüksek transkripsiyon aktivitesi ve meiotik olaylar nedeniyle bulanık görünür. (E) Evre X. Adım 10 spermatid çekirdekleri (beyaz oklar) uzamaya başlandı, ancak kromatin henüz yoğunlaşmadı. Akrozomlar nükleer uçta (kırmızı ok) bir kanca oluşturmaya başlar. Pachytene spermatositlerinin (PSpc) çekirdekleri, meiotik bölünmelere hazırlanırken çok büyük görünür. (F) Aşama XII. Aşama XII, meiotik metafaz plakalarının (beyaz kesikli daireler) varlığı ile karakterizedir. Tipik yoğun kromatin desenine sahip küçük yuvarlak hücreler, kardeş kromozomların sinaptonemal kompleks oluşumunu başlatmak için hizalandıklarına sahip zigoten spermatositlerdir (ZSpc). Ölçek çubukları: 10 μm. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S3: Akrozomal ve nükleer lekelenme temelinde seminifer epitel döngüsünün evresinin tanımlanması. Aseton sabit squash preparatları Rhodamine konjuge PNA ve DAPI ile boyandı. Aşama I: 1. adım yuvarlak spermatidlerde akrozom bulunmazken, uzun spermatidlerde tamamen gelişmiş bir akrozom tespit edilebilir. Evre II–IV: Akrozomal gelişim yuvarlak spermatidlerde proacrosomal/akrozomal granüllerin ortaya çıkmasıyla başlar. Nükleer yüzeydeki akrozomal veziklikül, 3. Aşama V: Akrozomun subtended açısı 40 dereceden maksimum 95 ° 'ye kadar uzanır. Aşama VI–VII: Akrozomun altında yer alan açı 95 dereceden 120 dereceye kadar uzanır. Aşama VIII-IX: Akrozom adım 8 spermatidlerde (evre VIII) tamamen uzatılır ve hücrenin plazma zarı ile temas eden apikal tarafında çekirdek polarize olur (gösterilmez). Aşama IX spermatids çekirdeği deforme olur; dorsal ve ventral yüzeyler ilk kez görülür. Aşama X-XI: Spermatidler sırt açısını gösterir. Aşama XII: Bu aşama en iyi meiotik bölünmelerin ortaya çıkması ile karakterizedir; metafaz plakaları beyaz oklarla gösterilir. Akrozomları ile uzun spermatidler de görülür. Ölçek çubukları: 10μm. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Şekil S4: Geleneksel olmayan belirteçler için tam montajlı boyama. (A) Alfa düz kas aksini (aSMA) peritubuler miyoid hücreler tarafından ifade edilir. (B) Espin, Sertoli hücre sıkı kavşaklarına lokalize olur ve kan testis bariyerine katkıda bulunur. (C) PNA spermatid akrozomlarına lokalize olur. Ölçek çubukları: 50μm. Bu rakamı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek video 1: Aşama VII-VIII'i temsil eden seminifer tübüllerin kısa bir bölümünü kesmek. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

Yukarıda açıkladığımız transilluminasyon destekli mikrodispeksiyon yöntemi spermatogenez çalışması için aşama odaklı bir yaklaşım sağlamaktadır. Spermatogenez son derece senkronize bir süreçtir, ve spermatojenik farklılaşma sırasındaki tüm önemli adımlar, farklılaşma taahhüdü (VII-VIII aşamalarında), meiosis başlangıcı (VII-VIII), meiotik bölünmeler (XII), spermatid uzama (VIII) başlangıcı ve spermiasyon (VIII) 1^,26^,27gibi aşamaya bağlı bir şekilde düzenlenir ve yürütülür. Aşama odaklı analiz, spermatogenezin belirli adımlarıyla sınırlı olan ve bu nedenle sadece seminifer epitel döngüsünün tanımlanmış aşamalarında bulunan bu özel olayları incelemek için güçlü bir araç sağlar. Yöntemde ustalaşmak biraz pratik gerektirir ve kaliteli bir diseksiyon mikroskobu ve uygun aydınlatıcı koşulların kullanılması başarının anahtarıdır. Bu yöntemin günlük araç setinin bir parçası olarak uygulanması, spermatogenez sırasında moleküler olayların daha doğru bir şekilde parçalanmasına izin vererek araştırmaların erkek üreme fonksiyonları üzerindeki etkisini ve biyolojik alaka düzeyini büyük ölçüde iyileştirme kapasitesine sahiptir.

Üzerinde incelediğimiz tüm WT fare suşları benzer bir transilüminasyon deseni gösterir ve seminifer epitel döngüsünün aşamalarında korunmuş hücre ilişkileri sergiler. Mikrop hücrelerinin spermiojenik farklılaşması WT farelerinden çok farklı olmamak koşuluyla, aynı şey incelediğimiz tüm nakavt fare modelleri için de geçerlidir. Ayrıca, seminifer epitel döngüsünün aşamalarının boyuna segmental düzenlemesini sergileyen diğer türlere uygulanabilir⁷. Bununla birlikte, segmental olmayan aşamalara sahip türler (insan gibi) kullanılamaz. Kromatin yoğuşmasının transilluminasyon desenini tanımlamada spermatidlerin uzamasındaki temel rolü göz önüne alındığında, bu sürecin herhangi bir yanlış tanımlanmasının kaçınılmaz olarak bu yöntemin uygulanmasına engel olacağı açıktır. Genç farelerde ve genç yetişkinlerde (5-6 hafta) transilluminasyon deseni henüz tam olarak belirlenmemiştir ve bu nedenle sadece 8 haftadan büyük fareler kullanılmalıdır. Tübülleri sıkmanın ve çekmenin kaçınılmaz olarak transilluminasyon desenini engelleyeceğini akılda tutulması da önemlidir, çünkü seminifer epitel içindeki hücresel mimariyi bozar.

İzole seminifer tübül segmentleri, meiosis de dahil olmak üzere spermatogenez bağlantılı süreçlerin ek vivo gözlem ve manipülasyonu sağlayan kültüre edilebilir. Dokunun canlılığını sağlamak ve RNA ve protein bozulmasını önlemek için, örnekler toplanması ve fareden ödün verdikten en fazla 2 saat sonra işlenmesi gerekir. Seminifer tübüllerin ex vivo kültürü için, fedakarlıktan kültürün başlangıcına kadar geçen süre 1 saati geçmemelidir. Tübül parçalarının bütünlüğü, uygun şekilde hasat edilirse tipik olarak 72 saate kadar in vitro olarak korunabilir.

Seminifer epitel döngüsünün aşaması, kabak preparatlarının faz kontrastlı mikrokroskopisi kullanılarak doğrulanabilir ve daha da doğru tanımlanabilir¹⁶. Mikroskopi, analize ek bir boyut sağlayan ve spermatogenez^{28 , 29,30'un}belirli aşamalarında organel veya hücre hareketlerinin gözlemlenmesini sağlayan canlı hücreler üzerinde gerçekleştirilir. Faz kontrastlı mikroskopi, spermatogenez sırasında protein ekspresyolü ve lokalizasyon dinamiklerinin çok ayrıntılı analizini sağlayan, evreye özgü değişiklikler de dahil olmak üzere sonraki immünostaining için tam evreleme sağlar.

Hücreler kabak preparatlarında epitel bağlamından salınırken, tübül segmentlerinin bütün montajlı immünostainleri spermatojenik hücrelerin fizyolojik ortamlarında incelenmesini sağlar. Bu nedenle, tüm montaj preparatları, seminifer tübül mimarisinin ve hücreler arası temaslarının kesitlerde immünostainlemeden daha iyi bir görselleştirilmesini sağlayabilir. Daha da önemlisi, tübül segmentlerinin immünostainasyondan önce transilluminasyon destekli evrelemesi, belirli bir segmentin belirli aşaması hakkında bilgi vererek yaklaşımı daha da güçlü hale getirir. Tüm montajlı boyama, peritubular miyoid hücreler, peritubuler makrofajlar ve spermatogonia gibi seminifer tübüllerin çevresindeki hücrelerin incelenmesi için özellikle yararlı bir araçtır, ancak meiotik ve postmeiotik mikrop hücreleri hakkındaki araştırmalara yeni içgörüler de açabilir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
sığır serum albümini (BSA)	Sigma	A9647
kapak camı 20x20 mm	Menzel Glä ser	11961988
Falcon konik tüp 15 ml	Sarstedt	62.554.502
fetal sığır serumu (FBS)	Biowest	S1810
gres kalemi (ImmEdge)	Vector Laboratories	H-4000
mikroskop lamı Superfrost Plus	Thermo Scientific	22-037-246
Parafolmaldehit (PFA)	Elektron Mikroskobu Sciences	15714
Petri kabı (100 mm)	Greiner	664160
fosfat tamponlu salin (PBS)	Gibco	11503387
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Fisher	P36962
rodamin etiketli Fıstık aglütininin (PNA)	Vector Laboratories	RL-1072
Triton X-100	Sigma	93443
Ara-20	Sigma	P2287