Kodlamayan küçük RNA MicC, salmonella enteritidisteki dış zar proteinlerinde virülansa katkıda bulunur

Kodlamayan küçük RNA'lar (sRNA'lar), genellikle proteinleri kodlamayan, ancak bakteri kromozomları ^1,2,3'te bağımsız olarak kopyalanabilen 40-400 nükleotid uzunluğundadır. Çoğu sRNA, gen kodlayan bölgeler arasındaki intergenik bölgelerde (IGR'ler) kodlanır ve baz eşleştirme eylemleri yoluyla hedef mRNA'larla etkileşime girer ve hedef genlerin ekspresyonunu transkripsiyon sonrası^{seviye 4,5'te} düzenler. Madde metabolizmasında, dış membran protein sentezinde, çekirdek algılamada ve virülans gen ekspresyonunda önemli regülasyon rolleri oynarlar⁵.

MicC, Escherichia coli ve Salmonella enterica serovar Typhimurium'da bulunan ve OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 ve Omp36 6,7,8,9 gibi çoklu dış zar protein ekspresyonunu düzenleyebilen 109 nükleotid küçük RNA transkriptidir. MicC, in vitro ompC mRNA liderine ribozom bağlanmasını inhibe ederek OmpC ekspresyonunu düzenler ve Escherichia coli^6'daki işlevi için Hfq RNA şaperonunu gerektirir. Salmonella Typhimurium'da MicC, ompD mRNA'yı kodlama dizisi içinde bir ≤12-bp RNA dubleks aracılığıyla susturur (kodonlar 23-26) ve daha sonra endonükleolitik mRNA^7'nin dengesini bozar. Bu düzenleme süreci şaperon proteini Hfq¹⁰ tarafından desteklenir. OmpC, bağırsakta olduğu gibi besin ve toksin konsantrasyonlarının yüksek olduğu ortamlarda önemli olduğu düşünülen bol miktarda bir dış zar proteinidir⁶. OmpD porin, Salmonella Typhimurium'daki en bol dış zar proteinidir ve toplam hücre proteini^11'in yaklaşık% 1'ini temsil eder. OmpD, insan makrofajlarına ve bağırsak epitel hücrelerine yapışmada rol oynar¹². MicC ayrıca hem OmpC hem de OmpD porinlerinin ifadesini bastırır. MicC'nin virülansı düzenleyebileceği düşünülmektedir. MicC tarafından düzenlenen yeni hedef genleri keşfetmek ve micC'nin virülans düzenleme fonksiyonunu incelemek için, micC genini Salmonella Enteritidis (SE) suşu 50336'da klonladık ve daha sonra mutant 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / p micC'yi inşa ettik. Yeni hedef genler qRT-PCR ile tarandı. 50336ΔmicC'nin virülansı fareler ve tavuk enfeksiyonları tarafından tespit edildi.

Tüm deneyler, Ulusal Araştırma Konseyi'nin Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'na uygun olarak gerçekleştirildi. Yangzhou Üniversitesi hayvan bakımı ve kullanımı komitesi, hayvanlar üzerinde uygulanan tüm deney ve prosedürleri onayladı (SYXK2016-0020).

1. Bakteriyel suşlar, plazmidler ve kültür koşulları

1. Tablo 1'de listelenen bakteri ve plazmidleri kullanın.
2. LB suyunda veya LB agar plakalarında 37 °C'de, uygun olduğunda 50 μg / mL ampisilin (Amp) varlığında kültür bakterileri.
3. Sıcaklığa duyarlı plazmidler içeren kültür suşları, 30 °C'de mutant yapımının silinmesi için kullanılır.

2. S'nin klon micC geni. Enteritidis suşu 50336

1. S'nin micC geninin yukarı ve aşağı akış dizisine dayanır.Typhimurium suşu SL1344, SE50336 genomik DNA'yı şablon olarak kullanarak PCR ile micC geni içeren bir parçayı büyütmek için vmicC-F ve vmicC-R primerlerini tasarlar.
2. PCR için sırasıyla 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP karışımı (2,5 mM), 1 μL vmicC-F ve vmicC-R primerleri, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μL_ddH2O karıştırın.
3. Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 s için 94 °C, 1 dakika için 53 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
4. MicC gen dizisini elde etmek için PCR ürününü dizileyin.

3. MicC silme mutantının yapımı

NOT: Salmonella Enteritidis suşu 50336'nın micC-negatif mutantı, daha önce 13,14'te tarif edildiği gibi λ-Kırmızı aracılı rekombinasyon kullanılarak oluşturulmuştur. Kullanılan astarlar Tablo 2'de listelenmiştir.

1. MicC geninin homoloji parçalarını içeren kloramfenikol kasetini güçlendirin.
   1. micC geninin 5' ve 3' lerinden 50 bp homoloji uzantıları da dahil olmak üzere plazmid pKD3'ten kloramfenikol (Cm) kasetini yükseltmek için micC-F ve micC-R primerlerini tasarlayın.
   2. pKD3 plazmidini PCR şablonu olarak ayıklayın.
   3. PCR reaksiyon karışımı olarak sırasıyla 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2,5 mM), 1 μL micC-F ve micC-R primerleri, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μL_ddH2O karıştırın
   4. Cm kasetini aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarıyla güçlendirin: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 52 °C, 10 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C; 1 dakika boyunca 94 °C, 1 dakika boyunca 63 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
   5. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu tespit edin. DNA jel geri kazanım kiti ile PCR ürününü saflaştırın ve geri kazanın ve spektrofotometre ile DNA konsantrasyonunu belirleyin.
      DİKKAT: PCR iki kez yapılmalıdır. İlk PCR ürünü 1:200 oranında seyreltildi ve pKD3 plazmid tarafından daha fazla rekombinasyonun girişimini ortadan kaldırmak için ikincil PCR için bir şablon olarak kullanıldı.
2. Yapı 1^st rekombinant gerinim 50336ΔmicC::cat
   1. 100 μL SE50336 yetkin hücreleri 5 μL pKD46 plazmid ile eşit şekilde karıştırın ve buz üzerinde 30 dakika boyunca inkübe edin. Yukarıdaki karışımı 42 ° C'de 90 s boyunca ısıtın ve pKD46 plazmidini SE50336'ya dönüştürmek için karışımı 2 dakika boyunca hızla buza aktarın. Pozitif kolonileri, Amper (50 μg / mL) dirençli bir plaka üzerinde 30 ° C'de gece boyunca kültürleyerek tarayın.
   2. SE50336/pKD46 sıvı kültürüne 30 mM L-arabinoz ekleyin ve 1 saat boyunca 30 °C'lik bir çalkalama kültürü ile rekombinaz ekspresyonunu indükleyin. Sonra yetkili hücreler hazırlayın.
   3. 100 ng saflaştırılmış PCR ürünü (adım 3.1) ve 40 μL SE50336/pKD46 yetkin hücreleri bir elektrik çarpması kabına (örneğin, Bio-Rad) karıştırın. Voltaj 1.8 kV, darbe 25 μF ve direnç 200 Ω parametreleri ile elektrik şoku dönüşümü gerçekleştirin.
   4. Elektrotransformasyondan sonra, karışımı 1 mL SOC ortamına ve 1 saat boyunca 150 rpm ve 30 ° C'de bir sallama kültürüne aktarın. Daha sonra pozitif koloni taramak için karışımı Cm (34 μg / mL) dirençli bir LB plakasına ve kültürüne gece boyunca 37 ° C'de sürün.
   5. Yukarıdaki pozitif koloni 2 saat boyunca 42 ° C'de kültürlendirin. Amp'ye (50 μg/mL) duyarlı, ancak Cm'ye (34 μg/mL) dirençli koloniyi, pKD46 olmadan 1. rekombinant suşu elde etmek için gece boyunca 37 °C'de tarayın.
3. 1. rekombinant suşu 50336ΔmicC::Cat'i tanımlayın.
   1. PCR şablonu olarak 50336ΔmicC::Cat genomik DNA'sını ayıklayın. Adım 2.1'deki PCR reaksiyonu bileşenlerinin aynısını kullanın. PCR reaksiyonunu adım 2.1'deki gibi aynı koşullarla gerçekleştirin.
   2. Agaroz jel elektroforezi ile PCR ürününün boyutunu tespit edin ve PCR ürününü sıralayın.
4. Yapı silme mutantı 50336ΔmicC.
   1. 100 ng plazmid pCP20'yi 40 μL'lik 50336ΔmicC::Cat yetkili hücrelerine 1,8 kV gerilim, darbe 25 μF ve direnç 200 Ω parametrelerine sahip hücreler, 30 °C'de hem Amper (50 μg/mL) hem de Cm (34 μg/mL) dirençli plaka üzerinde pozitif transformantları elekler.
   2. Pozitif transformantların üzerinde dirençli olmayan LB'ye aktarın ve gece boyunca 42 ° C'de kültüre alın ve daha sonra 37 ° C'de bir LB plakası üzerindeki tek kolonileri izole edin. Hem Amp hem de Cm'ye duyarlı olan koloni seçin. Bu mutant, micC silme mutantı SE50336Δ micC'dir.
   3. 50336ΔmicC'yi PCR ile doğrulayın.
      1. 50336ΔmicC genomik DNA'yı PCR şablonu olarak ayıklayın. PCR için 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL şablon, 1 μL Taq DNA polimeraz ve 35 μL ddH₂O karıştırın.
      2. Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 sn için 94 °C, 1 dakika için 53 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.

4. MicC kompleman geriniminin yapımı

1. NheI ve SalI kısıtlama bölgelerine sahip pBR-micC-F ve pBR-micC-R astarları tasarlayın.
   1. Şablon olarak 5 μL SE50336 genomik DNA, primer olarak 1 μL pBR-micC-F ve 1 μL pBR-micC-R, 5 μL 10x PCR reaksiyon tamponu, 2 μL dNTP Karışımı (2.5 mM), 2 μL dNTP Karışımı (2.5 mM) ve 35 μL ddH₂O içeren PCR reaksiyon karışımını kullanarak tam uzunlukta micC genini yan dizilerle güçlendirin.
   2. Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 s için 94 °C, 50 s için 52 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma. PCR ürününü saflaştırın ve geri kazanın.
2. Kısıtlama enzimi NheI ve SalI kullanarak sırasıyla PCR ürününü ve plazmid pBR322'yi sindirin ve plazmid pBR322-micC'yi elde etmek için gece boyunca 16 ° C'de T4 ligaz kullanarak bunları bağlayın.
3. pBR322-micC'yi SE50336ΔmicC yetkin hücrelerine dönüştürün ve tamamlanmış SE50336ΔmicC/pmicC suşunu elde etmek için pozitif dönüştürücüyü elin. Plazmid pBR322-micC'yi tamamlanmış suştan çıkarın ve kısıtlama enzimi sindirimi ve dizilimi ile doğrulayın.

5. RNA izolasyonu ve kantitatif gerçek zamanlı PCR

1. Kültür SE50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC , LB ortamında gece boyunca 24 ° C'de 180 rpm ile 2.0'lık bir OD_600'e kadar sallanır. 2 dakika boyunca 13000 rpm'de santrifüjleme yoluyla bakteri kültürü toplayın.
2. TRIzol reaktifini kullanarak toplam RNA'yı ekstrakte edin. DNA'yı çıkarmak için 30 dakika boyunca 37 ° C'de 2 μL DNaseI ve 6 μL 10x tampon ile 50 μL izole RNA'yı inkübe edin. 1 μL RNA örneğini bir mikro spektrofotometreye pipetleyerek RNA miktarını belirleyin.
3. cDNA sentezi
   1. 20 μL ters transkripsiyon reaksiyon sisteminde cDNA sentezi için 1 μg toplam RNA kullanın (4 μL 5x tampon, 1 μL RT Enzim karışımı, 1 μL RT primer karışımı, 10 μL toplam RNA ve 4 μL ddH₂O). Reaksiyon sisteminin üzerinde 37 ° C'de 15 dakika ve daha sonra 85 ° C'de 5 s boyunca inkübe edin.
4. Hedef genlerin ompA, ompC ve ompD dizisine dayalı primerler tasarlayın. Bir RT reaktif kiti kullanarak ters transkripsiyon-PCR gerçekleştirin. PCR reaksiyon bileşenleri 2.5 μLof 10x PCR reaksiyon tamponu, 1 μL dNTP karışımı (2.5 mM), 1 μL hedef gen (ompA, ompC veya ompD) primerleri, 2.5 μL şablon, 0.5 μL Taq DNA polimeraz ve 17.5 μL _ddH2O içerir.
   1. Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: 4 dakika boyunca 94 ° C'de ön denatürasyon; 30 sn için 94 °C, 1 dakika boyunca 60 °C, 25 döngü için 1 dakika boyunca 72 °C ve 10 dakika boyunca 72 °C'de uzatma.
5. Üçlü bir RT-PCT cihazında SYBR yeşil RT-PCR kitini kullanarak gerçek zamanlı PCR gerçekleştirin.
   1. Aşağıdaki PCR reaksiyon bileşenlerini kullanın: sırasıyla 10 μL 2x SYBR tamponu, 0.4 μLof ileri astar ve ters astar, 0.4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA ve 6.8 μL RNaz içermeyen_H2O.
   2. Aşağıdaki PCR reaksiyon koşullarını kullanın: bir döngü için 1 dakika boyunca 95 ° C'de ön denatürasyon; 5 s için 95 °C, 40 döngü için 34 s için 60 °C.
   3. Tüm verileri endojen referans geni gyrA'ya normalleştirin. Veri ölçümü için ^2-ΔΔCT yöntemini kullanın¹⁵.

6. Virülans tahlilleri

1. Kültür SE50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC, 24 ° C'de LB orta ila erken sabit fazda (2-3'ün OD_600'ü), santrifüjleme ile hasat edilir ve steril PBS'de uygun CFU mL-1'e seyreltilir.
2. Fare enfeksiyonları için, kültürlenmiş suşları 10 CFU / 200 μL, 10² CFU / 200 μL ve 10³ CFU / 200 μL gradyan süspansiyonlarına seyreltin. Subkutan enjeksiyon ile suş başına beş 6-8 haftalık Balb / c fareden oluşan grupları enfekte edin. Kontrol grubuna 200 μL fizyolojik salin enjekte edin.
3. Tavuk enfeksiyonları için, üç suşun üzerinde 10⁷ CFU / 200 μL, 10⁸ CFU / 200 μL ve 10⁹ CFU / 200 μL gradyan süspansiyonlarına seyreltin. Subkutan enjeksiyon ile suş başına yirmi 1 günlük tavuk gruplarını enfekte edin.
4. Hastalık belirtilerini ve deney hayvanlarının ölümlerini günlük olarak izleyin. LD₅₀ (medyan ölümcül doz) 14 d enfeksiyon sonrasını daha önce tarif edildiği gibi hesaplayın¹⁶. Veri analiz yazılımını kullanarak verileri işleyin.
5. Enfeksiyon gruplarında, taze ölü civcivlerin kalbini, karaciğerini, dalağı, akciğerini ve böbreğini toplayın. Yukarıdaki dokuların 0,5 g'ını ayrı ayrı tartın ve steril işlemle öğütün. Öğütme numunelerini kademeli olarak seyreltin, LB plakasına ve kültürüne 37 ° C'de 8-10 saat yayın. Civciv dokularında kolonize edilen Salmonella suşlarının miktarını kaydedin.

Mutant 50336Δ micC ve tamamlanmış gerinim 50336Δ micC /p micC'nin yapımı
MicC gen klonu sonucu, bu genin S'ninkiyle 0 özdeşleştiğini gösteren 109 bp'den oluştuğunu gösterdi. Typhimurium. Sekans verilerine dayanarak, silme mutantı 50336ΔmicC ve tamamlanmış mutant 50336ΔmicC / pmicC başarıyla inşa edildi. Ayrıntılı olarak, sıralama sonuçları, 1.1 kb Cm'lik bir direnç kasetinin güçlendirildiğini ve 1. rekombinantın yapımında kullanıldığını göstermiştir. 1. rekombinant 50336ΔmicC::cat, vahşi tip suşta 279 bp PCR ürününe kıyasla, Cm yerleştirmeli yaklaşık 1200 bp PCR ürününün beklenen bant boyutuna sahip vmicC-F ve vmicC-R primerleri kullanılarak PCR ile doğrulanmıştır (Şekil 1). İkinci rekombinasyonda, Cm kaseti pCP20 tarafından elimine edildi. Dizileme ile birleştirilen PCR sonuçları, izojenik micC mutantının başarıyla inşa edildiğini ve 50336ΔmicC olarak adlandırıldığını doğruladı (Şekil 1).

MicC, ompA, ompC ve ompD gen ekspresyonunu düzenler
MicC'nin hedeflerini belirlemek için, SE suşları 50336, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / p micC'deki ompA, ompC ve ompD genlerinin ekspresyonu, normalleştirici iç standart olarak gyrA kullanılarak gerçek zamanlı kantitatif PCR ile analiz edildi. Sonuçlar, 50336ΔmicC'deki ompA ve ompC'nin transkripsiyonunun vahşi tip suştakilere göre yaklaşık 2.2 kat ve 3 kat arttığını, 50336ΔmicC'deki ompD'nin ise vahşi tip suşa göre biraz (1.3 kat) arttığını göstermiştir (Şekil 2). MicC'nin ompA, ompC ve ompD ekspresyonunu baskılayabileceğini gösterdi. OmpA muhtemelen doğrudan micC tarafından düzenlenen potansiyel bir yeni hedef gendi.

micC'nin silinmesi S'yi geliştirir. Farelerde ve tavuklarda enteritidis virülansı
MicC silmenin S üzerindeki etkisini ölçmek için LD50 testleri yaptık. Farelerde ve tavuklarda Enteritidis virülansı. 6-8 haftalık Balb / c farelerini üç suşun her birinden 103 CFU ile enfekte ettikten sonra, 50336ΔmicC ile enfekte olan en fazla farenin enfeksiyondan 48 saat sonra gevşeklik, iştahsızlık veya ishal gösterdiğini ve enfeksiyondan 96 saat sonra art arda öldüğünü gözlemledik. WT suşu ve 50336ΔmicC / pmicC ile enfekte olan fareler, enfeksiyondan 72 saat sonra yukarıdaki semptomları gösterirken, enfeksiyondan 120 saat sonra öldüler. LD50s enfeksiyon sonrası 7 d olarak hesaplandı. Sonuçlar, fareler için WT suşu 5050, 50336ΔmicC ve 50336ΔmicC / pmicC'nin sırasıyla 12.59, 5.01 ve 19.95 CFU olduğunu göstermiştir. Mutant 50336ΔmicC'nin virülansının farelerde WT ile karşılaştırıldığında 2.5 kat arttığını göstermiştir (Tablo 3). 1 günlük tavuklara üç suşun her birinin 109 CFU'su bulaştırdıktan sonra, çoğu tavuk enfeksiyondan 10 saat sonra bağırsak hiperemi ve ishal gösterdi. 108 CFU ile enfekte olduğunda, 50336ΔmicC ile enfekte olan tavuklar, WT suşu ve 50336ΔmicC / pmicC ile karşılaştırıldığında daha yüksek mortalite göstermiştir. LD50s, enfeksiyon sonrası 14 d için hesaplandı. Sonuçlar, WT suşu 50'nin LD 50'sinin 50336, 50336ΔmicC ve tavuklar için 50336ΔmicC / pmicC'nin sırasıyla 1.13×109, 1.55×10 8 ve2.54×10 8 CFU olduğunu göstermiştir. MicC'nin silinmesinin de S'nin virülansını arttırdığını göstermiştir.Tavuklarda enteritidis. S. Enteritidis'in üç suşu da enfekte tavukların karaciğer, dalak ve caecum'undan kurtarıldı.

Şekil 1: 50336ΔmicC mutantlarının vmicC-F ve vmicC-R primerleri ile PCR doğrulaması. 280 bp PCR ürünü, vahşi tip 50336 genomu şablon olarak (şerit 1) elde edildiğinde elde edildi. Cm kaset geni S'nin genomuna eklendiğinde.Enteritidis, 1. rekombinant 50336Δmic::cat PCR ile doğrulandı ve 1100 bp PCR ürünü elde edildi (şerit 2). 50336Δmic::cat'in Cm kaset geni, FLP rekombinaz eksprese eden vektör pCP20 tanıtılarak eksize edildi ve 2. rekombinant 50336Δmikrofon PCR (şerit 3) ile elde edildi ve doğrulandı. M: moleküler kütle belirteci. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Mutant 50336 Δ mikrofonda ompA, ompC ve ompD genlerinin mRNA düzeyindeki kıvrım değişiklikleri belirlendi ve 50336Δ mikrofon/pmikrofon suşu kantitatif RT-PCR ile vahşi tip suşa kıyasla tamamlanmıştır. Tahliller üçlü olarak yapıldı. Veri niceliği için 2-ΔΔCT yöntemi kullanıldı. *Vahşi tip suşu ile karşılaştırıldığında istatistiksel olarak anlamlı farkı gösterir (p<0.05) Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan bakteri suşları ve plazmidler.

Tablo 2. Bu çalışmada kullanılan astarlar

Tablo 3. S.'nin virülans özellikleri Enteritidis 50336 farelerde ve tavuklarda suşlar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.