Yöntem makalesi

Aedes aegypti Koku Reseptörlerinin Ksenopus Oositlerinde İnsan Kokularına Heterolog Ekspresyonu ve Fonksiyonel Analizi

DOI:

10.3791/61813

⸱

8 Haziran 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University, 2Departments of Biochemistry & Biophysics, and Cellular & Molecular Pharmacology, University of California, San Francisco, 3Department of Biological Sciences, Vanderbilt University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İki elektrotlu bir voltaj kelepçesi ile birleştirilmiş bir Xenopus oosit ekspresyon sistemi kullanarak insan kokularına yanıt olarak sivrisinek ameliyathanelerini işlevsel olarak karakterize eden ve sivrisineklerin ameliyathanelerinin insan kokularına maruz kalmaya tepkilerini keşfetmek için güçlü yeni bir teknik sağlayan bir protokol sunulmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sarı humma, dang humması ve Zika ateşi dahil olmak üzere birçok önemli insan hastalığının vektörü olan sivrisinek Aedes aegypti (Linnaeus), kan yemekleri için diğer sıcakkanlı hayvanlara göre insan konakçıları için güçlü bir tercih göstermektedir. Koku alma ipuçları, sivrisinekler için çevrelerini keşfederken ve kan unu elde etmek için bir insan konakçı ararken kritik bir rol oynar, böylece insan hastalıklarını bulaştırır. Koku alma duyu nöronlarında eksprese edilen koku reseptörlerinin (OR'ler), sivrisinek vektörlerinin insan kokuları ile etkileşiminden sorumlu olduğu bilinmektedir. Ae. aegypti'nin koku alma fizyolojisi hakkında daha derin bilgiler edinmek ve insanlarla etkileşimlerini moleküler düzeyde araştırmak için, Ae'yi işlevsel olarak analiz etmek için optimize edilmiş bir Xenopus Oosit heterolog ekspresyon protokolü kullandık. insan kokularına yanıt olarak aegypti koku reseptörleri. Üç örnek deney sunulmuştur: 1) OR'lerin cRNA'larının ve koku reseptörü ko-reseptörünün (Orco) dört ila altı günlük Ae. aegypti antenlerinden klonlanması ve sentezlenmesi; 2) Xenopus oositlerinde OR'lerin ve Orco'ların mikroenjeksiyonu ve ekspresyonu; ve 3) İki elektrotlu bir voltaj kelepçesi ile sivrisinek OR'leri / Orco'yu ifade eden Xenopus oositlerinden tam hücre akımı kaydı. Bu optimize edilmiş prosedürler, araştırmacıların Aedes sivrisineklerinde insan kokusu alımını araştırmaları ve konakçı arama aktivitelerini moleküler düzeyde yöneten altta yatan mekanizmaları ortaya çıkarmaları için yeni bir yol sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sarı humma sivrisineği Ae. aegypti, sarı humma, dang humması ve Zika ateşi dahil olmak üzere birçok ölümcül hastalığı bulaştırarak muazzam sıkıntı ve yaşam kaybına neden olabilir. Sivrisinekler, konakçılarını bulmak için CO2, cilt kokusu ve vücut ısısı gibi birçok ipucundan yararlanır1. Hem insanların hem de diğer sıcakkanlı hayvanların CO2 ürettiği ve benzer vücut sıcaklıklarına sahip olduğu göz önüne alındığında, dişi Ae. aegypti'nin konak ayrımcılığı2 için öncelikle cilt kokusuna güvenmesi muhtemel görünmektedir. Bununla birlikte, bu, insan derisi yayılımlarından 300'den fazla bileşiği izole eden erken bir çalışma ile karmaşık bir resim oluşturur3. Daha ileri davranışsal tahliller, bu bileşiklerin bir kısmının Ae. aegypti 4,5,6,7'de davranışsal tepkiler uyandırdığını göstermiştir, ancak bu bileşiklerin sivrisinek tarafından tam olarak nasıl tespit edildiği büyük ölçüde bilinmemektedir. Grubumuz tarafından yapılan son araştırmalar, Ae. aegypti konak arama aktivitesinde rol oynayabilecek birkaç insan koku maddesi tanımlamıştır, ancak rolleri henüz daha fazla davranışsal tahlil ile doğrulanmamıştır8. Bu temel insan koku maddelerinin Ae. aegypti'nin periferik duyu sisteminde nasıl çözüldüğü henüz belirlenmemiştir.

Böcekler, koku alma uzantılarındaki kemosensoriyel sensilla yoluyla koku maddelerini algılar. Sensillaların her birinin içinde, koku reseptörleri (OR'ler), iyonotropik reseptörler (IR'ler) ve tat reseptörleri (GR'ler) dahil olmak üzere farklı koku alma reseptörleri, koku alma duyu nöronlarınınzarında eksprese edilir 9. Bu ameliyathaneler, böceklerin karşılaştığı birçok koku maddesini, özellikle de gıda, konakçılar ve çiftleşme partnerleriyle ilişkili kokuları algılamaktan sorumludur 10,11,12,13. İki elektrotlu bir voltaj kelepçesi ile birleştirilmiş Xenopus ekspresyon sistemini kullanarak Anopheles gambiae'deki OR'lerin işlevini yetim bırakmaya odaklanan önceki bir çalışma, Anopheles OR'lerin insan yayılımlarındaki ana bileşenler olan aromatiklere özel olarak ayarlandığını bulmuştur14. Yakın tarihli bir genom çalışması, Ae. aegypti15'te 117'ye kadar OR geni tanımladı. Sonuç olarak, insan kokuları veya yumurtlama uyaranları gibi biyolojik veya ekolojik olarak önemli koku maddelerine yanıt olarak bu Aedes OR'lerin işlevlerini sistematik olarak ele almanın bir yolu, Ae'nin kimyasal ekolojisini veya nöroetolojisini daha iyi anlamak isteyenler için yararlı bilgiler sağlayacaktır.

İki elektrotlu voltaj kelepçesi (TEVC) tekniği ilk olarak 1990'ların ortalarında membran iyon kanallarının işlevini incelemek için geliştirilmiştir16,17. O zamandan beri, TEVC bir dizi farklı böcek türünden ameliyathaneleri araştırmak için kullanılmıştır 14,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34. Ameliyathanelerin bu işlevsel incelemesi, böceklerde aşağıdakiler de dahil olmak üzere önemli ekolojik soruların yanıtlanmasına önemli ölçüde katkıda bulunmuştur: 1) Böcekler besin kaynaklarını nasıl bulur? 2) Çiftleşme partnerleri tarafından salınan uçucu seks feromonlarından nasıl etkilenirler? 3) Yavruları için mükemmel bir yumurtlama alanını nasıl bulurlar? ve 4) İnsanları ısıran böceklerden etkili bir şekilde koruyabilecek bitki kaynaklı veya sentetik bileşikler var mı? Bu soruların cevapları, sivrisinekler gibi önemli hastalık vektörlerini kontrol etmek için çok önemlidir.

İnsan embriyonik böbrek hücre hattı 293 (HEK293), Drosophila boş nöron sistemi, çinko parmak nükleazı, transkripsiyon aktivatörü benzeri efektör nükleaz ve CRISPR / Cas9 gen düzenleme sistemine dayalı olanlar da dahil olmak üzere bir dizi başka yaklaşım da OR fonksiyonel çalışmalarındakullanılmıştır 12,20,35,36,37. Bununla birlikte, bu tekniklerin tümü deneyimli bir moleküler biyoloğun becerilerini gerektirir ve potansiyel olarak kafa karıştırıcı birçok faktör içerir. TEVC/oosit ekspresyonu, koku ile uyarılan reseptör akımlarını ve iyon iletkenliğini doğrudan ölçebilir ve cRNA'dan reseptörleri eksprese etmek için gereken hızlı hızlı kurulum süresi avantajına sahiptir. Bu nedenle, bu çalışmada, bir Ae. aegypti OR55'in (AaegOR55) potansiyel biyolojik önemi olan çeşitli koku maddelerine karşı tepkilerini incelemek için TEVC'yi kullandık ve AaegOR55•AaegOrco ile eksprese edilen oositlerin insan koku verici benzaldehite doza bağlı bir yanıt gösterdiğini ortaya çıkardık.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür için protokol, Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı onaylanır ve izlenir (Auburn Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi: onaylanmış protokol # 2016-2987).

NOT: Özel gen sentezi, sivrisinek VEYA genleri için klonlamaya uygun bir alternatiftir.

1. Sivrisinek ve Koku Alma Ekleri (Antenler) Koleksiyonu

  1. Ae. aegypti sivrisineklerini (Dr. James Becnel, USDA, ARS, Sivrisinek ve Sinek Araştırma Birimi'nden elde edilen) 25 ± 2 ° C'de ve 12: 12 (L: D) h (ışıklar sabah 8'de) bir fotoperiyotta koruyun.
  2. ~ 800 4-6 günlük dişi sivrisinekleri CO2 kullanarak kan beslemesi olmadan uyuşturun. Sivrisinek antenlerini (koku alma dokuları) bir makas kullanarak mikroskop altında (40x) kesin ve kuru buz üzerinde tutulan 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünde toplayın.
    NOT: Toplanan antenler -80 °C'de bir dondurucuda saklanabilir veya hemen kullanılabilir.

2. VEYA Ae'nin Antenlerinden Klonlama . aegypti

  1. Üreticinin protokolünü izleyerek ticari olarak temin edilebilen bir toplam RNA kiti kullanarak antenden toplam RNA'yı çıkarın.
  2. Üreticinin protokolünü izleyerek DNaz ve diğer iyonları çıkarmak için ticari DNA içermeyen kiti kullanarak toplam RNA'yı sindirin.
  3. Oligo d(T)20-primed SuperScript IV Birinci İplikli Sentez Sistemi13,30 kullanarak 1,5 μg DNA içermeyen RNA'dan cDNA sentezleyin.
  4. VectorBase'de (https://www.vectorbase.org/) bulunan dizilere ve enzim kesme bölgesinin özel gereksinimlerine göre OR genleri için PCR primerleri tasarlayın. Çoğu ökaryotik organizmada translasyonu başlatan bir Kozak dizisi (GCCACC), her bir ileri primer30'da kesme bölgesi ile başlangıç kodonu arasına ekleyin.
  5. Restriksiyon endonükleaz bölgelerini içeren gene özgü primerler ve üreticinin protokolünü takip eden Kozak dizisini kullanarak OR genlerinin kodlama dizilerini PCR ile klonlayın.
  6. PCR ürünlerini %1'lik bir agaroz jel ile tespit edin ve üreticinin protokolünü izleyerek ticari bir jel ekstraksiyon kiti kullanarak saflaştırın.
  7. Üreticinin protokolünü takip ederek kısıtlama enzimleri ile sindirildikten sonra PCR ürünlerinin bir pT7Ts vektörüne klonlanması yoluyla rekombinant plazmit yapımını gerçekleştirin.
  8. Sanger dizilemesi ile rekombinant plazmitleri doğrulayın ve VectorBase veritabanını kullanarak onaylayın.

3. cRNA Sentezi

  1. Oluşturulan plazmitleri spesifik kısıtlama enzim(ler)i ile doğrusallaştırın.
    NOT: Plazmid DNA, kopyalanacak genin aşağı akışında bir kısıtlama enzimi ile doğrusallaştırılmalıdır.
  2. Önceki bir açıklamayı13,30 izleyerek ticari bir T7 kiti ile cRNA'ları sentezlemek için doğrusallaştırılmış plazmitleri kullanın.
  3. OR ve Orco'nun cRNA'sını (1:1) bir santrifüj tüpünde önceden karıştırın ve karışık cRNA'yı her PCR tüpü için 2 μL'lik bir hacme (250 ng/μL/her biri) ayırın. Aliquoted cRNA'yı kullanmadan önce -80 °C'de saklayın.

4. Xenopus Oosit Koleksiyonu

NOT: Prosedür, Schneider ve ark.38'in talimatını takip etmektedir.

  1. Xenopus laevis'i 1 L ultra saflaştırılmış suda 1 g etil m-aminobenzoat metansülfonat tuzu ile 20-30 dakika anestezik hale getirin (Şekil 1A). Parmaklarınızı kullanarak kurbağanın ayak parmaklarından birini sıkıştırın; Yanıt yoksa, kurbağa yeterince uyuşturulur ve ameliyata hazırdır. Anestezi uygulanmış kurbağayı buz yatağına aktarın.
  2. Ameliyat
    1. Kurbağa ventral bölgesini% 10 povidon-iyot çözeltisi ile ovalayın ve çözeltiyi temiz pamuk topları ile silin. Bu adımı 2 kez tekrarlayın.
    2. Tek kullanımlık bir neşter ile küçük bir karın kesisi (10-15 mm, Şekil 1B) yapın. Cilde, fasya kas tabakasına ayrı ayrı nüfuz edin. Kesi, karnın alt kısmında, orta hattın lateralinde olur.
      NOT: İç organlara zarar vermeyin.
    3. Yumurtalık loblarının parçalarını forseps ile kavrayın ve yavaşça dışa doğru çekin. Yumurtalığı kaldırın ve makasla vücut duvarı hizasında kesin. Yeterli yumurtalık materyali elde edene kadar birkaç kez tekrarlayın (~ 200 yumurta, Şekil 1C). Yumurtalık materyallerini yıkama tamponuna aktarın (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2•6H2O, 5 mM HEPES sodyum tuzu, 10 μg / mL gentamisin, pH 7.6).
    4. Ameliyat yaralarını (hem kas hem de cilt) tipik olarak 10-14 gün içinde doğal olarak bozulan ve dökülen emilebilir dikişlerle kapatın.
    5. Her ameliyattan sonra, kurbağayı uyanana kadar 1 L kurtarma solüsyonuna (3.4 g konserve ve dekapaj tuzu ve 2 g hazır okyanus deniz tuzu içeren) koyun ve ardından kurbağa tesisine geri koyun.
      NOT: Her kurbağaya en fazla 4 ameliyat yapılabilir. Her kurbağanın çalışma aralığı 2 aydan fazla olmalıdır.
  3. Enzimatik defolliküle sindirim ve oosit kültürü
    1. Yumurtaları (~ 200 yumurta, Şekil 1C) küçük parçalara ayırın.
    2. Foliküler hücre tabakalarını çıkarmak için tüm oositleri ortam sıcaklığında 40-60 dakika boyunca 10 mL yıkama tamponu (Bölüm 4.2.3) ve 2 mg / mL kollajenaz B dahil olmak üzere bir sindirim solüsyonuna aktarın. Oositlerin %80'inin tamamen defolliküle edilip edilmediğini belirlemek için numuneleri mikroskop altında inceleyin; Değilse, oositlerin çoğu hazır olana kadar her 10 dakikada bir kontrol edin.
    3. Oositleri 1x Ringer solüsyonu (96 mM NaCl, 2 mM KCl, 5 mM MgCl2·6H2O, 5 mM HEPES sodyum tuzu, pH 7.6), yıkama tamponu (Bölüm 4.2.3), modifiye Barth tuzlu su (78 mM NaCl, 1 mM KCl, 0.33 mM Ca(NO3)2 · 4H2O, 0.41 mM CaCl2 · 2H2O, 0.82 mM MgSO4·7H2O, 2.4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES sodyum tuzu, 1.8 mM sodyum piruvat, 10 μg / mL gentamisin, 10 μg / mL streptomisin, pH 7.6) sırayla (her tampon için 5 kez, her seferinde 10 mL kullanarak). Olgunlaşmamış ve düşük kaliteli oositleri çıkarmak için oositleri tamponlarla yoğun bir şekilde durulayın.
    4. Dumont'un sınıflandırmasına göre evre V-VI'da oositleri hasat edin. Evre V-VI'daki sağlık/kaliteli oositleri, berrak beyaz/koyu bir bölünme ile ve görsel olarak belirgin bir hasar olmadan (Şekil 1D), modifiye Barth salini içeren 100 mm x 15 mm'lik bir Petri kabına aktarın (Bölüm 4.3.3). Kötü kaliteli oositleri atın (Şekil 1E). Mikroenjeksiyondan önce sindirilmiş oositleri böcek büyüme odalarında yaklaşık 24 saat boyunca 18 ° C'de tutun.

5. ksenopus oositlerinde cRNA mikroenjeksiyonu ve koku reseptörlerinin (OR'ler) ve OR ko-reseptörlerinin (ORCO) ekspresyonu

  1. 100 mm x 15 mm'lik Petri kabına metal bir matris koyun ve matris suya batırana kadar modifiye Barth'ın tuzlu suyunu ekleyin (Bölüm 4.3.3). Oositleri matris üzerine aktarın ve boyuta uymayan oositleri atın. Oositleri bitkisel direkler üst tarafta olacak şekilde düzenleyin (Şekil 1F).
  2. Bir mikro boru çektirme (Isı = 525, Çekme = 50, Hız = 50, Zaman = 250) kullanarak her numune için yeni bir cam kılcal damar (1,0 mm Dış Çap x 0,5 mm İç Çap, uzunluk = 100 mm) çekin ve 25°'lik bir açıyla bir mikropipet saptırıcı ile keskinleştirin. Kılcal boruyu nanolitre enjektöre monte edin.
  3. Enjeksiyondan önce, OR ve Orco'nun önceden karıştırılmış cRNA'larından (Bölüm 3.3) bir tüpü dondurucudan çıkarın ve tamamen eriyene kadar buzun üzerine koyun. Nanolitre enjektörün Doldur düğmesine basarak kılcal boruyu OR / Orco karışımı ile doldurun.
  4. RNAse içermeyen bir istasyonda nanolitrelik bir enjektör ile her oosit için 10 ng (5ng VEYA + 5ng Orco; ~ 20 nL) önceden karıştırılmış cRNA'yı enjekte edin. (Şekil 1F).
    NOT: Enjeksiyondan önce, kılcal borunun tıkalı olmadığından emin olmak için küçük karışımı boşaltmak için EMPTY düğmesine basıyoruz. cRNA'ların oosit içine tamamen girmesi için yaklaşık 5 saniye beklemek.
  5. Enjeksiyondan sonra, oositleri, tam hücre kaydından önce 3-7 gün boyunca 18 ° C'de modifiye Barth tuzlu su ile steril 24 oyuklu bir hücre kültürü plakasında saklayın.

6. İki elektrotlu Voltaj kelepçesi sistemi kullanarak Tüm Hücre Akım Kaydı (Şekil 2)

  1. İki elektrotlu Voltaj kelepçesi kaydından önce, bir dizi stok çözeltisi (100 μg / μL) elde etmek için tek tek koku verici bileşikleri dimetil sülfoksit (DMSO) içinde çözün. Bu stok çözeltilerini 1x ND96 tamponu (91 mM NaCl, 2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2·2H2O, 2 mM MgCl2·6H2O, 5 mM HEPES sodyum tuzu, pH 7.6) ile 1000 kat seyreltin bir dizi çalışma çözeltisi (0.1 μg/μL) elde etmek için.
  2. Metal kalkan, mikroskop, ışık kaynağı ve atık pompası dahil olmak üzere TMC titreşim izolasyon masasındaki her şeyin, harici elektriksel gürültünün tüm hücre sinyal kaydı üzerindeki etkisini azaltmak için dikkatli bir şekilde topraklandığından emin olun.
  3. Bir mikro boru çektirme (Isı = 525, Çekme = 50, Hız = 50, Zaman = 250) kullanarak bir cam kılcal damarı (1,20 mm OD x 0,94 mm ID, uzunluk = 750 mm) çekerek mikroelektrotları hazırlayın. Kılcal damarları 3 M KCl ile doldurun. Ag/AgCl tellerini %10 klorlu ağartıcıda koyu gri bir renk alana kadar 2-5 dakika klorlayın (soluk gri Ag/AgCl tellerinin klorlanması gerekir).
  4. Oocyte Clamp ve Digidata Digitizer'ı açarak makineyi açın (Şekil 3A). Yazılımı açın (örneğin, Clampex 10.3) ve Kaydet düğmesine tıklayın. 1x ND96 tamponu (Bölüm 6.1) anahtarını ve atık tamponu için pompayı açın.
  5. Mikroelektrotları akan tampona yerleştirerek ve ardından mikroelektrotların direncini kontrol etmek için Vm Elektrot Testi düğmesine ve Ve Elektrot Testi düğmesine basarak bir ön test gerçekleştirin. Vm < 40 mV ve Ve < 40 μA olmalıdır. Ön testten sonra 1x ND96 tampon (Bölüm 6.1) akışını ve atık pompasını kapatın.
  6. Her bir oositi 1x ND96 tamponu (Bölüm 6.1) ile doldurulmuş perfüzyon odasına (Şekil 2) yerleştirin ve oositleri, bitkisel kutupları cam tırtıl tarafından yukarı bakacak şekilde nazikçe konumlandırın. Elektrotları yavaşça oositin içine yerleştirin (Şekil 3B). Vm parametresini 0'a ve ardından Ve parametresini 0'a ayarlayın. Clamp düğmesini KAPALI'dan HIZLI'ya değiştirin. Kazanç düğmesini ~ -80 mV olarak ayarlayın.
  7. Sabit olması gereken Ve değerini kontrol edin. Değilse, iki mikroelektrottan en az birinde sızıntı vardır. Böyle bir durumda, arızalı bileşenleri yeni kılcal damarlarla değiştirin.
  8. Enjekte edilen oositlerden gelen tüm hücre akımlarını ~-80 mV'luk bir tutma potansiyelinde bir oosit kıskacı ile kaydedin (Şekil 2).
  9. Veri toplama ve analizi gerçekleştirin.
    1. 1x ND96 tamponunun akışına devam edin (Bölüm 6.1) ve atık pompasını açın.
    2. Perfüzyon sistemi yoluyla koku çözeltisi uygulaması: 1x ND96 tamponunu kapatın (Bölüm 6.1) ve koku verici çözeltiyi 10 saniye boyunca akıtın. Ardından en yüksek değeri kaydedin. Ameliyathanenin test koku maddesine tepkisini elde etmek için, temel değeri tepe değerinden çıkarın.
    3. Koku çözeltisinin akışını durdurun ve 1x ND96 tamponuna geçin (Bölüm 6.1). Oositi tampon kullanarak yıkayın, akım izi önceki koku verici stimülasyonundan geri gelene kadar. Oosit daha sonra başka bir koku verici çözelti ile uyarılmaya hazırdır. Genel olarak, 20-30 kimyasal uyarımı tespit etmek için bir oosit kullanılabilir.
      NOT: Konsantrasyona bağlı yanıtı test ederken, daha yüksek konsantrasyonlara geçmeden önce her zaman en düşük konsantrasyon uygulanmalıdır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek sensillum kayıt (SSR) tekniğini kullanarak, yakın zamanda Ae için önemli olduğu düşünülen insan kokularını belirledik. aegypti konak arama davranışı8. Bununla birlikte, Ae. aegypti'nin periferik duyu sistemindeki insan koku maddelerini algılama sürecini yönlendiren moleküler mekanizma bilinmemektedir. OR'ler çoğu böcekte koku verici ligand tespitinde önemli bir rol oynar 10,11,12. İş...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

TEVC, membran reseptörlerinin işlevini incelemek için yaygın olarak kullanılan klasik bir tekniktir. Burada sunulan prosedürle önemli ölçüde benzerlik gösteren ayrıntılı bir protokol43 yayınlanmış olmasına rağmen, burada önerilen yöntem bazı önemli değişiklikler getirmektedir. Örneğin, burada, hem OR hem de Orco'nun cRNA'sı, sentezden hemen sonra küçük hacimli numuneler halinde önceden karıştırılır ve aliquote edilir ve enjeksiyondan hemen önce parafilm üzerinde a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hiç kimse.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje, Alabama Tarımsal Deney İstasyonu (AAES) Çok Eyaletli/Hatch Hibeleri ALA08-045, ALA015-1-10026 ve ALA015-1-16009'dan NL'ye verilen bir ödülle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
24 oyuklu hücre kültürü plakasıCytoOneCC7682-7524Oosit kültürü için kullanılır
Afrika pençeli kurbağaNascoLM00535Xenopus oositlerini hasat etmek için kullanılır
Ag / AgCl tel elektrotWarner Instruments64-1282Mikroelektrotlar için kullanılır
Clampex 10.3AxonNASinyal kaydı için kullanılır
Kelepçe 10.3Akson Aletleri A.Ş.N.A.Veri analizi için kullanılır
Kollajenaz BSigma11088815001Oosit sindirimi için kullanılır
Digidata SayısallaştırıcıAxon CNSDigidata 1440AVeri toplama için kullanılır
E.Z.N.A. Plazmid DNA Mini kitiOmegaD6942-01Plazmid hazırlığı için kullanılır
Etil-M-aminobenzoat metansülfonat tuzuSigma886-86-2Kurbağaları uyuşturmak için kullanılır
Cam kılcalFHC30-30-1Mikroenjeksiyon için kullanılır
Cam kılcalWarner Instruments64-0801Mikroelektrotları hazırlamak için kullanılır
GyroMini Somunlama MikseriLabnetS0500Oosit sindirimi için kullanılır
Böcek Büyüme OdalarıCaron Ürünlerimodel 6025Oosit inkübasyonu için kullanılır
Leica MikroskopLeicaS6 DSivrisinek antenlerini kesmek için kullanılır
Işık KaynağıSchottA20500Gözlem için ışık kaynakları sağlama
Manyetik standNarishigeGJ-1Referans elektrodu tutmak için kullanılır
MikromanipülatörLeica115378Elektrotun küçük hareketi için kullanılır
Mikroboru çektirmeSuttermodel P-97Kılcal damarları çekmek için kullanılır
Mikropipet bevelerSuttermodel BV-10Kılcal damarları keskinleştirmek için kullanılır
mMESSAGE mMACHINE T7 kitiInvitrogenAM1344cRNA sentezlemek için kullanılır
Nanoject II Otomatik Nanolitre EnjektörDrummond3-000-204Mikroenjeksiyon için kullanılır
Oligo d(T)20-astarlı SuperScript IV Birinci iplikli sentez sistemiInvitrogen18091050için kullanılır cDNA sentezleme
Olympus Mikroskop OlympusSZ61Mikroenjeksiyon için kullanılır
One Shot TOP10 Kimyasal Olarak Yetkin E. coli hücreleriİnvitrojenC404003Dönüşüm için kullanılır
Oosit kelepçe amplifikatörüWarner Instrumentsmodel OC-725CTEVC kaydı için kullanılır
QIAquick jel ekstraksiyon kitiQiagen28704Jel için kullanılır arıtma
TMC Titreşim İzolasyon TablosuTMC63-500Ekipmandan gelen titreşimi izole etmek için kullanılır
TURBO DNA içermeyen kitInvitrogenAM1907RNA'daki DNaz ve diğer iyonları uzaklaştırmak için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cardé, R. T. Multi-cue integration: how female mosquitoes locate a human host. Current Biology. 25 (18), 793-795 (2015).
  2. McBride, C. S., et al. Evolution of mosquito preference for humans linked to an odorant receptor. Nature. 515 (7526), 222-227 (2014).
  3. Bernier, U. R., Kline, D. L., Barnard, D. R., Schreck, C. E., Yost, R. A. Analysis of human skin emanations by gas chromatography/mass spectrometry. 2. Identification of volatile compounds that are candidate attractants for the yellow fever mosquito (Aedes aegypti). Analytical Chemistry. 72 (4), 747-756 (2000).
  4. Bernier, U. R., Kline, D. L., Schreck, C. E., Yost, R. A., Barnard, D. R. Chemical analysis of human skin emanations: comparison of volatiles from humans that differ in attraction of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae). Journal of the American Mosquito Control Association. 18 (3), 186-195 (2002).
  5. Bernier, U. R., et al. Synergistic attraction of Aedes aegypti (L.) to binary blends of L-lactic acid and acetone, dichloromethane, or dimethyl disulfide. Journal of Medical Entomology. 40 (5), 653-656 (2003).
  6. Bernier, U. R., Kline, D. L., Allan, S. A., Barnard, D. R. Laboratory studies of Aedes aegypti attraction to ketones, sulfides, and primary chloroalkanes tested alone and in combination with L-lactic acid. Journal of the American Mosquito Control Association. 31 (1), 63-70 (2015).
  7. Okumu, F. O., et al. Development and field evaluation of a synthetic mosquito lure that is more attractive than humans. PloS one. 5 (1), 8951(2010).
  8. Chen, Z., Liu, F., Liu, N. Human odour coding in the yellow fever mosquito, Aedes aegypti. Scientific Reports. 9 (1), 1-12 (2019).
  9. Hansson, B. S., Stensmyr, M. C. Evolution of insect olfaction. Neuron. 72 (5), 698-711 (2011).
  10. Nakagawa, T., Sakurai, T., Nishioka, T., Touhara, K. Insect sex-pheromone signals mediated by specific combinations of olfactory receptors. Science. 307 (5715), 1638-1642 (2005).
  11. Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125 (1), 143-160 (2006).
  12. Carey, A. F., Wang, G., Su, C. Y., Zwiebel, L. J., Carlson, J. R. Odorant reception in the malaria mosquito Anopheles gambiae. Nature. 464 (7285), 66-71 (2010).
  13. Liu, F., Xiong, C., Liu, N. Chemoreception to aggregation pheromones in the common bed bug, Cimex lectularius. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 82, 62-73 (2017).
  14. Wang, G., Carey, A. F., Carlson, J. R., Zwiebel, L. J. Molecular basis of odor coding in the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (9), 4418-4423 (2010).
  15. Matthews, B. J., et al. Improved reference genome of Aedes aegypti informs arbovirus vector control. Nature. 563 (7732), 501-507 (2018).
  16. Costa, A. C., Patrick, J. W., Dani, J. A. Improved technique for studying ion channels expressed in Xenopus oocytes, including fast superfusion. Biophysical Journal. 67 (1), 395-401 (1994).
  17. Schreibmayer, W., Lester, H. A., Dascal, N. Voltage clamping of Xenopus laevis oocytes utilizing agarose-cushion electrodes. Pflügers Archiv. 426 (5), 453-458 (1994).
  18. Lu, T., et al. Odor coding in the maxillary palp of the malaria vector mosquito Anopheles gambiae. Current Biology. 17 (18), 1533-1544 (2007).
  19. Ditzen, M., Pellegrino, M., Vosshall, L. B. Insect odorant receptors are molecular targets of the insect repellent DEET. Science. 319 (5871), 1838-1842 (2008).
  20. Sato, K., et al. Insect olfactory receptors are heteromeric ligand-gated ion channels. Nature. 452 (7190), 1002-1006 (2008).
  21. Xia, Y., et al. The molecular and cellular basis of olfactory-driven behavior in Anopheles gambiae larvae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (17), 6433-6438 (2008).
  22. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Characterization of an enantioselective odorant receptor in the yellow fever mosquito Aedes aegypti. PLoS One. 4 (9), 7032(2009).
  23. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Insect repellents: modulators of mosquito odorant receptor activity. PLoS One. 5 (8), 12138(2010).
  24. Bohbot, J. D., Dickens, J. C. Odorant receptor modulation: ternary paradigm for mode of action of insect repellents. Neuropharmacology. 62 (5-6), 2086-2095 (2012).
  25. Hughes, D. T., Pelletier, J., Luetje, C. W., Leal, W. S. Odorant receptor from the southern house mosquito narrowly tuned to the oviposition attractant skatole. Journal of Chemical Ecology. 36 (8), 797-800 (2010).
  26. Pelletier, J., Hughes, D. T., Luetje, C. W., Leal, W. S. An odorant receptor from the southern house mosquito Culex pipiens quinquefasciatus sensitive to oviposition attractants. PloS one. 5 (4), 10090(2010).
  27. Bohbot, J. D., et al. Multiple activities of insect repellents on odorant receptors in mosquitoes. Medical and Veterinary Entomology. 25 (4), 436-444 (2011).
  28. Bohbot, J. D., et al. Conservation of indole responsive odorant receptors in mosquitoes reveals an ancient olfactory trait. Chemical Senses. 36 (2), 149-160 (2011).
  29. Leal, W. S., Choo, Y. M., Xu, P., da Silva, C. S., Ueira-Vieira, C. Differential expression of olfactory genes in the southern house mosquito and insights into unique odorant receptor gene isoforms. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (46), 18704-18709 (2013).
  30. Liu, F., Chen, Z., Liu, N. Molecular basis of olfactory chemoreception in the common bed bug, Cimex lectularius. Scientific Reports. 7, 45531(2017).
  31. Choo, Y. M., et al. Reverse chemical ecology approach for the identification of an oviposition attractant for Culex quinquefasciatus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (4), 714-719 (2018).
  32. Ruel, D. M., Yakir, E., Bohbot, J. D. Supersensitive odorant receptor underscores pleiotropic roles of indoles in mosquito ecology. Frontiers in Cellular Neuroscience. 12, 533(2019).
  33. Xu, P., Choo, Y. M., De La Rosa, A., Leal, W. S. Mosquito odorant receptor for DEET and methyl jasmonate. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (46), 16592-16597 (2014).
  34. Xu, P., et al. Odorant inhibition in mosquito olfaction. iScience. 19, 25-38 (2019).
  35. Wicher, D., et al. Drosophila odorant receptors are both ligand-gated and cyclic-nucleotide-activated cation channels. Nature. 452 (7190), 1007-1011 (2008).
  36. DeGennaro, M., et al. orco mutant mosquitoes lose strong preference for humans and are not repelled by volatile DEET. Nature. 498 (7455), 487-491 (2013).
  37. Koutroumpa, F. A., et al. Heritable genome editing with CRISPR/Cas9 induces anosmia in a crop pest moth. Scientific Reports. 6, 29620(2016).
  38. Schneider, P. N., Hulstrand, A. M., Houston, D. W. Fertilization of Xenopus oocytes using the Host Transfer Method. Journal of Visualized Experiments. (45), e1864(2010).
  39. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  40. Jones, P. L., Pask, G. M., Rinker, D. C., Zwiebel, L. J. Functional agonism of insect odorant receptor ion channels. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (21), 8821-8825 (2011).
  41. Butterwick, J. A., et al. Cryo-EM structure of the insect olfactory receptor Orco. Nature. 560 (7719), 447-452 (2018).
  42. Missbach, C., et al. Evolution of insect olfactory receptors. ELife. 3, 02115(2014).
  43. Nakagawa, T., Touhara, K. Functional assays for insect olfactory receptors in Xenopus oocytes. Pheromone signaling. , Humana Press. Totowa, NJ. 107-119 (2013).
  44. Dobritsa, A. A., Van Naters, W., Warr, C. G., Steinbrecht, R. A., Carlson, J. R. Integrating the molecular and cellular basis of odor coding in the Drosophila antenna. Neuron. 37 (5), 827-841 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Xenopus Oosit Ekspresyonuki Elektrotlu Voltaj KlempiT m H cre Ak m KaydcRNA SenteziMikroenjeksiyon Tekni iOrco Ko Resept rnsan Koku TepkisiSivrisinek Konak Aray
Video yakında

İlgili makaleler