Yöntem makalesi

Obezite Sırasında Lenfatik ve Kan Ağı Analizi

1.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61814

⸱

19 Kasım 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology and Immunology, Washington University School of Medicine, 2Université Côte d'Azur, 3Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 13, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065, 4Mediterranean Center of Molecular Medicine C3M, Team 7, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (Inserm) UMR1065

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Obezite giderek büyüyen küresel bir halk sağlığı sorunudur. Daha önce lenfatik disfonksiyon ile ilişkilendirilmiştir, bu da yağ dokusu ile lenfatik sistem arasında hayati bir karışma olduğunu düşündürmektedir. Burada, deri altı yağ dokusu içindeki kan ve lenfatik vaskülatürlerin farklı şekilde etiketlenmesine izin veren erişilebilir bir metodoloji öneriyoruz.

Özet

Lenfatik toplayıcı damarlar ve lenf düğümleri kaçınılmaz olarak yağ dokusuna gömülür. Bu gözlemin fizyolojik önemi hala açıklığa kavuşturulmamıştır. Bununla birlikte, obezite, bozulmuş lenfatik fonksiyon ve artmış damar geçirgenliği ile karakterizedir. Tersine, lenfatik disfonksiyon farelerde obeziteye neden olur ve lenfatik damarlar ile yağ dokusu arasında önemli bir etkileşim olduğunu düşündürür. Bu nedenle, lenfatik disfonksiyona yol açan faktörlerin anlaşılması, obezite ve ilişkili komorbiditeleri önlemek için yeni terapötik pencereler açabilir. Bu süreçteki ilk adım, sağlıklı ve iltihaplı yağ dokusunda lenfatik ağın kesin ve ayrıntılı bir şekilde görüntülenmesini gerektirir. Burada, lenfatik ve kan damarlarını etiketlemeye ve analiz etmeye izin veren hızlı, ucuz ve verimli bir yöntemi açıklıyoruz. Bu yaklaşım, deri altı yağ dokusu içinde cildi boşaltan brakiyal lenf nodu lokalizasyonundan yararlanır. Bu dokunun lenfatik arborizasyonu, florokrom konjuge lektinlerin deri altına enjekte edilmesiyle ortaya çıkarılabilir. Ayrıca, in vivo etiketleme yaklaşımı, lenfatik damar yoğunluğunu ve fonksiyonlarını değerlendirmek için bir yol sağlar. Kan damarı, adiposit ve bağışıklık hücresi boyaması ile birleştiğinde, protokol deri altı yağ dokusunun 3D görüntüleme ile yüksek çözünürlüklü haritalanmasına izin verir.

Giriş

Lenfatik dolaşım sistemi, doku homeostazının korunmasında ve etkili bağışıklık tepkilerinin indüksiyonunda çok önemli bir rol oynar. Lenfatik damarlar kan damarlarına paralel olarak uzanır ve interstisyel sıvıyı, metabolitleri ve bağışıklık hücrelerini lokal drenaj lenf noduna (LN) ve son olarak venöz dolaşıma1 taşır. Enfeksiyon, inflamasyon ve metabolik hastalıklar sırasında disfonksiyonel lenfatik drenaj gözlenmiştir 2,3,4,5. Lenfatik damar sistemi, lenfatik kılcal damarlar adı verilen küçük boyutlu damarlardan oluşur. Lenfatik kılcal damarlar, interstisyel sıvıyı, metabolitleri ve bağışıklık hücrelerini, özellikle dendritik hücreleri (DC'ler) ve T hücrelerini, lenfatik kılcal lümene girişi kolaylaştıran açık bağlantılar ("düğme benzeri" bağlantılar) ile karakterize edilen tek bir ince lenfatik endotel hücresi (LEC) tabakasından oluşur5. Lenfatik kılcal damarlar, lenfatik toplayıcı damarlar adı verilen daha büyük damarlara birleşir. Lenfatik toplayıcılar, otonom kasılma tonusu sağlayan ve sıvı akışını koruyan bir kas tabakası ile çevrili bir LEC tabakası ile karakterize edilir5. Ayrıca, toplama damarları tek yönlü bir lenf akışı sağlayan valflere sahiptir.

Kollektörlerin ve kılcal damarların LEC'leri, onları kan endotel hücrelerinden (BEC'ler) ayıran belirli bir dizi belirteç ifade eder. Bu faktörler arasında Prox1, LEC üretimine rehberlik eden bir transkripsiyon faktörüdür ve BEC'lerde yokken LEC'lerde yüksek oranda ifade edilir. Prox1'in LEC'lerin biyolojisindeki kritik katılımı, Prox1 eksikliği olan farelerin6 üretilmesi ve analizi ile gösterilmiştir. Prox1 heterozigot fareler, azalmış lenfatik damar yoğunluğu ve artmış vasküler geçirgenlik6 ile karakterize kusurlu bir lenfatik vasküler sistem gelişimine sahiptir. LEC'ler VEGFR3, Podoplanin ve CCL215'i yüksek oranda eksprese eder. Bu belirteçler BEC'lerde bulunmaz ve lenfatik ve kan damarları ağını ayrı ayrı analiz etmeye izin verir. Lyve1, toplama damarlarındayokken lenfatik kılcal damarlar tarafından seçici olarak eksprese edilir 5.

Mitokondriyal içeriklerine ve sonraki renklerine göre üç tip yağ dokusu tanımlanmıştır. Mitokondri açısından zengin termojenik kahverengi yağ dokusu, soğuğa maruz kalma sırasında önemli bir rol oynar ve farelerde interskapular bölgede bulunur 7,8. Beyaz ve bej adipositler daha düşük mitokondriyal yoğunluğa sahiptir ve esas olarak lipit damlacıkları şeklinde enerji depolamasında rol oynarlar. Beyaz ve bej adipositler viseral ve subkutan depolardabulunur 9.

Klinik gözlemler obezite ve lenfatik disfonksiyon arasında bir bağlantı kurmuştur10. Obezite, yağ dokusu lenfatik vaskülatüründe morfolojik değişikliklere neden olur ve lenf transportunun bozulmasına yol açar11. Klinik öncesi modellerde elde edilen veriler, Yüksek Yağlı Diyetin (HFD) lenfatik yeniden şekillenmeye neden olduğunu ve obez farelerin daha küçük lenf düğümlerine ve daha az sayıda lenfatik damara sahip olduğunu ortaya koymuştur12. Bununla birlikte, bu fenotipi yöneten kesin moleküler mekanizmalar açıklığa kavuşturulmayı beklemektedir. Obezite sırasında LEC'lerin tutulumu, lenfatik damar gelişimi bozulmuş genetik modellerdeki gözlemlerle daha da desteklenmektedir. Daha önce tartışıldığı gibi, Prox1 heterozigot fareler (Prox1 +/-) kötü işleyen bir lenfatik sistem sunar ve Prox1 yeterli hayvanlara kıyasla tesadüfen aşırı viseral yağ dokusu birikimi geliştirir6. İlginç bir şekilde, bu yağ dokusu fenotipi, lenfatik fonksiyonunrestorasyonu ile kurtarılır 13. Birlikte, bu sonuçlar lenfatik damarlar ve yağ dokusu arasında daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan güçlü bağlantıları gün ışığına çıkarmıştır.

Obezitenin ayırt edici bir özelliği olan inflamasyon bağlamında, LEC ve BEC belirteçlerinin değişmiş ekspresyonu, bu hücrelerin klasik antikor boyaması yoluyla analizini tehlikeye atar14,15. Özellikle LEC'leri ve BEC'leri etiketlemek için genetik modeller geliştirilmiştir ve bu sorunu hafifletmeye izin verir 16,17,18,19. Bununla birlikte, genetik raportör hatlarının kullanımı, birden fazla ıslah aşaması gerektirir ve bir projenin uzunluğunu ve maliyetini önemli ölçüde artırır. Bu nedenle, deri altı yağ dokusundaki kan ve lenfatik dolaşım sistemlerini araştırmak için florokrom konjuge lektin enjeksiyonlarının kullanılmasını öneriyoruz, bu basit ve nispeten pahalı olmayan bir yaklaşımdır. Çeşitli florokromlara konjuge lektin ticari olarak temin edilebilir ve kan damarlarını etiketlemek için intravenöz olarak veya deri altı yağ dokusuna gömülü cildi boşaltan lenfatik damarları etiketlemek için deri altına enjekte edilebilir. Bu yaklaşım, her enjeksiyon için ayrı florokrom-lektin konjugatlarının kullanılmasına dayanır ve her bir vaskülatürün farklı şekilde etiketlenmesine izin verir. Bu yöntem aynı zamanda lenfatik veya kan damar sistemi ağını etiketlemek için genetik modellerin kullanılmasıyla da uyumludur. Daha da önemlisi, deri altı yağ dokusunun ve onu perfüze eden kan ve lenfatik damar sistemlerinin genel sağlık durumunu analiz etmek için çoklu okumalar sağlar. Bu prosedür, sedef hastalığı ve enfeksiyonlar dahil olmak üzere akut ve kronik cilt hastalıkları sırasında lenfatik ve kan damar sistemi ağlarını analiz etmek için kolayca uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri yerel etik kurullara uygun olarak gerçekleştirilmiştir.

NOT: Prox1-cre-ERT2 (Prox1tm3(cre/ERT2)Gco/J, Jax #022075) ve Rosa26-LSL-tdTomato (B6. Cg-Gt (ROSA) 26Sortm9 (CAG-tdTomato) Hze / J, Ai9, Jax # 007914) Jackson Laboratuvarı'ndan elde edildi ve indüklenebilir lenfatik raportör fare hattı Prox1-cre-ERT2::tdTomato'yu elde etmek için çaprazlandı. Fareler, 10 nesil boyunca C57BL / 6 arka planına geri çaprazlandı. Altı haftalık Prox1-cre-ERT2::tdTomato erkek farelere 3 hafta boyunca tamoksifen diyeti uygulandı. Envigo Teklad'dan tamoksifen diyeti (diyet no. TD.130857; 500 mg / kg) kullanıldı. Deneyler 12-14 haftalık farelerde yapıldı. Bu protokol herhangi bir yaş, cinsiyet veya suştaki fareler için geçerlidir.

1. Malzeme hazırlama

  1. Makasları, forsepsleri ve diseksiyon pimlerini %70 etanol kullanarak sterilize edin.
  2. 25 ila 27 gauge iğneli iki adet 1 mL şırınga hazırlayın. Deri altı enjeksiyon için, üst ayak pedine 10 μL enjekte etmek için bir mikro şırınga kullanmanızı öneririz.
  3. 1,5 mL'lik plastik bir tüpte, 100 μg/mL'lik bir nihai konsantrasyonda steril PBS içinde seyreltilmiş 200 μL DyLight 488-konjuge lektin hazırlayın.
  4. Başka bir plastikte, 1.5 mL'lik tüp, 100 μg / mL'lik bir nihai konsantrasyonda steril PBS içinde seyreltilmiş 100 μL DyLight 649 konjuge lektin hazırlar.
  5. PBS içeren 6 oyuklu bir plaka hazırlayın ve buz üzerinde tutun.
  6. % 4 paraformaldehit ve% 30 sükroz çözeltisi hazırlayın.

2. Deri altı yağ dokusu, kan ve lenfatik damarların etiketlenmesi.

  1. % 5 izofluran soluyarak fareyi uyuşturun. İşlem sırasında hayvanın zarar görmemesini sağlamak için hayvanın pençesini sıkıca sıkıştırarak anestezi derinliğini değerlendirin. Anestezi, lektin enjeksiyon adımlarının sonuna kadar veya ötenaziye kadar sürdürülmelidir.
  2. Kan damarını etiketlemek için kuyruk damarına intravenöz olarak 100 μL DyLight 488 konjuge lektin enjekte edin. Doku toplamaya devam etmeden önce 15 dakika bekleyin.
  3. Farklı bir şırınga kullanarak, boşalan lenfatik damarları etiketlemek için hayvanın üst ayak pedine deri altına 10 μL DyLight 649 konjuge lektin enjekte edin. Doku toplamaya devam etmeden önce 15 dakika bekleyin.
  4. Enjeksiyondan 15 dakika sonra servikal çıkık veya CO2'ye maruz bırakarak fareyi ötenazi yapın.

3. Deri altı yağ dokusunun toplanması

  1. Fareyi bir diseksiyon tahtasının üzerine sırt üstü yatırın.
  2. Farenin kürkünü% 70 etanol kullanarak sterilize edin.
  3. Forseps kullanarak kanadın derisini kaldırın ve brakiyal yağ pedini ortaya çıkarmak için enine bir kesi yapın.
  4. Brakiyal yağ dokusu deposundan ayırmak için cildi nazikçe çekin, böylece lenf nodu ve lenfatik toplayıcı damarı içeren tüm deri altı brakiyal yağ dokusunu ortaya çıkarın.
  5. Forseps ve makas kullanarak, deri altı yağ depolarını nazikçe çıkarın ve bunları soğuk PBS içeren bir tabağa aktarın. En iyi sonuçlar için, yağ depolarını tek parça olarak çıkarmanızı öneririz.
  6. Buradan itibaren dokuyu ışıktan koruyun.

4. Doku fiksasyonu

  1. Hasat edilen dokuyu %4 paraformaldehit ve %30 sükroz içeren bir çözeltiye batırın.
  2. Dokuyu görüntüleme için hazırlamadan önce en az gece boyunca bu solüsyonda inkübe edin.

5. Boyama ve görüntüleme

  1. En iyi sonuçlar için, Gilleron ve meslektaşları20 tarafından tarif edildiği gibi doku temizleme ve 3D konfokal edinim gerçekleştirin. Büyük dokuların analizi için bir ışık tabakası mikroskobu kullanmanızı öneririz. Temizleme işlemi sırasında ek boyama yapılabilir.
  2. En iyi doku haritalamasını elde etmek için aşağıdaki antikorların kullanılması:
    Adipositler için: Perilipin
    Makrofajlar için: CD68 ve CD11b boyama.
    Dendritik hücreler için: MHC II ve CD11b.
    B hücreleri için: B220 (CD45R) boyama.
    T hücreleri için: CD3 boyama.
    NOT: Bu yöntem, bağışıklık hücrelerini etiketlemek için genetik modellerin kullanımıyla uyumludur.
  3. Lenfatik kollektör damarının intravital 2-foton mikroskobu ile analizi için, lektini alt ayak pedine deri altına enjekte edin ve popliteal lenfatik toplama damarını görselleştirin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Brakiyal yağ dokusu kanı ve lenfatik damar ağlarının topolojik analizini yapmak için subkutan olarak Alexa Fluor 649-konjuge lektin ve intravenöz olarak enjekte edilen Alexa Fluor 488-konjuge lektin enjekte edildi. Brakiyal yağ dokusu dikkatli bir şekilde eksize edildi, fikse edildi, temizleme protokolüne tabi tutuldu ve tam mount boyama ile analiz edildi. Prosedürün şematik bir gösterimi Şekil 1A'da yer almaktadır. Kan damarları yeşil renkle işaretlenmiştir ve lenfatikler kırmızı renktedir....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu yaklaşım, deri altı yağ dokusunun kan ve lenfatik vaskülatürlerinin verimli ve sağlam bir şekilde etiketlenmesini sağlar. Kan ve lenfatik endotel ağlarının ayrı ayrı analizi, obezite veya diğer patolojik durumlar sırasında dolaşım sistemlerinden birini veya her ikisini etkileyen patolojik mekanizmaları çözebilir. Bu protokol, vasküler sistemlerin mimarisini, stromal ve immün hücrelerle etkileşimlerini ve sağlık ve hastalık sırasındaki işlevselliklerini analiz etmeyi amaçlamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların beyan edecek herhangi bir açıklama ve çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

SI, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM) ve Agence Nationale de la Recherche (ANR-17-CE14-0017-01 ve ANR-19-ECVD-0005-01) tarafından desteklenmektedir. AG, Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından ANR-15-IDEX-01 referans numarasıyla yönetilen UCAJedi Geleceğe Yatırım projeleri aracılığıyla Fransız hükümeti tarafından desteklenmektedir. RSC, Lawrence C. Pakula, MD IBD Eğitim ve İnovasyon Fonu'ndan FA-2020-01-IBD-1 tarafından desteklenmektedir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lectin DyLight 649Vector LabsDL-1178-1Protokolde açıklanmıştır
Lectin DyLight 488Vector LabsDL-1174Protokolde açıklanmıştır
ParaformaldehitVWR Chemicals9713.1000
SükrozEuromedexCAS Numarası 57-50-1
Anti-PodoplaninAngioBio11-033Seyreltme: 1/50
Lectin DyLight 594Vektör LaboratuvarlarıDL-1177
Anti-MHCII protokolünde açıklanmıştır (Klon M5 / 114.15.2)Biolegend107618Seyreltme : 1/100
Anti-CD11b (Klon M1 / 70)Biolegend101218Seyreltme : 1/100
Anti-CD68 (Klon FA.11)Biolegend137004Seyreltme : 1/100
Anti-B220 (Klon RA3-6B2)Biolegend103225Seyreltme : 1/100
Anti-Perilipin (Klon PERI 112.17)Progen651156Seyreltme : 1/50
Anti-CD3 (Klon 17A2)Biolegend100210Seyreltme : 1/100

Kaynaklar

  1. Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. Journal of Experimental Medicine. 204 (10), 2349-2362 (2007).
  2. Fonseca, D. M., et al. Microbiota-Dependent Sequelae of Acute Infection Compromise Tissue-Specific Immunity. Cell. 163 (2), 354-366 (2015).
  3. Thomas, S. N., et al. Impaired humoral immunity and tolerance in K14-VEGFR-3-Ig mice that lack dermal lymphatic drainage. The Journal of Immunology. 189 (5), 2181-2190 (2012).
  4. Kuan, E. L., et al. Collecting lymphatic vessel permeability facilitates adipose tissue inflammation and distribution of antigen to lymph node-homing adipose tissue dendritic cells. The Journal of Immunology. 194 (11), 5200-5210 (2015).
  5. Randolph, G. J., Ivanov, S., Zinselmeyer, B. H., Scallan, J. P. The Lymphatic System: Integral Roles in Immunity. Annual Review of Immunology. 35, 31-52 (2017).
  6. Harvey, N. L., et al. Lymphatic vascular defects promoted by Prox1 haploinsufficiency cause adult-onset obesity. Nature Genetics. 37 (10), 1072-1081 (2005).
  7. Kajimura, S., Spiegelman, B. M., Seale, P. Brown and Beige Fat: Physiological Roles beyond Heat Generation. Cell Metabolism. 22 (4), 546-559 (2015).
  8. Wu, J., Cohen, P., Spiegelman, B. M. Adaptive thermogenesis in adipocytes: is beige the new brown. Genes and Development. 27 (3), 234-250 (2013).
  9. Cinti, S. The adipose organ. Prostaglandins, Leukotrienes & Essential Fatty Acids. 73 (1), 9-15 (2005).
  10. Kataru, R. P., et al. Regulation of Lymphatic Function in Obesity. Frontiers in Physiology. 11, 459(2020).
  11. Escobedo, N., Oliver, G. The Lymphatic Vasculature: Its Role in Adipose Metabolism and Obesity. Cell Metabolism. 26 (4), 598-609 (2017).
  12. Weitman, E. S., et al. Obesity impairs lymphatic fluid transport and dendritic cell migration to lymph nodes. PLoS One. 8 (8), 70703(2013).
  13. Escobedo, N., et al. Restoration of lymphatic function rescues obesity in Prox1-haploinsufficient mice. JCI Insight. 1 (2), (2016).
  14. Commerford, C. D., et al. Mechanisms of Tumor-Induced Lymphovascular Niche Formation in Draining Lymph Nodes. Cell Reports. 25 (13), 3554-3563 (2018).
  15. Gregory, J. L., et al. Infection Programs Sustained Lymphoid Stromal Cell Responses and Shapes Lymph Node Remodeling upon Secondary Challenge. Cell Reports. 18 (2), 406-418 (2017).
  16. Ivanov, S., et al. CCR7 and IRF4-dependent dendritic cells regulate lymphatic collecting vessel permeability. Journal of Clinical Investigation. 126 (4), 1581-1591 (2016).
  17. Zhong, W., et al. Prox1-GFP/Flt1-DsRed transgenic mice: an animal model for simultaneous live imaging of angiogenesis and lymphangiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 581-598 (2017).
  18. Choi, I., et al. Visualization of lymphatic vessels by Prox1-promoter directed GFP reporter in a bacterial artificial chromosome-based transgenic mouse. Blood. 117 (1), 362-365 (2011).
  19. Pham, T. H., et al. Lymphatic endothelial cell sphingosine kinase activity is required for lymphocyte egress and lymphatic patterning. Journal of Experimental Medicine. 207 (1), 17-27 (2010).
  20. Gilleron, J., et al. Exploring Adipose Tissue Structure by Methylsalicylate Clearing and 3D Imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  21. Ivanov, S., Merlin, J., Lee, M. K. S., Murphy, A. J., Guinamard, R. R. Biology and function of adipose tissue macrophages, dendritic cells and B cells. Atherosclerosis. 271, 102-110 (2018).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lenfatik DamarlarKan DamarlarAdipoz DokuSubk tan Adipoz DokuLenf Nod localizationuFlorokrom Konjuge Lektinler3B G r nt lemeDamar Yo unlu u AnaliziObezite ModeliLenfatik Fonksiyon
Video yakında

İlgili makaleler