Bu protokol, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngüleri kullanılarak kültürlü hücreler veya tek fare beyinleri gibi küçük/orta ölçekli kaynaklardan tübulin saflaştırmayı açıklar. Saflaştırılmış tubulin belirli izotiplerde zenginleştirilmiştir veya spesifik posttranslational modifikasyonlara sahiptir ve mikrotübül dinamiklerini ve etkileşimlerini incelemek için in vitro rekonsiyel testlerinde kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Mikrotübül sitoskeleton çalışmalarının önemli bir yönü, in vitro rekonseptüs deneylerinde mikrotübül davranışının araştırılmasıdır. Dinamikler gibi mikrotübüllerin içsel özelliklerinin ve mikrotübül ilişkili proteinlerle (VIP' ler) etkileşimlerinin analizine izin verirler. "Tübulin kodu", mikrotübül özelliklerinin ve işlevlerinin düzenleyicileri olarak farklı tubulin izotiplerine ve çeşitli posttranslational değişikliklere (PTM' ler) işaret eden gelişmekte olan bir kavramdır. Tübulin kodunun moleküler mekanizmalarını keşfetmek için, belirli izotiplere ve PTM'lere sahip saflaştırılmış tubulin kullanarak in vitro rekonste deneyleri yapmak çok önemlidir.
Bugüne kadar, in vitro deneylerde yaygın olarak kullanılan, birçok PTM'yi barındıran ve tanımlanmış bir izotip bileşimine sahip olan beyin tübulini teknik olarak zordu. Bu nedenle, tübulini farklı kaynaklardan ve farklı izotip bileşimleri ve kontrollü PTM'lerden arındırmak için, polimerizasyon ve depolimerizasyon döngülerinin klasik yaklaşımını kullanarak bu protokolü geliştirdik. Benzeşim saflaştırmasına dayanan mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu yaklaşım saf, polimerizasyona yetkin tübulin verir, çünkü polimerizasyona veya depolimerizasyona dirençli tübulin ardışık saflaştırma adımları sırasında atılır.
Tübulinin hücre çizgilerinden arındırılmasını, süspansiyonda veya bağlı kültürler olarak ve tek fare beyinlerinden tanımlarız. Yöntem ilk olarak hem süspansiyon hem de yapışık ayarlarda hücre kütlesinin neslini, lizis adımını, ardından polimerizasyon-depolimerizasyon döngüleri ile tübulin saflaştırmanın ardışık aşamalarını açıklar. Yöntemimiz, tübulin kodunun mikrotübüllerin içsel özellikleri ve ilişkili proteinlerle mikrotübül etkileşimleri üzerindeki etkisini ele alan deneylerde kullanılabilecek tübulin verir.
Giriş
Mikrotübüller birçok hücresel işlemde kritik roller oynar. Hücrelere şekillerini verirler, kromozom ayrımı için meiotik ve mitotik iğler oluştururlar ve hücre içi taşıma için izler görevi ederler. Bu farklı işlevleri yerine getirmek için mikrotübüller kendilerini farklı şekillerde düzenlerler. Alandaki merak uyandırıcı sorulardan biri, yapısal ve evrimsel olarak korunmuş mikrotübüllerin bu organizasyon ve işlev bolluğuna uyum sağlamasını sağlayan moleküler mekanizmaları anlamaktır. Potansiyel mekanizmalardan biri, 'tübulin kodu'1,2,3olarak bilinen kavram tarafından tanımlanan....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvan bakımı ve bu çalışma için kullanımı Avrupa Topluluğu'nun önerileri doğrultusunda (2010/63/UE) gerçek gerçekleştirildi. Deneysel prosedürler, Uluslararası yönergelere uygun olarak Institut Curie CEEA-IC #118 etik komitesi (Ulusal Otorite tarafından verilen 04395.03 yetki) tarafından özel olarak onaylanmıştır.
1. Tübulin Saflaştırması için Reaktiflerin Hazırlanması
NOT: Tübulin saflaştırması için kullanılan tüm tamponlar potasyum tuzları içermeli ve sodyum tuzları içermemelidir30.
- Tam ortamın 1 L'sini hazırlayın: Dulbecco'nun modifiye Kartal ortamı (DMEM), %10 fetal sığır se....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yöntemin temel amacı, saflaştırılmış bileşenlerle tekrarlanan in vitro deneyler yapmak için yeterli miktarlarda yüksek kaliteli, montaja yetkin tubulin üretmektir. Bu tübulinden monte edilen mikrotübüller, dinamik veya kararlı mikrotübüller ile toplam iç yansıma floresan (TIRF) mikroskopi tekniğine dayalı rekonstrüt tahlillerinde, mikrotübül dinamiklerini test eden deneylerde, MAP'ler veya moleküler motorlarla etkileşimlerde ve motorlar tarafından kuvvet üretiminde kullanılabilir25. Ayrıca mikr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada açıklanan yöntem, hücre çizgilerinden ve tek fare beyinlerinden orta-büyük miktarlarda hızlı bir şekilde yüksek kaliteli, montaj yetkin tubulin üretmek için bir platform sağlar. Uzun yıllardır sahada kullanılan sığır beyinlerinden tübulin saflaştırmanın altın standart protokolüne dayanmaktadır16,17. Yaklaşımın özel bir avantajı, kurulduktan sonra çok az uygulamalı zaman gerektirirken büyük miktarlarda hücre üreten HeLa S3 hücrelerinin süspansiyon kültürler.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma ANR-10-IDEX-0001-02, LabEx Cell'n'Scale ANR-11-LBX-0038 ve Institut de convergence Q-life ANR-17-CONV-0005 tarafından desteklenmiştir. CJ, Institut Curie tarafından desteklenmektedir, Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) ANR-12-BSV2-0007 ve ANR-17-CE13-0021 ödüllerini, Institut National du Cancer (INCA) hibe 2014-PL BIO-11-ICR-1 ve Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) hibe DEQ20170336756. MMM, Fondation Vaincre Alzheimer hibeSI FR-16055p ve Fransa Alzheimer hibesi AAP SM 2019 n°2023 tarafından desteklenmektedir. JAS, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 675737 ve FRM hibe FDT201904008210 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve yen....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 M MgCl2 | Sigma | #M1028 | |
| 1-L hücre kültürü kapları | Techne F7610 | Eğirme kültürleri için kullanılır. Boş döner şişelerini asla karıştırmayın. Döndürücü şişeler hücre kültürü inkübatöründeyken, ortamın inkübatörle dengelenmesini kolaylaştırmak için döner şişelerin yan valflerini her zaman hafifçe açık tutun. s atmosferi. Kullandıktan sonra, şişe duvarlarında kalan hücrelerin kurumasını önlemek için döner şişeleri hemen musluk suyuyla doldurun. Şişeleri deiyonize su ile yıkayın, yaklaşık 200 ml deiyonize su ekleyin ve otoklav yapın. Steril bir hücre kültürü başlığı altında suyu çıkarın ve şişelerin birkaç saat boyunca hala kaputun altında tamamen kurumasını bekleyin. Döner şişeleri temizlemek için asla deterjan kullanmayın, çünkü eser miktarda deterjan hücrelere zararlı olabilir. | |
| 1,5 ve 2 ml'lik | |||
| 14 ml'lik yuvarlak tabanlı tüpler | |||
| 15 cm çapında steril kültür kapları | |||
| 15 ml'lik vidalı kapaklı tüpler | |||
| 2-merkaptoetanol ve nbsp; | Sigma | #M3148 | 2-merkaptoetanol toksiktir ve kaputun altında kullanılmalıdır. |
| 4-(2-aminoetil)-benzensülfonil florür | Sigma | ||
| #A8456 %40 Akrilamid | Biyo-Rad | # 161-0140 | |
| 5, 10- 20 ml şırıngalar | |||
| 5 ml, 10 ml, 25 ml steril pipetler | |||
| 50 ml vidalı kapaklı tüpler | |||
| Amonyum persülfat (APS) | Sigma | #A3678 | |
| Anti-alfa-tubulin antikoru, 12G10 | J. Frankel ve M. Nelson tarafından geliştirilen, Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası'ndan elde edilen, NICHD'nin himayesinde geliştirilen ve Iowa | sürdürülen seyreltme: 1/500 | |
| Anti-glutamillenmiş tübülin antikoru, GT335 ve nbsp; | AdipoGen | #AG-20B-0020 | seyreltme: 1 / 20.000 |
| Aprotinin ve nbsp; | Sigma | ||
| Terazi (0,1 – 10 g) | |||
| Beckman 1-l polipropilen şişeler | Eğirme kültürlerini toplamak için | ||
| Beckman Avanti J-26 XP santrifüj | Eğirme kültürlerini toplamak için | ||
| Biyolojik karıştırıcı | Techne MCS-104L | Hücre kültürü inkübatörüne (spinner kültürleri için), Hela S3 ve HEK 293 hücreleri için 25 rpm | |
| Bis N,N'-Metilen-Bis-Akrilamid | Biyo-Rad | #161-0201 | |
| Blender IKA Ultra-Turrax® | Beyin dokusunu parçalamak için, makine 6 veya 7 gücüne ayarlıyken 5 mm'lik prob kullanın. Beyin dokusunu buz üzerinde 15 saniye boyunca 2-3 kez karıştırın. | ||
| Sığır serum albümini (BSA) | Sigma | ||
| Bromofenol mavisi | Sigma | # 1.08122 | |
| Karboksipeptidaz A (CPA) | Sigma | #C9268 | Konsantrasyonu: 1.7 & nbsp; U/&mikro; l |
| Hücre kültürü davlumbazı | |||
| Hücre kültürü inkübatörü 37 ° C'de ayarlanmıştır; C,% 5 CO2 | |||
| Dimetil sülfoksit (DMSO) | Sigma | #D8418 | DMSO, diğer bileşiklerin hücre ve cilt geçirgenliğini artırabilir. Temastan kaçının ve cilt ve göz koruması kullanın. |
| DMEM ortamı | Yaşam Teknolojileri | #41965062 | |
| DTT, DL-Ditiyotreitol | Sigma | ||
| EDTA | Euromedex | #EU0007-C | |
| EGTA | Sigma | ||
| Etanol mutlak | Fisher Kimya | #E/0650DF/15 | |
| Fetal sığır serumu (FBS) | Sigma | ||
| Fransız basınç hücresi presi | Termo elektron şirketi | & nbsp; #FA-078A | , bir #FA-032 hücreli; büyük miktarlarda hücreleri parçalamak için. Orta orana ayarlayın ve 1.000 psi'lik gösterge basıncı (bozulma odasının içindeki 3.000 psi'ye karşılık gelir). |
| Gliserol | VWR Kimyasalları | #24388.295 | |
| Glisin | Sigma | #G8898 | |
| GTP | Sigma | ||
| Isıtma bloğu | Stuart | ||
| Hela hücreleri | ATCC® CCL-2 ve ticaret; | ||
| Hela S3 hücreleri | ATCC | ATCC® CCL-2.2 ve ticaret; | |
| Hidroklorik asit (HCl) VWR | # 20252.290 | ||
| Ters mikroskop | Floresan ile hücre transfeksiyonu doğrulanacaksa | ||
| İzopropanol | VWR | #20842.298 | |
| jetPEI | Polyplus | #101 | |
| JLA-8.1000 rotor | İplikçi kültürleri toplamak için | ||
| KOH | Sigma | #P1767 | KOH aşındırıcıdır ve yanıklara neden olur; göz ve cilt koruması kullanın. |
| L-Glutamin | Yaşam Teknolojileri | #25030123 | |
| 50 ml'lik tüpler için laboratuvar santrifüjü | Sigma | 4-16 K | |
| Leupeptin | Sigma | #L2884 | |
| Sıvı azot ve nbsp; | |||
| Mikro pipetler p2.5, p10, p20, p100, p200 ve p1000 ve karşılık gelen uçlar | |||
| Micropestles | Eppendorf | #0030 120.973 | |
| Fare beyin dokusu | Bu çalışma için hayvan bakımı ve kullanımı Avrupa Topluluğu'nun (2010/63/UE) tavsiyelerine uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Deneysel prosedürler, Institut Curie CEEA-IC #118 (Ulusal Otorite tarafından verilen yetki no. 04395.03) etik komitesi tarafından uluslararası yönergelere uygun olarak özel olarak onaylanmıştır. | ||
| İğneler 18G x 1 & frac12; ” (1,2 X 38 mm | Terumo | #18G | |
| İğneler 20G x 1 & frac12; ” (0,9 X 38 mm | Terumo | #20G | |
| İğneler 21G x 4 ¾ ” (0,8 X 120 mm | B.Braun | #466 5643 | |
| Parafilm | |||
| PBS | Yaşam Teknolojileri | #14190169 | |
| Penisilin-Streptomisin | Yaşam Teknolojileri | #15140130 | |
| pH-metre | |||
| Fenilmetansülfonil florür (PMSF) | Sigma | #P7626 | PMSF tozu tehlikelidir. PMSF solüsyonlarını hazırlarken cilt ve göz koruması kullanın. |
| BORULAR | Sigma | ||
| Pipet Boy | |||
| Rotorları | Beckman 70.1 Ti; TLA-100.3; ve TLA 55 | ||
| SDS-PAGE elektroforez ekipmanı | Biyo-Rad | ||
| SDS, Sodyum dodesil sülfat | VWR | #442444H | Laemmeli tamponu hazırlamak için |
| SDS, Sodyum dodesil sülfat | Sigma | #L5750 | 'TUB' SDS-PAGE jelleri hazırlamak için |
| Sonicator | Branson | # 101-148-070 | Yapışık kültürler olarak yetiştirilen hücreleri parçalamak için kullanılır. 6,5 mm çapında prob kullanın, sonikatörü " konumuna getirin Çıkış kontrolü" 1, " Görev döngüsü" Kullanılan hücre tipine bağlı olarak %10 ve zaman. |
| 1.5 ml tüpler için masa üstü santrifüj | Eppendorf | 5417R | |
| TEMED, N, N, N′, N′-Tetrametiletilendiamin | Sigma | # 9281 | |
| Trichostatin A (TSA) | Sigma | #T8552 | |
| Triton X-100 ve nbsp; | Sigma | ||
| Trizma tabanı (Tris) | Sigma | ||
| Tripsin | Yaşam Teknolojileri | #15090046 | |
| Ultrasantrifüj rotorları | TLA-55, TLA-100.3 ve 70.1 Ti rotorlar | 4 derece olarak ayarlanmış; C veya 30° Deneyin ihtiyacına göre C | |
| Ultrasantrifüj tüpleri | Beckman | #357448 | TLA-55 rotor ile kullanım için |
| Ultrasantrifüj tüpleri | TLA-100.3 rotorlu | Beckman | # 349622 |
| & | Beckman | #355631 | 70.1 Ti rotor ile kullanım için |
| Ultrasantrifüjler | Beckman | Optima L80-XP (veya eşdeğeri) ve Optima MAX-XP (veya eşdeğeri) | 4 derece olarak ayarlayın; C veya 30° Deneyin ihtiyacına göre C |
| Vorteks karıştırıcı | |||
| Şamandıralar veya tüp tutucular | 30 ° C'ye ayarlayın; C |
Kaynaklar
- Verhey, K. J., Gaertig, J. The tubulin code. Cell Cycle. 6 (17), 2152-2160 (2007).
- Janke, C. The tubulin code: Molecular components, readout mechanisms, and functions. Journal of Cell Biology. 206 (4), 461-472 (2014).
- Janke, C., Magiera, M. M.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
