PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Eduardo Hilario; Li Fan; Leonard  J. Mueller; Michael  F. Dunn

doi:10.3791/61839

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61839

⸱

26 Eylül 2020

Eduardo Hilario¹ , Li Fan² , Leonard J. Mueller¹ , Michael F. Dunn²

¹Department of Chemistry, University of California-Riverside, ²Department of Biochemistry, University of California-Riverside

Bu makalede

Özet

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

Özet

Salmonella tiphimurium'dan triptofan sintaz (TS) bienzim kompleksi (α₂β₂ TS) ile yapılan yapısal çalışmalar, katalitik mekanizmasını, allosterik davranışını ve PLP'ye bağımlı enzimlerde substratın ürüne enzimatik dönüşümünün ayrıntılarını daha iyi anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, yalıtılmış α ve yalıtılmış β alt birliğini üretmek için yeni bir ifade sistemi, yüksek miktarda saf alt birim ve α₂β₂StTS kompleksinin izole alt birli dış birimlerden 2 gün içinde arındırılmasına izin etti. Saflaştırma, benzeşim kromatografisi ve ardından benzeşim etiketinin bölünmesi, amonyum sülfat çökeltme ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Enzim β-sitedeki anahtar kalıntılarının rolünü daha iyi anlamak için, önceki yapısal çalışmalarda bölgeye doğrudan mutajensis yapıldı. Vahşi tip ve mutant α₂β₂StTS kompleksini arındırmak için başka bir protokol oluşturuldu. Amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve SEC kullanılarak basit, hızlı ve verimli bir protokol, α₂β₂StTS kompleksinin tek bir günde arındırılmasına izin sağladı. Bu çalışmada açıklanan her iki saflaştırma protokolü, saflaştırma protokolü boyunca α₂β₂StTS kompleksini kristalize etmek için PEG 8000 ve spermin kullanarak aynı kompleksi arındırmak için önceki protokollerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir. Vahşi tip ve bazı mutant formlarının kristalleşmesi, peg 8000 ve spermin kullanarak bazı mutantların saflaşmasını bozan biraz farklı koşullar altında gerçekleşir. X-ışını kristalografik çalışmalarına uygun kristalleri hazırlamak için kristalizasyon, kristal kalitesi ve kriyoproteksiyonu optimize etmek için çeşitli çabalar sarfedildi. Burada sunulan yöntemler genellikle triptofan sintaz alt biraları ve vahşi tip ve mutant α₂β₂StTS komplekslerinin saflaştırılması için uygulanmalıdır.

Giriş

Triptofan sintaz (TS) bienza kompleksi (α₂β_2),bakteri, bitki ve mantarlarda L-Triptofan amino asidinin biyosentezinde son iki adımı katalizleyen allosterik bir^enzimdir. Salmonella enterica serovar typhimurium (St) bakterisi insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) olmadığından, S'nin inhibisyonu. tifüs α₂β₂ TS kompleksi (α₂β₂StTS) kriptosporidiosis ve tüberküloz tedavisi ....