PCR Mutagenezi, Klonlama, İfade, Hızlı Protein Saflaştırma Protokolleri ve Triptofan Synthase'in Vahşi Tipinin ve Mutant Formlarının Kristalizasyonu

Özet

Bu makale, Salmonella tiphimurium triptofan sintazının ekspresyonu ve saflaştırılması için bir dizi ardışık yöntem sunar, bu protokol protein kompleksini bir günde arındırmak için hızlı bir sistemdir. Kapsanan yöntemler escherichia coliprotein ekspresyözü, benzeşim kromatografisi, jel filtrasyon kromatografisi ve kristalizasyondur.

Özet

Salmonella tiphimurium'dan triptofan sintaz (TS) bienzim kompleksi (α₂β₂ TS) ile yapılan yapısal çalışmalar, katalitik mekanizmasını, allosterik davranışını ve PLP'ye bağımlı enzimlerde substratın ürüne enzimatik dönüşümünün ayrıntılarını daha iyi anlamak için gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada, yalıtılmış α ve yalıtılmış β alt birliğini üretmek için yeni bir ifade sistemi, yüksek miktarda saf alt birim ve α₂β₂StTS kompleksinin izole alt birli dış birimlerden 2 gün içinde arındırılmasına izin etti. Saflaştırma, benzeşim kromatografisi ve ardından benzeşim etiketinin bölünmesi, amonyum sülfat çökeltme ve boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile gerçekleştirildi. Enzim β-sitedeki anahtar kalıntılarının rolünü daha iyi anlamak için, önceki yapısal çalışmalarda bölgeye doğrudan mutajensis yapıldı. Vahşi tip ve mutant α₂β₂StTS kompleksini arındırmak için başka bir protokol oluşturuldu. Amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve SEC kullanılarak basit, hızlı ve verimli bir protokol, α₂β₂StTS kompleksinin tek bir günde arındırılmasına izin sağladı. Bu çalışmada açıklanan her iki saflaştırma protokolü, saflaştırma protokolü boyunca α₂β₂StTS kompleksini kristalize etmek için PEG 8000 ve spermin kullanarak aynı kompleksi arındırmak için önceki protokollerle karşılaştırıldığında önemli avantajlara sahiptir. Vahşi tip ve bazı mutant formlarının kristalleşmesi, peg 8000 ve spermin kullanarak bazı mutantların saflaşmasını bozan biraz farklı koşullar altında gerçekleşir. X-ışını kristalografik çalışmalarına uygun kristalleri hazırlamak için kristalizasyon, kristal kalitesi ve kriyoproteksiyonu optimize etmek için çeşitli çabalar sarfedildi. Burada sunulan yöntemler genellikle triptofan sintaz alt biraları ve vahşi tip ve mutant α₂β₂StTS komplekslerinin saflaştırılması için uygulanmalıdır.

Giriş

Triptofan sintaz (TS) bienza kompleksi (α₂β_2),bakteri, bitki ve mantarlarda L-Triptofan amino asidinin biyosentezinde son iki adımı katalizleyen allosterik bir^enzimdir. Salmonella enterica serovar typhimurium (St) bakterisi insanlarda ve diğer hayvanlarda ciddi bir gastrointestinal enfeksiyona neden olur. İnsanlarda ve daha yüksek hayvanlarda TS (EC 4.2.1.20) olmadığından, S'nin inhibisyonu. tifüs α₂β₂ TS kompleksi (α₂β₂StTS) kriptosporidiosis ve tüberküloz tedavisi için potansiyel bir ilaç hedefi olarak araştırılmıştır⁴, genital ve oküler enfeksiyonlar⁵ve tarımda potansiyel herbisit kullanımı için⁶. α-alt birimi, GAP ve indole^3,6'yıüretmek için bir indolenine tautomer ara ve daha sonra karbon-karbon bağı bölünmesinin oluşumu yoluyla, gliseraldehit-3-fosfat (GAP) ve indole'ye kadar olan aldolitik bölünmeyi kataliz eder. β katalitik alan, β-Lys87'ye bir Schiff tabanı aracılığıyla bağlı bir piridoksial 5′-fosfat (PLP) kofaktör molekülü içerir, bu da enzim β-alt biradaki reaksiyonlar sırasında bir elektron lavabosu olarak işlev β^3,7. β alanı, L-Serine yan zincir hidroksilinin L-Triptofan ve PLP'ye bağımlı reaksiyonda bir su molekülü vermek için hintkenede değiştirilmesini katalİze eder. St TS, çok enzimli kompleksler içinde substrat kanal ve allosterik iletişimin araştırılması için uzun süredir devam eden bir model olarak hizmet vermektedir^2,3. L-Triptofan sentezi sırasında katalitik adımları senkronize etmek ve indole salınımını önlemek için TS'nin α ve β alt biraları arasındaki çift yönlü allosterik iletişim³. Bu çabayı genişletmek için, StTS β-subunit'in katalitik bölgesinde enzim yapısı, mekanizması ve fonksiyonu arasındaki ilişkinin daha fazla araştırılmasında kullanılmak üzere tek nokta mutasyonu ile birkaç mutant (β-Gln114Ala, β-Lys167Thr ve β-Ser377Ala) hazırladık.

Edith W. Miles araştırma grubu tarafından_{α 2}β₂StTS'nin katalitik mekanizması hakkında detaylı araştırma başlatılmıştır. Yerli Escherichia coli α₂β₂ TS kompleksi ile yapılan ilk^{çalışmalar,}yalıtılmış α-alt bira 8 ,⁹, izole β-alt bira 10^,11ve α 2 β ₂TS kompleksinin yalıtılmış alt birelerden arındırılmasına ve karakterizasyonuna odaklanmıştır¹². Saflaştırma, amonyum sülfat çökeltme, örnek diyaliz, DEAE-Sephadex kromatografisi, diyaliz ve DEAE-Sephadex sütun¹²üzerinde ikinci bir kromatografik yuvarlak ile gerçekleştirildi. Başka bir protokolde, aynı kompleksin saflaştırılması, netleştirilmiş hücre lisatının bir DEAE-Sephadex sütununa yüklenmesi ve ardından Sepharose 4B sütununa kromatografik bir adım, amonyum sülfat çökeltme ve diyaliz¹³. Her iki saflaştırma protokolü de 4-5 gün sürer. Escherichia coli α₂β₂ TS kompleksi kristalize edildi, ancak kristaller o zaman X-ışını kırınımı için uygun değildi.

Yeni bir çalışmada, S. typhimurium α 2 β_2TS kompleksinin rekombinant ve vahşi tip formları saflaştırıldı ve kristalize edildi^14,15. Rekombinant α₂β₂StTS kompleksi, pEBA-10 ifade vektörü taşıyan E. coli strain CB149'da aşırı ifade edildi. α₂β 2StTS kompleksinin ilk kristalizasyonu ve_X-ışınıkırınım verisi toplanması ve analizi¹⁴bildirilmiştir. Bununla birlikte, α₂β₂StTS kristalleri gibi uzun ve ince iğne yapısal çalışmaları bozmuşlardır. Daha iyi X-ışını kırınım verileri toplamak amacıyla, α 2 β 2StTS kompleksi^15'invahşi tipini ve mutant formlarını arındırmak için başka bir saflaştırma protokolü tanımlanmıştır. Temizleme, netleştirilmiş hücre lisatına spermin ve PEG 8.000 kullanılarak ilk çökeltme ile gerçekleştirildi ve santrifüjleme ile büyük bir hacimli çökelti çıkarıldı. Yüksek miktarda α içeren süpernatant fraksiyon₂β₂StTS kompleksi, sarı kristaller çökene kadar 4 °C'de 16-48 saat boyunca depolandı. Kristaller yıkandı ve farklı tamponlara karşı yoğun bir şekilde çaprazlandı. Protein kompleksi amonyum sülfat içeren tamponda rekristalite edildi ve^15. Protein kristalizasyonu çözeltideki protein ve çökelti konsantrasyonlarına bağlı olsa da, çözeltideki diğer mutant formları için saflaştırmayı izlemek, tahmin etmek ve çoğaltmak α₂β₂StTS kompleksinin çözeltisinde. Bu protokol, herhangi bir kromatografik yöntem kullanmaması avantajına sahiptir; bununla birlikte, dezavantajları, tipik olarak 5-7 gün gerektiren kristalize etmek, dialyze etmek ve recrystallize etmek için gerekli olan uzun saflaştırma süresidir. X-ışını veri toplama için uygun kristaller elde etmek, 600'den fazla kristalizasyon koşulu protein konsantrasyonu, sıcaklık, çökeltiler (PEG 4.000, 6.000 ve 8.000) ve katkı maddeleri (CaCl 2 , MnCl₂, ZnCl₂, kadavra, putrescine, spermin veya spermidin) kombinasyonu ve varyasyonu kullanılarak değerlendirildi^15. Kristaller daha iyi bir kristal formuna sahipti ve% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin içeren koşullarda daha hızlı büyüdü. Kristalizasyon 4, 30 veya 42 ° C yerine 25 ° C'de daha elverişliydi ve 3 gün içinde maksimum boyutlara büyüdü¹⁵. O dönemde(1996-β1999) 16 , 17 , 18 , 19,₂₀^,21ve daha birçok yapının yayınlandıkları α bildirilmiştir.

Burada temel amaç triptofan sintazını arındırmak ve protein kristalizasyonunu optimize etmek için alternatif protokoller sunmaktır. Mevcut çalışma, yalıtılmış β-alt birliğini (β St TS), 2 β 2StTS kompleksini yalıtılmış alt birelerden yeniden oluşturan αalt birliğini (α αStTS), α₂β₂StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formlarını arındırmak için önemli iyileştirmelergöstermektedir. Arınma süresi önemli ölçüde azaltıldığı ve kristalizasyon ve kriyoproteksiyon optimize edildiğinden, geçmiş protokollere göre avantajlar önemli ölçüdedir. Bu çalışmada tasarlanan α₂β₂StTS kompleksinin mutant formları, vahşi tip formu için kullanılan durumun yakınında kristalleşmiştir. Bununla birlikte, atomik çözünürlüğe yakın yapı belirleme için yeterli kalitede büyük tek kristaller elde etmek için ince kristalizasyon optimizasyonu gerekliydi. Bugüne kadar Protein Veri Bankası'nda (PDB) bakteri, arkea ve ökaryot için sırasıyla 101, 31 ve 2 kristal yapıyı oluşturan 134 triptofan sintaz kristal yapısı bulunmaktadır. Güzel bir şekilde, 73 yapı S. enterica serovar typhimurium'a aittir ve α 2 β₂StTS kompleksinin₅kristal yapısı 1.50 Angstrom'dan daha yüksek çözünürlük sınırlarına sahiptir. Şaşırtıcı olmayan bir şekilde, araştırma grubumuzda 5'te 4'ü hazırlandı (PDB IDs:5CGQ 1.18 Å'da, 4HT3 1.30 Å'da, 4HPJ 1.45 Å'da, 6DZ4 1.45 şçözünürlükte). α₂β₂StTS kompleksinin mutant formunun rafine kristal yapılarının, L-Triptofan sentezinde yer alan esansiyel amino asit kalıntılarının oynadığı mekanizma ve roller hakkında yeni içgörüler sağlaması beklenmektedir.

Protokol

1. α ve β alt birliğini ve yeniden birlenen_{α 2}β₂StTS kompleksini arındırmak için hızlı protokol

1. pETSUMO ifade vektörüne DNA alt kavunu
   1. pEBA-10 ekspresyon vektörü^22'deklonlanmış Salmonella enterica serovar typhimurium bakterisinden triptofan sintazının αkodlayan çevirisel kavrama genini (trpA ve trpB) ve β-alt biralarını elde edin. DNA şablonu olarak pEBA-10 vektörü kullanın.
      NOT: Alternatif olarak, aşağıda listelenen astarlar Salmonella enterica serovar tiphimurium genomundan her iki geni de yükseltmek için kullanılabilir. Moleküler Klonlama: Laboratuvar Kılavuzu^23'teaçıklandığı gibi tüm moleküler biyoloji adımları izlendi.
   2. StTS-FW-Bam veα astarlarla α-subunit 'in (αStTS) tamuzunlukta polinükleotid dizisini tek tek yükseltmek içinpolimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanın St TS-Rev-Eco veStTS-FW-Bam ve βStTS-Rev-Hind β astarları ile β -subunit (βStTS) tam uzunlukta dizilimi α. Yaklaşık 55 °C'lik bir erime sıcaklığı ve 2 dakikalık bir polimeraz uzatma süresi kullanın.
      1. DNA dizilerini güçlendirmek için yüksek kaliteli DNA polimerazını (örneğin Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 μL PCR reaksiyonu için 34 μL çekirdeksiz su ekleyin, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar, 1 μL Şablon DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL Phusion DNA polimeraz.
      2. PCR programı için sıcak bir başlangıç (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) ve son uzatma (72 °C'de 300 saniye) kullanın.
         NOT: Italik diziler sırasıyla BamHI, EcoRI, BamHI ve HindIII kısıtlama sitelerine karşılık gelir. PCR parçalarının terminine yakın enzim bölünme verimliliği ekstra bazlar (küçük harf dizileri) eklenerek geliştirilmiştir.
         αStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGGAACGCTACGAAAA-3′
         αStTS-Rev-Eco: 5′-ccgGAATTCTTATGCGCGGCTGGC-3′
         βStTS-FW-Bam: 5′-cgcGGATCCATGACAACACTTCTCAAC-3′
         βStTS-Rev-Hind: 5′-cccAAGCTTTCAGATTTCCCCCCTC-3′
   3. PCR ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda (40 mM Tris, 20 mM asetik asit ve 1 mM EDTA) %0,8 agarose jel üzerine yükleyin, jel ilgi çekici DNA bandını çıkarın ve jel, üreticiden gelen talimatları izleyerek bir silika boncuk kiti kullanarak PCR parçasını arındırır.
      1. Her DNA parçasının en az 200 ng'sini, üretici tarafından 37 °C'de 2 saat boyunca önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin.
      2. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu kurmak için 34 μL çekirdeksiz su, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 μL kısıtlama enzimi 1 ve 0,5 μL kısıtlama enzimi 2 ekleyin.
      3. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE'ye% 0,8 agarose jel üzerine yükleyin, jel özü ve jel, sindirilen parçayı ticari bir kit kullanarak arındırın.
   4. Her parçayı ayrı ayrı E. coli ekspresyonuna altklam, daha önce uygun enzimler ve jel saflaştırılmış ile sindirilen vektör pET SUMO'su modifiye etti.
      NOT: Bu vektör ticari pET SUMO'nun değiştirilmiş bir sürümüdür. Bu vektör kısıtlama enzim klonlama için optimize edilmiştir. pET28b vektörün çoklu klonlama bölgesi (MCS)(BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI ve XhoI) pET SUMO klonlama bölgesine eklenmiştir. Bu vektör, Small Ubiquitin benzeri Değiştirici proteini (SUMO) ve birden fazla klonlama bölgesi ile çerçevede bir N-terminal 6x-Histidin etiketi içerir.
   5. 25 °C'de 2 saat boyunca T4 DNA ligaz ile 100 ng modifiye pET SUMO ve 50 ng PCR parçası ligate.
   6. İnşa edilen plazmidi E. coli strain DH10B α hücrelerinin yetkinhücrelerine dönüştürün. LB agar plakalarında 35 μg/mL kanamycin içeren plaka hücreleri. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
   7. Her dönüşümden tek bir koloni seçin, ultra saf plazmid DNA hazırlayın ve αStTS veya βStTS'nin N-terminal His6-SUMO etiketiyle çerçeve halinde klonlandığını doğrulamak için DNA dizilemesi gerçekleştirin.
      NOT: Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın (hücre süspansiyonu% 16 nihai steril gliserol konsantrasyonunda çevirin) ve -80 ° C'de uzun süre saklayın.
   8. Plazmid SUMO-αStTS veya SUMO-βStTS ekspresyonunu ayrı ayrı T7 promotör tabanlı bir sistemle E. coli expression strain Rosetta (DE3) pLysS'in yetkin hücrelerine dönüştürün. 35 μg/mL kanamycin ve kloramfenikol içeren Luria Bertani (LB) agar plakalarındaki rekombinant hücreleri plakalayın. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
   9. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin (herhangi bir uydu kolonisi olmadan) ve her iki antibiyotikle 5 mL LB ortamına dağıtın. Kültür hücreleri gece boyunca 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak.
      NOT: Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın, -80 °C'de uzun süreli depolayın veya hemen rekombinant protein ekspresyoyu için kullanın.
2. SUMO-αStTS ve SUMO-βStTS alt birliklerinin ifadesi
   1. SUMO- α St TS veya SUMO-βStTS'yi barındıran taze E. coli suşu Rosetta(DE3) pLysS hücrelerini aşılayın, donmuş gliserol stoğunun bir kısmını 35 μg/ mL kanamycin ve kloramfenikol içeren 50 mL LB kültürüne inşa eder veya kazır. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün.
   2. Ertesi sabah, %2 gliserol artı kanamycin ve kloramfenikol (2,8 L Fernbach matarası) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'de gece hücre kültürünün 5 mL'sini aşıla. 37 °C'de 200 rpm'de titreme ile hücre kültürünü büyütün.
      NOT: LB suyunda SUMO-αStTS veya SUMO-βStTS ifadesi litre başına 125-150 mg etiketli protein verir. Belirli talepleri yerine getirmek için iletişim kuralını yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
   3. OD_{600, 0.4} mM'lik son konsantrasyonda izopropil β-D-1 tiyogalactopyranoside (IPTG) ilavesiyle 0.6-0.8'e ulaştığında rekombinant protein ekspresyonunu teşvik edin ve ardından 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 °C'de inkübasyon.
   4. Hücreleri 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüjleme yaparak hasat edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini soğuk lizis tamponu 1 (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 500 mM NaCl, % 5 gliserol, 10 mM 2-mercaptoethanol ve 40 mM imidazol-Cl) içeren 60 mL'lik son hacme kadar yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırma için hemen kullanılabilir. Hücreleri saklamak için hücre süspansiyonu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplere bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun.
3. Arınma α- ve triptofan sinthase β alt biraları
   NOT: Aksi belirtilmedikçe tüm prosedürler 4 °C'de yapılmalıdır. Saflaştırma süresini azaltmak için, protein saflaştırmadan önce veya rekombinant protein ekspresyonu sırasında ni-NTA agarose nikel yüklü benzeşim sütunlarını ve boyut dışlama sütununu tamponda dengeler.
   1. 1/2" Boynuz probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonication ile hücre peletlerini bozın. 10 s darbe ve 20 s dinlenme kullanarak veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda% 80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
   2. Hücre lisatını 30 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj edin. Peletin tüpten yerinden sapmamasını sağlayarak süpernatantı aspire edin. Süpernatantı buz üzerinde 0,45 μm filtre ünitesi ile filtreleyin ve liziz tamponu 1'de önceden dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agarose nikel yüklü benzeşim sütunundan geçirin.
      NOT: Her Ni-NTA agarose sütunu SUMO- αStTS veya SUMO-βStTS rekombinant proteini saflaştırmak için kullanılacaktır. Saflaştırma, hızlı proteinli sıvı kromatografi sistemine bağlı 2x 5 mL Ni-NiTA kolonunda yapılabilir. Her seferinde bir proteini arındırır.
   3. Ni-NTA agarose sütununu 100 mL lizis tamponu 1'de yıkayın.
   4. E1 tamponu (25 mM Tris-Cl tampon, pH 7.8, 200 mM NaCl, %5 gliserol ve 400 mM imidazol-Cl) içeren 80 mL tek adımlı bir elution ile devam edin.
      NOT: SUMO-proteaz 300 mM imidazol tolere eder ve santrifüj filtre cihazlarının zarı 100 mM imidazol tolere eder. Yüksek miktarda iimidazol çıkarmak ve saflaştırma süresini azaltmak için amonyum sülfat yağışı yapmanızı öneririz, bunun yerine protein örneğini seyreltin ve protein konsantrasyonu ile zaman kaybedin.
   5. Süpernatant kesirinin başlangıç hacmini değerlendirin. 25 °C'de %60 doygunluğa (39,48 g/ 100 mL) ulaşılana kadar bir seferde yavaşça az miktarda amonyum sülfat ekleyin. Çözeltiyi 30 dakika boyunca hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının. 15 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüj.
   6. Üst kısmı dikkatlice epire edin ve atın. Pelet fraksiyonunu 20 mL numune tamponunda (20 mM Tris-Cl, pH 8.0, 300 mM NaCl ve% 5 gliserol) yeniden biriktirin.
   7. SUMO-proteazlı His-SUMO etiketli dekolte için Saccharomyces cerevisiae'den Ubl'ye özgü proteaz 1'in rekombinant parçasını 1:1000 oranında ekleyin ve karışımı 4 °C'de 2 saat kuluçkaya yatırın.
   8. Numuneyi bir benzeşim kromatografi kolonundan yüklemeden önce protein agregalarını çıkarmak için sindirim ürününü 25 °C'de 10.000 x g'da santrifüjlayın.
   9. Daha önce lizis tamponu 1'de dengelenmiş 15 mL Ni-NTA agarose sütununda 20 mL resüspended örneği geçiren His6-SUMO etiketinin izlerini kaldırın.
   10. Etiketlenmemişα St TS veya βStTS içeren geçiş örneğini toplayın.
   11. St TS veyaβ StTS etiketlenmemiş artıkları toplamak için Ni-NTA sütununu 20 mL tampon1'α yıkayın.
   12. 4 °C'de 3.000 x g'da dönerek her alt birimi 15 mL 10 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi ile ayrı ayrı konsantre edin. Konsantre proteini agregaları çıkarmak için taze bir 2,0 mL tüpe ve mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın. Protein konsantrasyonu^24'übelirleyin, 20-25 mg mL^{-1'de 1}mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 ° C'de saklayın.
       NOT: Önceden saflaştırılmış protein örnekleri -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırma için hemen kullanılabilir.
   13. Sec'den önceki agregaları çıkarmak için 10 dakika boyunca 10.000 x g'da bir protein aliquot (20 mg) ve mikrosantrifüj alın.
   14. Örnek, daha önce SEC tamponunda (10 mM Tris-Cl, 10 mM Tris-Cl) daha önce dengelenmiş 0,5 mL min^-1akış hızında hızlı protein sıvı kromatografisine bağlı bir boyut dışlama kromatografi sütununa (örneğin, HiPrep 16/60 Sephacryl S-200 HR) yükleyin. pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksial fosfat).
       NOT:StTS veya βStTS alt birliğini daha yüksek miktarlarda yalıtılmış α arındırmak ve SEC turlarının sayısını azaltmak için, 20-25 mg mL^{-1'de 5} mL'lik bir örneği 1,5 mL min^-1akış hızında bir boyut dışlama kromatografi sütununa yükleyin.
   15. Sırasıyla, Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 veya% 15 sodyum dodecyl sülfat-jel elektroforez (SDS-PAGE) kullanarak tepe fraksiyonunda StTSveya βStTS α kalitesini değerlendirin²⁵.
   16. Proteini taze 15 mL 10 kDa kesme santrifüj filtre üniteleri ile konsantre edin, protein konsantrasyonu^24'übelirleyin, 20-25 mg mL^{-1'de 0,5}mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flash-freeze yapın ve -80 ° C'de saklayın.
4. α₂β₂StTS kompleksinin α ve β alt birilerden arındırılması
   NOT: SEC tamponunda (Sephadex S-200 HR veya Superdex 200 pg) boyut dışlama kromatografi sütununu (10 mM Tris-Cl, pH 7.8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0.1 mM piridoksial fosfat) dengele.
   1. Vahşi tip α₂β₂StTS kompleksini α ve β alt birilerden arındırmak için, α St TS ve βStTS altbiritelerinin konsantre örneklerini 4 °C'de çözün.
   2. Aliquots (1.2 αStTS: 1.0 βStTS molar oranı) ve 1 saat boyunca 4 °C'de inkübe edilmiş birleştirin.
      NOT: Β St TS'nin çoğunun α₂β 2StTS kompleksine dahil edileceğini sağlamak için_αStTSfazlalığı gereklidir.
   3. Protein agregalarını mikrosantrifüjleme ile çıkarın (10.000 x g, 10 dk, 4 °C).
   4. Netleştirilmiş süpernatantı boyut dışlama sütununa yükleyin.
   5. Sırasıyla, Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 veya% 15 sodyum dodecyl sülfat-jel elektroforez (SDS-PAGE) kullanarak tepe fraksiyonunda StTSveya βStTS α kalitesini değerlendirin²⁵.
   6. Protein konsantrasyonu^24'übelirleyin, 15-20 mg mL -1'de 250-1000^μLaliquots hazırlayın, sıvı nitrojende flaş dondurun ve -80 °C'de saklayın.

2. α₂β₂StTS kompleksinin vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması

1. StTS'β mutant hazırlamak için mektağa yönelik mutajensis
   1. βzincirli TS polinükleotid dizisinde belirli nokta mutasyonlarını tanıtmak için iki adımlı polimeraz zincir reaksiyonu sırasında DNA şablonu olarak yapı pEBA-10 ekspresyon vektörü^22'yi kullanın.
      NOT: Bu protokol, Salmonella tiphimurium triptofan sintazından α veya β-alt bireyde tek nokta mutasyonu tanıtmak için kullanılabilir. Ek olarak, istenen mutasyonu içeren yeni oligonükleotid astarlar uygun şekilde tasarlanmalıdır. Bu çalışmada Q114A, βK167T, βS377A βmutasyonlar listelenmiştir.
   2. Sırasıyla A1, B1 ve C1 parçaları oluşturmak için TS-FW-NcoI/Q114A-Rev, TS-FW-NcoI/K167T-Rev ve TS-FW-NcoI/S377A-Rev çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      NOT: Sırasıyla Oligonükleotid TS-NcoI-FW ve TS-SacI-Rev, pEBA-10 vektöründe klonlanmış αβ StTS polinükleotid dizisinin yukarı ve aşağı akışlarını tavlar.
      1. DNA dizilerini güçlendirmek için yüksek kaliteli DNA polimerazını (örneğin Phusion) ve üreticinin protokolünü kullanın. 50 μL PCR reaksiyonu için 34 μL çekirdeksiz su ekleyin, 10 μL 5x reaksiyon tamponu, 1 μL 10 mM dNTP, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar, 1 μL Şablon DNA (200 ng), 1,5 μL DMSO, 0,5 μL DNA polimeraz.
      2. PCR programı için sıcak bir başlangıç (98 °C'de 180 saniye) ve ardından 30 amplifikasyon döngüsü (98 °C'de 30 saniye, 55 °C'de 30 saniye ve 72 °C'de 120 saniye) ve son uzatma (72°C'de 300 saniye) kullanın.
         NOT: Moleküler Klonlama: Laboratuvar Kılavuzu^23'teaçıklandığı gibi tüm moleküler biyoloji adımları izlendi. Küçük harf dizisi bir kısıtlama bölgesine karşılık gelirken, kalın ve italik bir dizi bir mutasyona karşılık gelir.
         TS-FW-NcoI: 5'-CAA TTT CAC ACA GGA AAC AGA cca tgg-3'
         Q114A-Rev: 5'-C AGA GGC GAC GCC GTG CGC ACC GGC GCC GGT TTC-3'
         K167T-Rev: 5'-CTC GTT ACA GGC ATC TGT TAG CGT AGC GGA GCC-3'
         S377A-Rev: 5'-C TTT ATC TCC GCG GCC AGC GAG ATT GAC CAC CAG-3'
   3. Sırasıyla A2, B2 ve C2 parçaları oluşturmak için TS-Rev-SacI/Q114A-FF, TS-Rev-SacI/K167T-FF ve TS-Rev-SacI/S377A-FF çiftlerini kullanarak PCR reaksiyonları gerçekleştirin.
      TS-Rev-SacI (5'-TTA tgc gcg GCT GGC GGC TTT CAT GGC TGA G-3'
      Q114A-FF 5'-GAA ACC GGC GCC GGT GCG CAC GGC GTC GCC TCT G-3'
      K167T-FF 5'-GGC TCC GCT ACG CTA ACA GAT GCC TGT AAC GAG-3'
      S377A-FF 5'-CTG GTG GTC AAT CTC GCT GGC CGC GGA GAT AAA G-3'
   4. Kısmi parçaları ayrı ayrı yükseltmek için polimeraz zincir reaksiyonu kullanın. 55 °C erime sıcaklığı ve 2 dk polimeraz uzatma süresi kullanın.
   5. PCR reaksiyonlarının ikinci turunu gerçekleştirmek için, PCR ürününü 6 V / cm'de 1x TAE'ye% 0.8 agarose jel üzerine yükleyin ve jel özü ve jel ilgi parçalarını arındırır.
      1. A1/A2, B1/B2 ve C1/C2 parçalarını ayrı ayrı equimolar miktarlarda karıştırın, karışımı 96 °C'de 10 dakika ısı denatüresi ve 25 °C'de tavlama. Rekombinant iplikçikleri üreticinin protokolüne göre yüksek kaliteli bir polimeraz ve deoksiribonükleotidlerle genişletin.
   6. Tam uzunlukta mutant DNA parçasının yüksek kopya sayısını oluşturmak için, ikinci bir PCR gerçekleştirmek için Oligo primer TS-FW-NcoI ve TS-Rev-SacI ekleyin.
   7. PCR ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda% 0,8 agarose yükleyin, jel ilgi çekici DNA bandını çıkarın, jel PCR parçasını arındırın ve üretici tarafından önerilen uygun tampon ve koşulları takiben 37 ° C'de 2 saat boyunca uygun kısıtlama sindirimine devam edin.
      1. Her DNA parçasının en az 200 ng'sini, üretici tarafından 37 °C'de 2 saat boyunca önerilen uygun kısıtlama enzimleri ve koşulları ile sindirin. 50 μL kısıtlama sindirim reaksiyonu kurmak için 34 μL çekirdeksiz su, 10 μL DNA (200 ng), 5 μL 10x reaksiyon tamponu, 0,5 μL kısıtlama enzimi 1 ve 0,5 μL kısıtlama enzimi 2 ekleyin. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda %0,8 agarose üzerine yükleyin ve sindirilen PCR parçasını arındırın.
   8. Üreticinin tavsiyesine uyarak NcoI ve SacI kısıtlama enzimleri ile 200 ng pEBA-10 yapıyı sindirin. Sindirim ürününü 6 V/cm'de 1x TAE tamponunda% 0,8 agarose jel üzerine yükleyin, bant muhabirini vektöre boşaltın ve jel sindirilen vektörü arındırın.
   9. 100 ng vektörü, daha önce sindirilmiş ve saflaştırılmış 50 ng PCR parçası ile 25 °C'de 2 saat boyunca T4 DNA ligaz ile ligate edin. İnşa edilen plazmidi yetkin hücrelere dönüştürün E. coli strain DH10B hücreleri. LB agar plakalarında 50 μg/mL ampisilin içeren plakahücreleri. Plakayı 37 °C'de bir gecede inkübte edin.
   10. Her hücre dönüşümünden tek bir koloni (herhangi bir uydu kolonisi olmadan) seçin ve ampisilin içeren 5 mL LB ortamına dağıtın. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün. Tasarlanan her yapıdan 10 μg ultra saf plazmid DNA hazırlayın. Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın (hücre süspansiyonuna% 16 nihai steril gliserol konsantrasyonunda dönün) ve -80 ° C'de uzun süreli depolayın.
   11. Triptofan sintazının α ve β alt birimlerini kodlayan tam uzunlukta sırayı doğrulamak için DNA dizilimini gerçekleştirin. Her bir tek mutasyonu onaylayın ve istenmeyen rastgele mutasyon içeren plazmid yapıyı atın. Bu çalışmada kullanılan oligonükleotid primerler aşağıda listelenmiştir.
       TS-1F: 5'-ATGACAACACTTCTCAAC-3'
       TS-1R: 5'-GAAATGCCAGAACATTAC-3'
       TS-2F: 5'-CAGTCGCCGAACGTC-3'
       TS-3F: 5'-GATGATGCAAACAGC-3'
       TS-4F: 5'-CTGGCATTGAACAGTC-3'
       TS-5F: 5'-CGTTGCATCATCATCATTG-3'
       NOT: Oligonükleotid astarları TS-1F, TS-1R, TS-2F ve TS-3F tavla, β alt birimin polinükleotid dizilimi üzerindedir (GenBank katılım kodu: CP051286.1). Astarlar TS-4F ve TS-5F tavla, α alt birimin polinükleotid dizilimi üzerindedir (GenBank katılım kodu: CP053865.1).
   12. Trp operon 26'dan yoksun E. coli expression strain CB149'un yetkin hücrelerini dönüştürmek için her plazmid yapının 200 ng'sini (pEBA-10- β Q114A, pEBA-10- β K167T ve pEBA-10-βS377A) kullanın. Başarılı koloni oluşumundan sonra, tek bir koloni seçin ve hücreleri 50 μg / mL ampisilin içeren 5 mL LB ortamında büyütün. Bir gecede 37 °C'de bakteri inkübatöründe kültür. Hücre kültürünün gliserol stoklarını hazırlayın, -80 °C'de uzun süreli depolayın veya rekombinant protein ekspresyoyu için hemen kullanın.
       NOT: Salmonella tiphimurium triptofan sintazından α veya β-alt bireyde tek bir nokta mutasyonu enzim fonksiyonunu bozabilir veya E. coli strain CB149'da L-Triptofan sentezini azaltabilir. Bir SDS-PAGE jelinde 2 β 2StTS kompleksinde herhangi bir ifade veya daha düşük miktarda rekombinant tespit α E. coli strain_{BL21(DE)pLys-S}veya Rosetta (DE3)pLys-S kullanmayı düşünün.
2. E. coli'deki α₂β₂StTS kompleksinin vahşi tip ve mutant formunun ekspresy ekspresyolası
   1. 50 μg/mL ampisilin içeren taze ve steril 50 mL LB ortamında istenen yapıyı barındıran E. coli ifade suşunu büyütün. 37 °C'de 200 rpm'de sallanarak hücreleri bir gecede büyütün.
   2. %2 gliserol artı ampisilin (2,8 L Fernbach matarası) içeren taze ve steril 2x 1000 mL LB'ye 5 mL gece hücre kültürü ekleyin. 37 °C'de 200 rpm'de titreme ile hücre kültürünü büyütün.
   3. OD_{600 0.6-0.8'e} ulaştığında, 0.4 mM'lik son konsantrasyonda IPTG'nin eklenmesiyle rekombinant protein ekspresyonunu teşvik edin ve ardından 200 rpm'de sallanarak bir gecede 30 °C'de inkübasyon.
   4. Hücreleri 20 dakika boyunca 4 °C'de 4.000 x g'da santrifüjleyarak hasat edin. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletlerini soğuk lizis tamponu 2 (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 5 mM dithiothreitol, 1 mM EDTA ve 1 mM PMSF) içeren 50 mL tampon ile yeniden askıya alın.
      NOT: Hücreler -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya protein saflaştırma için hemen kullanılabilir. Hücreleri saklamak için hücre süspansiyonu 2 x 50 mL tek kullanımlık santrifüj konik tüplere bölün ve hücre peletlerini protein saflaştırma adımına kadar -80 °C'de tutun. LB suyunda α₂β₂StTS kompleksinin mutant ve vahşi tip formunun ifadesi litre başına 125-150 mg protein verir. Belirli talepleri karşılamak için iletişim kuralını yukarı veya aşağı ölçeklendirmeyi düşünün.
3. α₂β₂StTS kompleksinin vahşi tipinin veya mutant formunun saflaştırılması
   NOT: Aşağıdaki protokol, etiketlenmemiş rekombinant vahşi tipini veya mutant formunu rekombinant α arındırmak için tasarlanmıştır.₂β₂StBeceri set ve çabalara bağlı olarak 1 gün içinde TS kompleksi. Saflaştırma süresini azaltmak için, tampon önceki protein saflaştırma/ekspresyonunda boyut dışlama sütununu dengeler. Vahşi tip veya mutant α arındırılması₂β₂StTS kompleksi, amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve boyut dışlama kromatografisinden oluşan iki aşamalı bir saflaştırma ile gerçekleştirilir. Bu protokol, 1 L LB ortamından 60-100 mg saf kompleks sağlar.
   1. 1/2" Boynuz probu (veya benzer bir ekipman) ile dijital bir sonifier kullanarak sonication ile hücre peletlerini bozın. 10 s darbe ve 20 s dinlenme kullanarak veya tam hücre bozulmasına kadar buzlu su banyosunda% 80 genlik görev döngüsünde 20 döngü gerçekleştirin.
   2. Hücre lirfatını 25 °C'de 30 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj edin. Peletin tüpten yerinden sapmamasını sağlayarak süpernatantı aspire edin. Netleştirilmiş süpernatant fraksiyonu oda sıcaklığında 0,45 μm filtre ile filtreleyin.
   3. Netleştirilmiş süpernatant fraksiyonunun başlangıç hacmini değerlendirin. % 20 doygunluğa ulaşana kadar (11,51 g / 100 mL) bir seferde küçük miktarlarda amonyum sülfat ekleyin. 25 °C'de amonyum sülfat fraksiyonasyonunu gerçekleştirin. Çözeltiyi 10 dakika hafifçe karıştırın ve kabarcıklardan kaçının.
   4. 25 °C'de 10 dakika boyunca 30.000 x g'da santrifüj. % 20'lik süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de (50 mM Tris-Cl, pH 7.80, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA ve 2 mM dithiothreitol içeren) %20 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. % 20 pelet fraksiyonunu atın.
   5. %20'lik süpernatant fraksiyonun başlangıç hacmini değerlendirin. % 30 doygunluğa (5,94 g / 100 mL) amonyum sülfat ekleyin, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. % 30'luk süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 20 mL numune tamponu 2'de %30 pelet fraksiyonunu nazikçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. % 30 pelet fraksiyonunu atın.
   6. %30'luk süpernatant fraksiyonun başlangıç hacmini değerlendirin. % 40 doygunluğa (6.14 g / 100 mL) ulaşılır, çözeltiyi karıştırın, kabarcıklardan kaçının ve daha önce olduğu gibi santrifüj ekleyin. % 40'lık süpernatant fraksiyonu temiz bir şişeye aktarın. 10 mL numune tamponu 2'de %40 pelet fraksiyonunu hafifçe yeniden kullanın ve SDS-PAGE jelini çalıştırmak için bir örnek hazırlayın. %40'ından fazla olan kesirini atın.
      NOT: %12 SDS-PAGE jel25'te %30 ve %40'lık süpernatant ve pelet fraksiyonlarının örneklerini kullanarak αβStTS kompleksinin kalitesini değerlendirin. Başka bir mutant αβStTS kompleksinin% 40 süpernatant fraksiyonunda olduğunu doğrularsanız, % 60 amonyum sülfat doygunluğu ile devam edin (13.0 g / 100 mL). Önceden saflaştırılmış α₂β₂ StTS kompleksinin önceden saflaştırılmış protein aliquotları -80 °C'de uzun süreli olarak saklanabilir veya hemen bir boyut dışlama kromatografi kolonunda (SEC) protein saflaştırma için kullanılabilir.
   7. Protein örneğini 10.000 x g,20 dk'da mikrosantrifüjleyin, 4 °C ve süpernatant fraksiyonu, daha önce SEC tamponunda dengelenmiş 0,5 mL min -1 akış hızında hızlı protein sıvı kromatografisine bağlı bir HiPrep^16/60Sephacryl S-200 HR sütununa yükleyin (10 mM Tris-Cl, pH 7,8, 100 mM NaCl, %5 gliserol, 0,1 mM piridoksial fosfat).
      NOT: Büyük miktarlarda kompleksi arındırmak için, 26/600 Superdex 200 pg'lik bir HiLoad sütununa 20-25 mg^mL-1'de 5 mL'lik bir numuneyi 1,5 mL min^-1akış hızında yükleyin.
   8. Coomassie parlak mavi lekesi ile boyanmış% 12 SDS-PAGE jel üzerinde SEC sütunundan amonyum sülfat fraksiyonasyonu ve tepe fraksiyonları boyunca toplanan örnekleri değerlendirin²⁵.
   9. Vahşi tip veya mutant α₂β 2StTS kompleksini₄°C'de 3.000 x g'da dönerek 15 mL 100 kDa kesme santrifüj filtre ünitesi ile konsantre edin. Konsantre proteini agregaları çıkarmak için taze bir 2,0 mL tüpe ve mikrosantrifüje (10.000 x g, 10 dk, 4 °C) aktarın.
   10. Protein konsantrasyonu^24'übelirleyin, 20-25 mg mL^{-1'de 0,5}mL aliquots hazırlayın, etiket, sıvı nitrojende flaş dondurma ve -80 ° C'de saklayın.

3. α₂β₂StTS kompleksinin vahşi tipi ve mutant formu için optimize edilmiş kristalizasyon

NOT: α₂β₂StTS kompleksi için ilk kristalizasyon durumu daha önce% 12 PEG 8.000 ve 2 mM spermin²²içeren koşullarda bildirilmiştir.

1. Daha iyi bir kristalizasyon tekrarlanabilirliği elde etmek için kristalizasyon testlerinden önce stok çözümleri hazırlayın. TS ile yapısal çalışmalar yapmak için bienzim kompleksinin metal koordinasyon sahasında Na⁺ veya Cs⁺ iyon ile proteini kristalize edin.
   1. Suda 200 mM spermin 5 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 500 μL aliquots'u -20 °C'de tutun.
   2. Suda %30 (w/v) PEG 8000'lik 50 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 mL'lik tek kullanımlık santrifüj konik şişelerde 25 mL aliquots'u 25 °C'de tutun.
   3. Suda 1 M CsCl'lik 25 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
   4. Suda 1 M NaCl 25 mL stok çözeltisi hazırlayın ve 25 °C'de tutun.
   5. pH 7.6, 7.8 ve 8.0'da tamponlanmış çözeltiler elde etmek için CsOH veya NaOH ile 3x 50 mL stok çözeltisi hazırlayın ve CsOH veya NaOH ile titrat hazırlayın. 25 mL aliquots'ı 4 °C'de tutun.
2. Bir buz banyosunda_{α 2}β₂StTS kompleksinin (20-25 mg mL^-1)bir örneğini çözün.
3. Protein agregalarını çıkarmak için 25 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da mikrosantrifüj örneği.
4. Temizlenmiş süpernatant fraksiyonu temiz bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
5. Tahmini protein konsantrasyonu²⁴ ve seyreltilmiş protein aliquots (150-200 μL) 15 mg mL^-1 ile 50 mM bicine-CsOH veya -NaOH, pH 7.8 içeren 50 mM CsCl veya NaCl. Protein örneğini 25 °C'de tutun.
6. Steril 1,5 mL etiketli mikrosantrifüj tüplerde 3x 24 kuyulu oturma damla plakaları için 500 μL rezervuar çözümlerini hazırlayın. Rezervuar çözeltisi 50 mM bicine-CsOH veya -NaOH, 50 mM CsCl veya NaCl ve PEG 8000 içerir. Plaka kolonlarındaki PEG 8000 (%6-11) konsantrasyonuna ve plaka sıralarına spermin (2-8 mM) konsantrasyonuna göre değişir. Her küme için tampon pH'larını (pH 7.6, 7.8 ve 8.0) değiştirin.
7. Tüpleri ve girdabı en az 10 saniye kuvvetli bir şekilde kapla. Kabarcıkları çıkarmak için 25 °C'de 10 dakika boyunca 10.000 x g'da santrifüjtüpleri. Etiketli her rezervuarda 500 μL tamponlu çözelti dağıtin.
8. Bir P-10 mikropipette kullanın ve her oturma damlası başına 15 mg mL^{-1'de 5 μL} protein çözeltisi dağıtın. Kabarcıklardan kaçının. Protein düşüşüne her bir muhabir rezervuar çözeltisinin 5 μL'sini ekleyin. Karıştırma sırasında kabarcıklardan kaçının ve karışımı homojenize etmek için yukarı ve aşağı pipet yapmayın.
9. Plakayı şeffaf yapışkan bir bantla bantlayın ve plakayı 25 °C'de saklayın. Kristaller 2-5 gün içinde ortaya çıkar ve iki hafta içinde tam boyutlarına büyür.

4. X-ışını kırınım veri toplama ve α₂β₂StTS karmaşık yapı çözümü

NOT: X-ışını kırınım verisi toplamadan önce, her kristal için önceden kriyoprotektan çözeltisi hazırlayın. Çözeltide (%10, 20 ve%30 v/v) ve spesifik ligand (lar) artan d imetil sülfit konsantrasyonları içeren 3 aliquots hazırlamak için özel rezervuar çözeltisini kullanın. Dimetil sülfooksitin gliserol, etilen glikol ve PEG 200-300'den daha iyi bir kriyoprotektant olduğu bulunmuştur.

1. Stereoskopik mikroskop altında bir kriyoloop kullanarak büyük bir tek kristal hasat edin.
2. Pipet 2 μL her kriyoprotektant çözeltisi içeren çökeltme çözeltisi artı dimetil sülfit ve ligand (lar) daha yüksek konsantrasyonlarda yeni bir kapak kaydırağı üzerine.
3. Sırayla, crystal'ı her damlaya batırın ve kristalin kriyoprotektant çözeltisinde 30 sn boyunca dengede bekletin.
4. Kriyoprotekslenmiş kristali -173 °C'de (100 K) gazlı bir azot akışı kullanarak flaş soğutma veya paklarda uzun süreli depolama için sıvı nitrojene daldırma.
   NOT: Bir köpüğü Sıvı nitrojenle doldurun, bir kristal pakı önceden soğutun, kristalleri kriyojenik depolama Dewar'da saklayın ve kristalleri kuru bir gönderici kullanarak senkrotrona sevk edin.
5. -173 °C'de X-ışını kırınım verisi toplama işlemine devamedin. 0,5-4,0 s pozlama süresi ve 0,5° salınımlar kullanarak X-ışını kırınım verilerini kaydedin. Kristali 180-360° döndürün.
6. Uygun alan grubunda yansıma dosyası oluşturmak için X-ışını kırınım görüntülerini iMosflm²⁷ ile işleyin. Genellikle, α₂β₂StTS kristalleri C 121 (C2) uzay grubuna aittir.
7. CCP4 paketi^29'dauygulanan Scala²⁸ile yansımaların birden fazla gözlemini birlikte ölçeklendirin.
8. MolRep³⁰ ve uygunbir arama modeli kullanarak moleküler değiştirme ile yüksek çözünürlüklü α 2 β₂StTS kompleksinin yapısını çözün. Başarılı bir yapı çözümünden sonra Coot^31'deki modeli ve elektron yoğunluk haritasını inceleyin.
   NOT: Protein Veri Bankası'nda farklı ligand (lar) ile yatırılan birçok TS kristal yapısı vardır. Daha iyi bir moleküler değiştirme adımı ve daha yeni kristal yapıya sığan zamanın azalması için, ilgi çekici ligand (lar) içeren en iyi arama modelini kullanın. CCP4^{29, 30}veya Phenix^31'dekristal yapı iyileştirmesi ile devam edin.
9. Coot³²kullanarak modelde manuel ayarlamalar yapın, ardından Refmac^29,33 veya phenix.refine 31^,34ile otomatik olarak iyileştirme yapın. Coot^32'de model oluşturma ve otomatik iyileştirmenin yinelemeli turlarını çalıştırarak son modeli oluşturun ve iyileştirin.
10. Protein Veri Bankası web sitesinde koordinat ve yapı faktörleri biriktirmeye devam edin.

Sonuçlar

Triptofan sintazının αve β-alt birliğinin arındırılması
Modifiye pET SUMO vektörüne Salmonella tiphimurium triptofan sintazının α -altbölümü(αStTS) ve β-alt bölümü(β StTS) alt kavunludur. Şekil 1A, His6-SUMO-αStTS (lane αON) ve His6-SUMO-βStTS (lane βON) füzyon proteinine karşılık gelen iki güçlü bandın temsili SDS-PAGE sonuçlarını gö...

Tartışma

Yapı fonksiyonu korelasyon çalışmaları için₂β 2 βQ114A,₂ β_{2 βK167T}α ve₂ α β₂βS377A StTS kompleksleri α mutant formunu başarıyla tasarladık. Başlangıçta, mutantları daha önceki bir saflaştırma protokolü²²kullanarak arındırmaya çalıştık , bu da α₂β₂StTS karmaşık kristalizasyonu PEG 8000 ve spermin ile saflaştırma sırasında gerektirir. Kristalleşme hızı mutant formuna ve çözeltideki kompleksin ko...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
15 mL 10 kDa filtre	MilliporeSigma	UFC901024	santrifüj filtre ünitesi
15 mL 100 kDa filtre	MilliporeSigma	UFC910024	santrifüj filtre ünitesi
2 mL kriyojenik	Corning	CLS430489	Kriyojenik şişeler
2 mL mikrosantrifüj tüpleri	Fisher Scientific	05-408-141	mikrosantrifüj tüpleri
24 kuyulu Cryschem Plate	Hampton Research	HR3-158	24 kuyulu oturma damla plakaları
2-merkaptoetanol	Fisher Scientific	O3446I-100	Kimyasal
50 mL santrifüj konik tüpler	Thermo Scientific	12-565-270	santrifüj konik tüpler
AB15 ACCUMET Basic	Fisher Scientific	13-636-AB15	pH metre
Agarose	Fisher Scientific	BP1356-100	Agaroz jel
amonyum sülfat	Fisher Scientific	A702-500	Kimyasal
Ampisilin	Fisher Scientific	BP1760-5	Antibiyotik
Bakteriyel inkübatör	Fisher Scientific	S35836	inkübatör.
BamHI	New England Biolabs	R0136S	Kısıtlama enzimi
bicine	Fisher Scientific	BP2646100	Chemical
Branson 450 Dijital Sonifier	Brason	B450	Hücre bozucu
Sezyum klorür	Fisher Scientific	BP210-100	Kimyasal
Sezyum hidroksit	Acros Organics	AC213601000	Kimyasal
Kloramfenikol	Fisher Scientific	BP904-100	Antibiyotik
dimetil sülfoksit	Fisher Scientific	D1391	Kimyasal
ditiyotreitol	Fisher Scientific	BP172-5	Kimyasal
DNA Polimeraz	Thermo Scientific	F530S	HF polimeraz
dNTP Seti	Invitrogen	10-297-018	dNTP seti
EcoRI	New England Biolabs	R0101S	Kısıtlama enzimi
Etilendiamintetraasetik asit	Fisher Scientific	S311-100	Kimyasal
Excella E25R Orbital Çalkalayıcı	Eppendorf New Brunswick	M1353-0004	Orbital inkübatör
GE AKTA Prime Plus	GE Healthcare	8149-30-0004	FPLC
Jel Ekstraksiyon Kiti	Invitrogen	K210012	DNA saflaştırma kiti
Gliserol	Fisher Scientific	G33-500	Kimyasal
HindIII	New England Biolabs	R0104S	Kısıtlama enzimi
His-Trap sütunları	GE Sağlık	GE17-5255-01	5 mL Histrap kolon
imidazol	Fisher Scientific	O3196-500	Kimyasal
IPTG	Termo Fisher Bilimsel	R0392	İndükleyici
Kanamisin	Fisher Scientific	BP906-5	Antibiyotik
Kelvinatör Serisi-100	Kelvinator	durduruldu	Ultra düşük dondurucu
LB suyu	Fisher Scientific	BP1426-500	Sıvı et suyu
Luria Bertani agar	Fisher Scientific	BP1425-2	Katı et suyu
NaCl	Fisher Bilimsel	S271-500	Kimyasal
NcoI	New England Biolabs	R0193S	Kısıtlama enzimi
Ni-NTA afinite boncukları	Thermo Fisher Scientific	R90115	Ni-NTA agaroz boncukları
PEG 8000	Fisher Scientific	BP233-100	Kimyasal
fenilmetilsülfonil florür	Fisher Scientific	44-865-0	Kimyasal
piridoksal fosfat	Acros Organics	AC228170010	Kimyasal
S-200 HR	Cytiva	45-000-196	Boyut dışlama sütunu
SacI	New England Biolabs	R0156S	Kısıtlama enzimi
Sodyum hidroksit	Fisher Scientific	S318-100	Kimyasal
Sorvall RC-5B santrifüj	Sorvall	8327-30-1004	Yer cetrifuge
Spermin	Acros Organics	AC132750010	Chemical
Superdex 200 hazırlık sınıfı	Cytiva	45-002-491	Boyut dışlama sütunu
T4 DNA ligaz	New England Biolabs	M0202S	DNA liagse
Tris	Fisher Scientific	BP152-500	Kimyasal
Ubl'ye özgü proteaz 1	Thermo Scientific	12588018	SUMO Proteaz