Yöntem makalesi

Kaşeksi ile İndüklenen Beyaz Yağ Dokusu Yeniden Şekillenmesini İncelemek İçin Bir Model Olarak Üç Boyutlu Adiposit Kültürü

DOI:

10.3791/61853

⸱

18 Ocak 2021

 ,  ,  ,  , 
1Department of Integrated Biotechnology, University of Mogi das Cruzes, 2Department of Biochemistry, Boston University School of Medicine, 3Obesity Research Center, Department of Medicine, Boston University School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, kanser hücrelerinden şartlandırılmış bir ortam tarafından indüklenen beyaz yağ dokusu (WAT) yeniden şekillenmesinin diseksiyonuna izin veren üç boyutlu (3D) bir manyetik baskı kültürü sistemini tanımlar. Yeşil bir floresan proteini (GFP) eksprese eden UCP1 + adipositlerinin 3D kültür sisteminin kullanılması, yağ dokusunun yeniden şekillenmesine katkıda bulunan bej adipositlerin incelenmesine izin verir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kanser kaşeksisi (CC), belirgin bir çoklu organ metabolik dengesizliğine neden olan çoklu belirtileri olan bir sendrom olarak kendini gösterir. Son zamanlarda, kaşektik israfın, yağ dokularının ve beyin ve kas gibi diğer dokuların bütünleştirici fizyolojisini bozabilecek çeşitli enflamatuar mediatörler tarafından uyarıldığı öne sürülmüştür. Bu senaryoda, tümör konakçının pahasına hayatta kalabilir. Son klinik araştırmalarda, farklı yağ birikintilerinin tükenme yoğunluğu, hastanın sağkalım sonucu ile negatif olarak ilişkilendirilmiştir. Çalışmalar ayrıca, çeşitli metabolik bozuklukların, özellikle kaşeksi gelişiminin erken aşamalarında, beyaz yağ dokusunun (WAT) yeniden şekillenmesini değiştirebileceğini göstermiştir. Doku yeniden şekillenmesinden kaynaklanan WAT disfonksiyonu, morfo-fonksiyonel değişiklikler, artmış adiposit lipolizi, bağışıklık hücrelerinin birikimi, adipogenezin azalması, progenitör hücre popülasyonundaki değişiklikler ve bej / brite hücreleri içeren "nişlerin" artışından oluşan WAT'taki ana modifikasyonlar ile genel kaşeksiye katkıda bulunur.

Kaşeksi kaynaklı WAT yeniden şekillenmesinin çeşitli yönlerini, özellikle progenitör hücrelerdeki değişiklikleri ve bej yeniden şekillenmeyi incelemek için, iki boyutlu (2D) kültür, in vitro çalışmalar için ilk seçenek olmuştur. Ancak, bu yaklaşım WAT karmaşıklığını yeterince özetlememektedir. Fonksiyonel AT ex vivo'nun rekonstrüksiyonu için geliştirilmiş tahliller, farklı hücre popülasyonları arasındaki fizyolojik etkileşimlerin anlaşılmasına yardımcı olur. Bu protokol, manyetik nanopartiküllere dayalı verimli bir üç boyutlu (3D) baskı doku kültürü sistemini tanımlar. Protokol, kaşeksi kaynaklı faktörler (CIF'ler) tarafından indüklenen WAT yeniden modellemesini araştırmak için optimize edilmiştir. Sonuçlar, bir 3D kültürün, ex vivo WAT modellemesini incelemek için uygun bir araç olduğunu ve bireysel adipoz hücre popülasyonları uygulamaları için biyoaktif molekülleri tanımlamak ve WAT bazlı hücre antikaşik tedavisinin keşfine yardımcı olmak için fonksiyonel ekranlar için yararlı olabileceğini göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Canlı organizmalar, hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimi ve besinler ve hücreler için ayrıntılı taşıma dinamikleri ile 3 boyutlu mikro ortamlardaki hücrelerden oluşur 1,2. Bununla birlikte, hücre biyolojisinde kazanılan temel bilgilerin çoğu, tek katmanlı hücre kültürü (2D) kullanılarak üretilmiştir. Her ne kadar 2D kültür bazı mekanik sorulara cevap verebilse de, bu yaklaşım hücrelerin içinde bulunduğu doğal ortamı yetersiz bir şekilde özetlemekte ve karmaşık bir ilaç tepkisini tahmin etmekle uyumsuz olabilmektedir1. Dahası, hücreler mekanotransdüksiyon yoluyla fiziksel çevrelerini algılarlar. Gerçekten de, mekanik kuvvetler, nihayetinde gen ekspresyon modellerini ve hücrenin kaderini etkileyen biyokimyasal sinyallere çevrilir. Son birkaç on yılda, 3D doku kültürü, in vivo mikro çevreyi daha büyük bir doğrulukla taklit edebilen yeni bir in vitro araç olarak ortaya çıkmıştır. Bu, in vitro 2D yaklaşımlar3 tarafından üretilen bazı mekanik tuzakları önleyebilir.

Kanser kaşeksisi (CC), belirgin bir çoklu organ metabolik dengesizliğine neden olan, çoklu belirtileri olan bir sendrom olarak tanımlanır. Kaşeksi gelişimi sırasında, WAT, adiposit lipolizinin artmasına, bağışıklık hücrelerinin birikmesine, adipogenezde azalmaya, progenitör hücre popülasyonu değişikliklerine ve bej / brite hücreleri içeren "nişlerde" bir artışa (bej yeniden şekillenme) neden olan çok sayıda morfolojik değişikliğe uğrar4. Bununla birlikte, kaşeksi'nin in vitro modeller kullanılarak WAT yeniden şekillenmesini etkilediği mekanizmanın özetlenmesi önemli bir teknik zorluk teşkil etmektedir. Gerçekten de, tümör / doku iletişimini araştırmaya çalışan birkaç çalışma, WAT'ın 3B mikro ortamının karmaşıklığını atlatarak, in vitro hücre kültüründe (2D) tek katmanlı kullanmıştır.

Birkaç deneysel yaklaşım 3D kültür oluştursa da, adiposferoidleri üretmek için üç farklı montaj yöntemi tercih edilir: manyetik levitasyon veya baskı5, asılı damla6 ve Matrigel-iskele sistemleri7. Adiposferoidler için uygun olmalarına rağmen, bu sistemlerin avantajları ve dezavantajları vardır ve her deney tasarımının özelliklerine göre seçilmelidir. Yukarıda belirtilen sınırlamalara dayanarak, 3D hücre kültürleri oluşturmak için manyetik baskı yöntemi kullanıldı5. Bu yöntem, altın nanopartiküller ve demir oksitten oluşan bir manyetik nanopartikül düzeneği kullanır ve bu da baskı yöntemini çoğu hücre tipi için uygun hale getirir. Burada, adipogenezi indüklemek için 3D hücre kültürleri kullanıldı ve CC'nin çevresel durumunu yeniden üretmek için CIF'ler kullanıldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 2D hücrelerin manyetik nanopartiküllerle inkübasyonu

  1. Standart hücre kültürü prosedürlerini kullanarak yapışkan 2D kültürleri ~% 70 birleşmeye kadar büyütün.
  2. Manyetik nanoparçacık düzeneğini hazırlayın. Buzdolabından çıkarın ve oda sıcaklığına (20-25 °C) yaklaşık 15 dakikaısınmaya bırakın 1.
  3. Karışık ortam: Manyetik nanopartikülleri doğrudan 100 mm'lik hücre kültürü plakalarında 12 mL ortama ekleyin. Nanopartiküllerin homojen bir dağılımını elde etmek için ortamı birkaç kez askıya alın ve yeniden süspanse edin.
    NOT: Demir oksidin kahverengi rengi nedeniyle ortam koyu görünecektir. Kültür alanının 2,5 μL/cm2'lik bir konsantrasyonu önerilir.
  4. 100 mm 2D kültür plakasını fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile üç kez yıkayın.
  5. Adım 1.3'ten 100 mm'lik hücre kültürü plakalarına 12 mL karışık ortam ekleyin. Manyetik nanopartiküllerin hücrelere bağlanmasına izin vermek için plakaları gece boyunca bir inkübatörde (37 ° C,% 5 CO2) inkübe edin

2. 96 oyuklu plakalarda küresel montaj ile 3D kültürler oluşturma

  1. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plakaları 3 x 10 mL PBS ile hafifçe çalkalayarak artık ortamı ve bağlanmamış manyetik nanopartikülleri çıkarmak için hücreleri yıkayın.
  2. PBS'yi Petri kabından aspire edin ve hücreleri% 0.25 tripsin-etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) çözeltisi ile 37 ° C'de 2-5 dakika inkübe ederek ayırın.
  3. Hücrelerin ayrılmasını beklerken, manyetik sürücüleri %70 etanol1 ile dezenfekte edin.
  4. Hücreler ayrıldıktan sonra, tripsinin etkisini nötralize etmek için tripsin-EDTA çözeltisinin hacminin 4 katı kadar serum içeren ortam ekleyin ve ardından süspansiyonu konik bir tüpe aktarın.
  5. Süspansiyonu 500 × g'da 10 dakika santrifüjleyin. Peletlere dokunmamaya dikkat ederek süpernatanı aspire edin.
    NOT: Santrifüjlemeden sonra hücreler kahverengi görünmeli ve ortamdaki hücre süspansiyonları normalden daha koyu görünmelidir. Hücreler nanopartiküller1 ile biberli görünmelidir.
  6. Süspansiyondaki hücreleri sayın ve 3D kültürler oluşturmak için gereken orta hacimlerin hacmini hesaplayın. Adiposferoidler için, 96 oyuklu plakalarda 150 μL'de 5.000 ila 10.000 hücre kullanın.
  7. 96 oyuklu bir biyo-baskı kiti kullanarak, Spheroid Drive'ın üst kısmına hücre itici 96 oyuklu bir plaka yerleştirin.
  8. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 150 μL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücrelerin altta bir mıknatıs şeklinde toplanmasını sağlamak için plakayı kapatın.
  9. Yetkin bir sferoid elde etmek için plakayı inkübatördeki küresel sürücü üzerinde 1-2 saat bırakın.
    NOT: Bu kültürler yoğun ve kahverengi görünmeli ve plakaya basılmalıdır (Şekil S1). Şekil S2 , 96 oyuklu plakalarda küresel montajın 3D manyetik baskısının ana adımlarının bir özet iş akışını sunar.

3. Beyaz adipogenez indüksiyonu

  1. Bakım ve indüksiyon ortamını hazırlayın8; Her kullanımdan önce indüksiyon ortamını hazırlayın.
    1. 5 μg/mL insülin (bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanan 10 mg / mL stok) ve 0.5 μM rosiglitazon (dimetil sülfoksit (DMSO) içinde 10 mM stok) içeren bakım ortamı hazırlayın.
    2. Etanolde 0.125 M stoktan 125 μM indometazin, etanolde 2 mg / mL stoktan 2 μg / mL deksametazon, DMSO'da 0.25 M stoktan 0.5 mM izobutil-1-metilksantin (IBMX) ve DMSO'da 10 mM'lik bir stoktan 0.5 μM rosiglitazon içeren indüksiyon ortamı hazırlayın.
      NOT: Çözünmesi için indometasini 60 ° C'ye ısıtın.
  2. 24-48 saat sferoid baskısından sonra, normal tam ortamı indüksiyon ortamıyla değiştirin (gün 0).
  3. 48 saat sonra (2. gün), indüksiyon ortamını bakım ortamıyla değiştirin.
  4. Hücreler tamamen farklılaşana kadar ortamı her 3-5 günde bir değiştirin.
    NOT: Genel olarak, indüksiyon ortamı ile 7-8 günlük stimülasyondan sonra, hücreler olgun yağ hücrelerine farklılaşır ve adiposferoidlerin kenarlarında görülebilen yağ damlacıkları ile doldurulur.

4. Lewis akciğer karsinomu şartlandırılmış besiyeri (LLC-CM) üretimi

  1. 6000 hücre/cm2 yoğunluğunda büyüme ortamında 100 mm hücre kültürü plakalarında Lewis akciğer karsinomu (LL/2) hücrelerini tohumlayın.
    NOT: Büyüme ortamı, %10 fetal sığır serumu (FBS) ve 100 U/mL penisilin-streptomisin içeren Dulbecco'nun modifiye Eagle ortamını (DMEM) içerir.
  2. 2 gün sonra, her plakadaki ortamı taze büyüme ortamı ile değiştirin.
    NOT: LL / 2 hücreleri, yapışkan (daha yüksek sayıda) ve yüzen hücrelerin heterojen bir karışımını içerir.
  3. 2 gün sonra (4. gün), şartlandırılmış ortamı hasat edin ve santrifüjleme (500 × g, 10 dakika) ile hücrelerden ve kalıntılardan arındırın.
  4. Şartlandırılmış ortamın alikotlarını daha sonra kullanmak üzere sıvı nitrojen içinde dondurun.
    NOT: Sferoidleri şartlandırılmış ortamla tedavi etmek için,% 75 taze büyüme ortamı% 25 LLC şartlandırılmış ortamın bir kombinasyonunu kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinin 3D kültüründen adiposferoidler
Hem 3D hem de birleşik 2D kültürler, aynı fare inguinal WAT preparatından (Şekil 1A, Şekil 1B) aynı sayıda SVF hücresi ile kuruldu ve gen ekspresyon markörünü karşılaştırmak için aynı deneysel protokole tabi tutuldu. İndüksiyon ortamı ile uyarılan sferoidler zamanla genişledi. Şekil 2B , olgun adipositler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, WAT'tan birincil SVF hücrelerinden türetilen adiposferoidlerde adiposit farklılaşmasını incelemek için bir 3D hücre kültürü sistemi kurar. Konvansiyonel 2D yapışık kültürle karşılaştırıldığında, bu 3D sistem, in vivo koşullara çok benzeyen AT yeniden modellemesini kolaylaştırır. Son birkaç yılda, çalışmalar, hücrelerin 3 boyutlu olarak kültürlenmesinin, 2 boyutlu bir kültür sistemine kıyasla farklı hücresel morfoloji ve sinyalleşme sağladığını göstermiştir3...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, rekabet eden herhangi bir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, NIH DK117161, DK117163'den SRF'ye ve P30-DK-046200'den Boston Beslenme ve Obezite Araştırma Merkezi'nin Yağ Biyolojisi ve Besin Metabolizması Çekirdeği'ne ve São Paulo Araştırma Vakfı (FAPESP) Hibeleri: 2018/20905-1 ve CNPq 311319/2018-1'den MLBJr'ye.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
3-İzobutil-1-metilksantinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)I-5879Hücre kültürü
96 Kuyulu Biyobaskı Kiti, siyahGreiner (Monroe, NC, ABD)655841Hücre kültürü
Alexa Fluor 647 AffiniPure F (ab ') 2 < / sub> Parça Eşek Anti-Tavşan IgG (H + L)Jackson ImmunoResearch711-606-152İmmünofloresan boyama, ikincil, TBS'de 1:400 % 0.1 ARA-20
HÜCRE KÜLTÜRÜ MİKROPLAKA, 96 KUYU, PS, F-ALT VE mikro ile; ŞEFFAF, SİYAH, CELLSTAR, HÜCRE İTICI YÜZEY, KAPAK, STERIL, 8 ADET/TORBAGreiner (Monroe, NC, ABD)655976Hücre kültürü
DeksametazonSigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)D-1756Hücre kültürü
DMEMCorning (Manassas, VA, ABD)10-017-CVHücre kültürü
Fetal Sığır Serumu (Tova)Gemini Bio (West Sacramento, CA)100-500Hücre kültürü
IndometasinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)I-7378Hücre kültürü
İnsülinSigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)I0516Hücre kültürü
LL / 2 (LLC1) (ATCC CRL-1642)Amerikan Tipi Kültür Koleksiyonu (Manassas, VA, ABD)CRL-1642Lewis Akciğer Karsinomu hücre hattı
NanoShuttle-PLGreiner (Monroe, NC, ABD)657843Hücre kültürü
NucBlue Sabit Hücreli ReadyProbes Reaktifi (DAPI)ThermoFisher (Waltham, MA, ABD)R37606İmmünofloresan boyama, üreticinin talimatlarına uygun
Pen strepCorning (Manassas, VA, ABD)30-002-CIHücre kültürü
Perilipin-1 (D1D8) XP  Tavşan mAbHücre Sinyalizasyon Teknolojisi (Danvers, MA, ABD)9349İmmünofloresan boyama, birincil,% 0.1 Tween-20
RosiglitazonSigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD)R-2408Hücre kültürü
Tripsin-EDTA,% 0.05Corning (Manassas, VA, ABD)25-052-CIHücre kültürü
Ters transkripsiyon PCR primerleri< / güçlü >
< güçlü > Astar< / güçlü >< güçlü >İleri< / güçlü > <güçlü > Ters< / güçlü >
Adipoq< / em >GTTCCCAATGTACCCATTCGCTGTTGCAGTAGAACTTGCCAG
Col4a1< / em>TCCAAGGGCGAAGTGGGTTTACCCTTGCTCGCCTTTGACT
em>Siklofilin aATGGCACTGGCGGCAGGTCCTTGCCATTCCTGGACCCAAA
Fabp4TGGTGACAAGCTGGTGGTGGAATGTCCAGGCCTTCCTTTGGCTCA
Fn1GCTTCCCCAACTGGTTACCCTGGGTTGGTGATGAAGGGGGT
Pgc1aGAAAACAGGAACAGCAGCAGAGGGGGTCAGAGGAAGAGATAAAG
Ucp1TCCTAGGGACCATCACCACCCAGCCGGCTGAGATCTTGTTTCC
strong>Mouse genotyping
Primer adıDescriptionSequence
Cre FJenerik Cre ileriGCG GTC TGG CAG TAA AAA CTA TC
Cre RJenerik Cre tersGTG AAA CAG CAT TGC TGT CAC TT
oIMR7318mT/mG ileriCTC TGC TGC CTC CTG GCT TCT
oIMR7319mT/mG vahşi tip tersCGA GGC GGA TCA CAA GCA ATA
oIMR7320mT/mG mutant tersTCA ATG GGC GGG GGT CGT T
WH336UCP1 mutant ileriCAA TCT GGG CTT AAC GGG TCC TC
WH337UCP1 mutant tersGTT GCA TCG ACC GGT TAA TGC AG
WH338UCP1 vahşi tip ileriGGT CAG CCT AAT ETIKETI CTC TGT
WH339UCP1 vahşi tip tersGAT CTC CAG CTC CTC CTC TGT C
olarak ile TBS'de 1:1000 <<

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Haisler, W. L., et al. Three-dimensional cell culturing by magnetic levitation. Nature Protocol. 8 (10), 1940-1949 (2013).
  2. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (10), 839-845 (2007).
  3. Eisenstein, M. Organoids: the body builders. Nature Methods. 15 (1), 19-22 (2018).
  4. Henriques, F., Júnior, M. L. B. Adipose tissue remodeling during cancer-associated cachexia: Translational features from adipose tissue dysfunction. Immunometabolism. 2 (4), 200032(2020).
  5. Tseng, H., et al. A spheroid toxicity assay using magnetic 3D bioprinting and real-time mobile device-based imaging. Scientific Reports. 5 (1), 13987(2015).
  6. Akama, T., Leung, B. M., Labuz, J., Takayama, S., Chun, T. H. Designing 3-D adipospheres for quantitative metabolic study. Methods Molecular Biology. 1566, 177-183 (2017).
  7. Muller, S., et al. Human adipose stromal-vascular fraction self-organizes to form vascularized adipose tissue in 3D cultures. Scientific Reports. 9 (1), 7250(2019).
  8. Aune, U. L., Ruiz, L., Kajimura, S. Isolation and differentiation of stromal vascular cells to beige/brite cells. Journal of Visualized Experiments. (73), e50191(2013).
  9. Henriques, F., et al. Toll-like receptor-4 disruption suppresses adipose tissue remodeling and increases survival in cancer cachexia syndrome. Scientific Reports. 8 (1), 18024(2018).
  10. Kir, S., et al. Tumour-derived PTH-related protein triggers adipose tissue browning and cancer cachexia. Nature. 513 (7516), 100-104 (2014).
  11. Petruzzelli, M., et al. A switch from white to brown fat increases energy expenditure in cancer-associated cachexia. Cell Metabolism. 20 (3), 433-447 (2014).
  12. Lopes, M. A., Oliveira Franco, F., Henriques, F., Peres, S. B., Batista, M. L. LLC tumor cells-derivated factors reduces adipogenesis in co-culture system. Heliyon. 4 (7), 00708(2018).
  13. Wang, H., Liu, L., Lin, J. Z., Aprahamian, T. R., Farmer, S. R. Browning of white adipose tissue with roscovitine induces a distinct population of UCP1(+) adipocytes. Cell Metabolism. 24 (6), 835-847 (2016).
  14. Grinnell, F. Fibroblast biology in three-dimensional collagen matrices. Trends Cell Biology. 13 (5), 264-269 (2003).
  15. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Molecular Biology. 945, 193-219 (2013).
  16. Fisher, M. F., Rao, S. S. Three-dimensional culture models to study drug resistance in breast cancer. Biotechnology Bioengineering. 117 (7), 2262-2278 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Cachexia Induced WAT RemodelingMagnetic Nanoparticle SystemProgenitor CellsBeige RemodelingAdipocyte LipolysisAdipogenesis ReductionImmune Cell AccumulationBeige Brite Cells
Video yakında

İlgili makaleler