Method Article

Yüksek İçerikli Görüntüleme Analizi Kullanarak Kardiyak Yeniden Programlamanın Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek içerikli görüntüleme analizi kullanarak in vitro olarak doğrudan yeniden programlanmış indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri hücreleri (iCM'ler) ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, kardiyak yeniden programlamanın verimliliğini otomatik bir şekilde ölçmemize ve iCM'leri doğrudan görselleştirmemize olanak tanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, bir yeniden programlama tekniği ile doğrudan in vitro olarak yeniden programlanan indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri hücrelerin (iCM'ler) ölçülmesi için bir yöntemi tanımlamaktır. Kardiyak yeniden programlama, yeni kardiyomiyositler oluşturmak için bir strateji sağlar. Fibroblastlara çekirdek kardiyojenik transkripsiyon faktörlerini ekleyerek; fibroblastlar, pluripotent kök hücre durumundan geçiş olmadan iCM'lere dönüştürülebilir. Bununla birlikte, fibroblastların iCM'lere dönüşüm oranı hala düşük kalmaktadır. Buna göre, kardiyak yeniden programlama verimliliğini artırmak için çok sayıda ek yaklaşım olmuştur. Bu çalışmaların çoğu, akış sitometrisi kullanarak kardiyak yeniden programlama verimliliğini değerlendirirken, aynı zamanda iCM'leri görselleştirmek için immünositokimya gerçekleştirdi. Bu nedenle, iCM yeniden programlamanın başarısını göstermek için en az iki ayrı yeniden programlama deneyi seti gereklidir. Buna karşılık, otomatik yüksek içerikli görüntüleme analizi, nispeten az sayıda hücre ile iCM yeniden programlamasının hem nicelleştirilmesini hem de kalifikasyonunu sağlayacaktır. Bu yöntemle, tek bir yeniden programlama deneyi ile iCM'lerin miktarını ve kalitesini doğrudan değerlendirmek mümkündür. Bu yaklaşım, yeniden programlama verimliliğini artırmak için genetik veya farmakolojik faktörlerin taranması gibi büyük ölçekli yeniden programlama deneyleri gerektiren gelecekteki kardiyak yeniden programlama çalışmalarını kolaylaştırabilecektir. Ek olarak, yüksek içerikli görüntüleme analiz protokolünün uygulanması, kardiyak yeniden programlama ile sınırlı değildir. Diğer hücre soylarının yeniden programlanmasının yanı sıra, immün tipi hücrelerin hem nicelleştirilmesine hem de görselleştirilmesine ihtiyaç duyan herhangi bir immün boyama deneyine uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak yeniden programlama, yeni kardiyomiyositler oluşturmak için kök hücre aracılı yaklaşımlara alternatif bir yaklaşım olarak geliştirilmiştir. Kök hücre durumundan geçmediği göz önüne alındığında, kök hücre aracılı yaklaşımlarda bazı kalıtsal sınırlamaları atlama potansiyeli yüksektir. En az üç veya dört kardiyojenik transkripsiyon faktörünün fibroblastlara viral enfeksiyonunun, fibroblast gen programlarını ortadan kaldırarak ve fibroblastlarda kardiyojenik transkripsiyonel ağları yeniden inşa ederekfibroblastları kardiyak bir kadere dönüştürebileceği gösterilmiştir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan işlemleri Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Retrovirüs üretimi ve in vitro kardiyak yeniden programlama

  1. Platin E hücre birleşmesi %70-80'e ulaşana kadar %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin, 1 μg/mL puromisin ve 10 μg/mL blastisidin ile desteklenmiş DMEM'deki kültür Platin E hücreleri.
  2. 1. Günde, ~ 0.55 x 106 hücre (ilk kuyucuk) ve ~ 0.18 x 106 hücre (ikinci kuyucuk), ilk transfeksiyondan bir gün önce% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 1 mL DMEM ile 12 oyuk....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeniden programlama deneylerini takiben, yukarıda açıklandığı gibi yüksek içerikli görüntüleme analizi kullanarak iCM'leri ölçtük. Yüksek içerikli görüntüleme analizi için kullanılan 36 görüntüleme bölgesinin kompozit görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. iCM'ler bu deneylerde çift pozitif hücreler (α-aktinin+Titin-eGFP+) olarak tanımlanır. Yüksek içerikli görüntüleme analizi, hücrelerin ~% 26'sının M-G-T-H transdüksiyonunu takiben her iki kardiyak belirteç sergilediği.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki yeniden programlama çalışmaları, akış sitometrisi kullanarak yeniden programlama verimliliğini değerlendirdi ve iki ayrı deneyde immünositokimya kullanarak iCM'lerin yapısal kalitesini gösterdi. Akış sitometrisi analizi, çok daha fazla sayıda başlangıç hücresi gerektirir, böylece deneylerin ölçeğini arttırır. Buna karşılık, yüksek içerikli görüntüleme analizi, nispeten az sayıda hücre ile tek bir deneyle iCM yeniden programlamasının hem kalitesini hem de miktarını değerlendirebili.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek içerikli görüntüleme analizi, David Westover ve Joshua Bauer'in yardımıyla Vanderbilt Yüksek Verimli Tarama (HTS) Çekirdek Tesisinde gerçekleştirildi. HTS Core, Vanderbilt Kimyasal Biyoloji Enstitüsü ve Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi'nden (P30 CA68485) destek almaktadır. Bu çalışma, AHA Yenilikçi Proje Ödülü 18IPA34110341 ve NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.) ve AHA doktora sonrası burs ödülü 20POST35210170 (Z.Z.) tarafından desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
anti-tavuk Alexa 488ThermofisherA11039
anti-GFP antikoruInvitrogenA10262
anti-fare Alexa 555ThermofisherA21422
anti-&alfa;-aktinin antikoruSigmaA7811
DAPI çözeltisiVektör laboratuvarlarıH1200
Fugene 6PromegaE2691
İnsülin-Transferrin-SelenyumG takviyesiInvitrogen41400-045
Orta 199Invitrogen11150059
MEM vitamin çözeltisiInvitrogen11120-052
MetaXpress yazılımıMoleküler cihaz
Micro XL otomatik hücre görüntüleme sistemiMoleküler cihaz
Minimal esansiyel amino asit çözeltisiSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
PES filtresi (0.45 & mikro; m)Thomas bilimsel1159T84
Platninum E hücreleriHücre BiolabsRV-101
PolibrenSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
Evrensel engelleme tamponuBiogeneXHK083-50K

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature.....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac ReprogrammingHigh Content ImagingInduced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
Video Coming Soon

Related Articles