Method Article

Yüksek İçerikli Görüntüleme Analizi Kullanarak Kardiyak Yeniden Programlamanın Değerlendirilmesi

DOI:

10.3791/61859

⸱

October 26th, 2020

 , 
1Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Department of Cell and Developmental Biology, Vanderbilt University, 3Vanderbilt Center for Stem Cell Biology, Vanderbilt University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek içerikli görüntüleme analizi kullanarak in vitro olarak doğrudan yeniden programlanmış indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri hücreleri (iCM'ler) ölçmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, kardiyak yeniden programlamanın verimliliğini otomatik bir şekilde ölçmemize ve iCM'leri doğrudan görselleştirmemize olanak tanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün amacı, bir yeniden programlama tekniği ile doğrudan in vitro olarak yeniden programlanan indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri hücrelerin (iCM'ler) ölçülmesi için bir yöntemi tanımlamaktır. Kardiyak yeniden programlama, yeni kardiyomiyositler oluşturmak için bir strateji sağlar. Fibroblastlara çekirdek kardiyojenik transkripsiyon faktörlerini ekleyerek; fibroblastlar, pluripotent kök hücre durumundan geçiş olmadan iCM'lere dönüştürülebilir. Bununla birlikte, fibroblastların iCM'lere dönüşüm oranı hala düşük kalmaktadır. Buna göre, kardiyak yeniden programlama verimliliğini artırmak için çok sayıda ek yaklaşım olmuştur. Bu çalışmaların çoğu, akış sitometrisi kullanarak kardiyak yeniden programlama verimliliğini değerlendirirken, aynı zamanda iCM'leri görselleştirmek için immünositokimya gerçekleştirdi. Bu nedenle, iCM yeniden programlamanın başarısını göstermek için en az iki ayrı yeniden programlama deneyi seti gereklidir. Buna karşılık, otomatik yüksek içerikli görüntüleme analizi, nispeten az sayıda hücre ile iCM yeniden programlamasının hem nicelleştirilmesini hem de kalifikasyonunu sağlayacaktır. Bu yöntemle, tek bir yeniden programlama deneyi ile iCM'lerin miktarını ve kalitesini doğrudan değerlendirmek mümkündür. Bu yaklaşım, yeniden programlama verimliliğini artırmak için genetik veya farmakolojik faktörlerin taranması gibi büyük ölçekli yeniden programlama deneyleri gerektiren gelecekteki kardiyak yeniden programlama çalışmalarını kolaylaştırabilecektir. Ek olarak, yüksek içerikli görüntüleme analiz protokolünün uygulanması, kardiyak yeniden programlama ile sınırlı değildir. Diğer hücre soylarının yeniden programlanmasının yanı sıra, immün tipi hücrelerin hem nicelleştirilmesine hem de görselleştirilmesine ihtiyaç duyan herhangi bir immün boyama deneyine uygulanabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyak yeniden programlama, yeni kardiyomiyositler oluşturmak için kök hücre aracılı yaklaşımlara alternatif bir yaklaşım olarak geliştirilmiştir. Kök hücre durumundan geçmediği göz önüne alındığında, kök hücre aracılı yaklaşımlarda bazı kalıtsal sınırlamaları atlama potansiyeli yüksektir. En az üç veya dört kardiyojenik transkripsiyon faktörünün fibroblastlara viral enfeksiyonunun, fibroblast gen programlarını ortadan kaldırarak ve fibroblastlarda kardiyojenik transkripsiyonel ağları yeniden inşa ederekfibroblastları kardiyak bir kadere dönüştürebileceği gösterilmiştir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,17.

İn vitro1'de kardiyak yeniden programlamayı gösteren ilk dönüm noktası çalışmasından bu yana, kardiyak yeniden programlama protokolü çok sayıda çalışma ile optimize edilmiştir 3,5,6,7,9,11,12,13,14,15,16,18 . Kardiyak yeniden programlamayı takiben fibroblastlardaki kardiyak fenotipleri değerlendirmek için yaygın teknik yaklaşımlar, spesifik kardiyomiyosit belirteçlerini eksprese eden hücreleri ölçmek için akış sitometrisi analizi ve bu hücreleri tek bir hücre düzeyinde görselleştirmek için immünositokimya olmuştur. Her iki deney de (yani akış sitometrisi ve immünositokimya) aynı antikorları kullanarak kardiyomiyosit belirteçlerinin ekspresyonunu gösterecek olsa da, ayrı ayrı gerçekleştirilmeleri gerekir. Ek olarak, akış sitometrisi nispeten daha fazla sayıda hücreye ihtiyaç duyar, böylece deney için gereken reaktif miktarını arttırır. Alternatif olarak, kardiyomiyosit marker pozitif hücreler, immünositokimyayı takiben manuel sayım ile ölçülebilir. Bununla birlikte, çok emek yoğundur ve daha az doğru olma eğilimindedir.

Bu protokolün amacı, otomatik yüksek içerikli görüntüleme analizi kullanarak tek bir immün boyama deneyi ile iCM'leri ölçebilen ve görselleştirebilen yöntemi tanımlamaktır. Nispeten az sayıda başlangıç hücresi gerektirir, çünkü bu protokol 24 oyuklu bir plakada gerçekleştirilir. Aynı anda en fazla üç farklı işaretleyici kullanılabilir. Tek, çift ve üçlü pozitif hücreler otomatik olarak ölçülebilir. İmmün lekeli hücrelerin miktar tayinine ek olarak, yüksek içerikli görüntüleme analizi, yüksek kaliteli 2-100x objektif görüntüler sağlar. Gerekirse, yüksek içerikli görüntüleme analizinde kullanılan aynı immün boyalı hücreler, konfokal mikroskopi gibi daha ileri görüntüleme çalışmaları için yeniden kullanılabilir. Bu protokolün temel avantajı, yalnızca çok daha az sayıda hücreye sahip iCM'lerin tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlamakla kalmayıp, aynı zamanda iCM'lerin görselleştirilmesini de sağlamasıdır. Ayrıca, bu protokol kardiyak olmayan soy yeniden programlamasını değerlendirmek için kullanılabilir (örneğin, iPSC, nöron ve hepatosit yeniden programlama).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan işlemleri Vanderbilt Üniversitesi Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi onayı ile gerçekleştirilmiştir.

1. Retrovirüs üretimi ve in vitro kardiyak yeniden programlama

  1. Platin E hücre birleşmesi %70-80'e ulaşana kadar %10 FBS, %1 penisilin/streptomisin, 1 μg/mL puromisin ve 10 μg/mL blastisidin ile desteklenmiş DMEM'deki kültür Platin E hücreleri.
  2. 1. Günde, ~ 0.55 x 106 hücre (ilk kuyucuk) ve ~ 0.18 x 106 hücre (ikinci kuyucuk), ilk transfeksiyondan bir gün önce% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş 1 mL DMEM ile 12 oyuklu plakanın iki ayrı kuyucuğuna tohumlayın.
    NOT: Deneyler için gereken viral ortam miktarına bağlı olarak farklı boyutlarda kültür kapları kullanılabilir. Diğer deney ölçekleri için Tablo 1'e bakın.
  3. 2. Günde, önceki çalışma9'da açıklanan Mef2c, Gata4, Tbx5 ve Hand2'yi kodlayan dörtlü sistronik MGTH retroviral yapısını veya boş vektörü ilk oyuğun Platin E hücrelerine aktarın. 30 μL indirgenmiş serum ortamına 3 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin. Beş dakika sonra, transfeksiyon reaktifi ve indirgenmiş serum ortamı karışımına 1 μg retroviral yapı veya boş vektör ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübasyondan sonra, karışımı Platin E hücrelerine ekleyin.
  4. 3. Günde, transfeksiyondan 16-20 saat sonra, ortamı çıkarın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş taze DMEM'i doldurun.
  5. 3. Günde, ilk transfeksiyondan 24 saat sonra, ikinci transfeksiyonu, adım 1.3'te açıklandığı gibi 1. Günde Platin E hücrelerinin kaplandığı ikinci kuyucuğa gerçekleştirin).
  6. 3. Günde, Titin-GFP muhabiri knock-in farelerden19 izole edilen ~ 5 x 104 donmuş fare embriyonik fibroblastlarını (MEF'ler) 24 oyuklu bir plakadan oluşan bir kuyuya tohumlayın. 24 oyuklu plakadan oluşan toplam iki kuyuya ihtiyaç vardır (yani, enfekte olmamış kontrol ve M-G-T-H enfeksiyonu).
    NOT: Donmuş MEF'lerin geri kazanım oranı hücre dondurma koşullarına bağlı olarak değişebileceğinden, kaplanan MEF sayısının ayarlanması gerekebilir. Hücrelerin tohumlanmasından sonra günde yaklaşık% 10 birleşme yeniden programlama için yeterlidir. Yeniden programlama verimliliği, taze dondurulmamış MEF'ler kullanılarak artırılabilir.
  7. 4. Günde, ikinci transfeksiyondan 16-20 saat sonra, ortamı çıkarın ve% 10 FBS ve% 1 penisilin / streptomisin ile desteklenmiş taze DMEM'i doldurun.
  8. 4. Günde, ilk transfeksiyondan 48 saat sonra, viral ortamı 5 mL'lik bir şırınga kullanarak Platin E hücrelerinin ilk kuyucuğunda toplayın ve bunları 0.45 μm polietersülfon (PES) membran filtresinden süzün. MEF'ler üzerindeki fibroblast büyüme ortamını çıkarın ve bunları 6 μg / mL'de (ilk enfeksiyon) polibren ile takviye edilmiş viral medya ile değiştirin.
  9. 5. Günde, ikinci transfeksiyondan 48 saat sonra, adım 1.8'de açıklandığı gibi ikinci kuyudaki viral ortamı kullanarak ikinci enfeksiyonu gerçekleştirin).
  10. 6. Günde, ikinci enfeksiyondan 24 saat sonra, viral ortam DMEM/199 (4:1), %10 FBS, %5 at serumu, %1 penisilin/streptomisin, %1 esansiyel olmayan amino asitler, %1 esansiyel amino asitler, %1 B-27, %1 insülin-selenyum-transferrin, %1 vitamin karışımı ve %1 sodyum piruvat, 1 μM SB431542 ve 0.5 μm A83-01'den oluşan kardiyak indüksiyon ortamı ile değiştirilir. Hücreler toplanana kadar kardiyak indüksiyon ortamını her üç günde bir değiştirin.

2. İmmün boyama

  1. Enfeksiyondan 14-15 gün sonra, hücreleri 15 dakika boyunca% 2 paraformaldehit içeren 24 oyuklu bir plakaya sabitleyin.
  2. Hücreleri her 5 dakikada bir geçirgenlik tamponu ile üç kez yıkayarak sabit hücreleri geçirgenleştirme tamponu (PBS'de %0.05 Triton-X) ile geçirgenleştirin.
  3. Hücreleri 45 dakika boyunca evrensel engelleme tamponu ile inkübe edin.
  4. Hücreleri fare α-aktinin (1:400 seyreltme) ve tavuk GFP antikorları (1:400 seyreltme) ile oda sıcaklığında 1.5 saat inkübe edin.
    NOT: Yaklaşık 150 μL antikor çözeltisi, 24 oyuklu bir plakanın tüm alanını kaplayabilir.
  5. Hücreleri geçirgenlik tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  6. Hücreleri anti-fare Alexa-555 ve anti-tavuk Alexa-488 ikincil antikorları (1:400 seyreltme) ile oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin
  7. Hücreleri geçirgenlik tamponu ile 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
  8. 250 μL geçirgenlik tamponuna 2,5 μL DAPI çözeltisi ekleyin.

3. Yüksek içerikli görüntüleme

  1. Görüntüleme sistemini açın.
  2. İlgili yazılımı açın.
  3. Sisteme giriş yapın.
  4. Görev çubuğunda, Bir Plaka Çalıştır'ı seçin.
  5. Makinenin kapağını açmak ve plakayı yerine koymak için Açık Kapı Çıkarma Plakasına tıklayın. Plakanın doğru yönde olduğundan emin olun. Kapıyı kapatmak için Kapı Yükleme Plakasını Kapat'a tıklayın.
  6. Yük plakası ayarlarına tıklayın. Bir şablon protokolü seçin ve ardından DB'den Yükle'ye tıklayın.
  7. Edinme Kurulumu'na tıklayın.
  8. Plaka Alma Kurulumu iletişim kutusunda, Yapılandır'a tıklayın.
  9. Hedef ve Kamera sekmesinde 10x hedef öğesini seçin.
  10. Plaka sekmesinde 24 oyuklu bir plaka seçin.
  11. Site Seçenekleri'ndeki Ziyaret Edilecek Siteler sekmesinde, sütun ve satırlardaki sayıyı seçerek görüntüleme sitelerinin sayısını belirlemek için "Sabit site sayısı"nı seçin. 6 sütun ve 6 satır seçilerek toplam 36 görüntüleme sitesi kullanılır. Her görüntüleme bölgesi arasındaki Boşluğu seçin (yani, 500 μm).
  12. Edinme sekmesinde, dalga boyu sayısını 3 olarak ayarlayın.
  13. Aydınlatma üzerindeki Dalga Boyları sekmesinde, her dalga boyu için ayrı ayrı DAPI, FITC veya Texas Red'i seçin.
  14. Çalıştır sekmesine tıklayın ve ardından plaka için "Klasör Adı" ve "Plaka Adı"nı ayarlayın.  Görüntüleme için plaka diyagramındaki kuyucuklara tıklayın ve ardından her dalga boyu için odak ofsetini ayarlamak için Hesapla'ya tıklayın. Önce DAPI için foucs ofsetini ayarlayın. Her dalga boyu için pozlama süresini otomatik olarak ayarlamak için Otomatik Pozlama'ya tıklayın. Ardından, seçilen siteleri görüntülemeye başlamak için Plaka Al'a tıklayın.

4. Yüksek içerikli görüntülemenin analizi

  1. Yüksek içerikli görüntüleme tamamlandıktan sonra, Tarama menüsüne tıklayın ve analiz için bir plaka seçmek için Plaka Verilerini Gözden Geçir'i seçin.
  2. Plaka Seç'e tıklayın. İnceleme için Plaka Seç iletişim kutusunda, klasörü açın ve veritabanına kaydedilen plakayı seçin ve ardından Seç'e tıklayın.
    NOT: Görüntüleri görüntülemek için, Wavelengths (Dalga Boyu) alanında DAPI, FITC ve Texas Red'i seçin. Siteler alanında, Tüm Siteler'i seçin. Her dalga boyu görüntü penceresinde görüntülemek için seçilen 36 site arasından bir siteye tıklayın ve ardından dalga boyu için bir renk seçmek üzere Arama Tablosu'na tıklayın. Klavyedeki Print Screen tuşunu kullanın ve görüntüyü kaydetmek için bir fotoğraf düzenleme yazılımına (ör. Paint ve Photoshop) yapıştırın.
  3. Analizi Çalıştır'a tıklayın ve bir şablon ayarı seçin.
  4. Ayarları Yapılandır'a ve ardından Dalga Boyu Sayısı'na tıklayın. Üç dalga boyu seçin (yani, çekirdek boyama için DAPI, α-aktinin için Teaxs Red ve Titin-GFP için FITC).
  5. Araç çubuğundaki Çizgi aracını kullanarak, bir hücrenin kısa ekseni boyunca genişliği ölçün. Ölçülen hücre genişliklerine bağlı olarak, "Yaklaşık minimum genişlik" ve "Yaklaşık maksimum genişlik"i seçilen görüntüleme alanındaki hücrelerin çoğunu içerecek şekilde ayarlayın.
  6. Neredeyse tüm çekirdeklerin seçilip seçilmediğini kontrol etmek için Önizleme'ye tıklayın. Seçilen çekirdekler beyaz renk sergilerken, seçilmemiş çekirdekler mavi kalır (DAPI lekeli). Gerekirse, "Yaklaşık minimum genişlik" ve "Yaklaşık maksimum genişlik" için ayarlamalar yapın.
  7. Yoğunluğu Yerel Arka Planın Üzerine ayarlamak için, fare imlecini bir hücrenin içine ve dışına yerleştirin. Yoğunluk değeri pencerenin alt kısmında görünür. Her hücrenin tüm alanı boyunca yoğunluğu eşit şekilde sergilemek için loş bir hücrenin yoğunluğunu hafifçe azaltın. Bu yoğunluk değerini Yerel Arka Planın Üzerindeki Yoğunluk değeri olarak tanımlayın. Bu değerin her kanal için ayrı ayrı ayarlanması gerekir.
  8. Tarama menüsüne tıklayın ve Plaka Veri Yardımcı Programları'nı seçin. Plaka Veri Yardımcı Programları iletişim kutusunda, plakayı seçmek için Analizi Çalıştır'a tıklayın.
  9. Ayarlar alanında, analiz için kaydedilen ayarı seçin; Otomatik Çalıştırma Listesine Ekle'yi seçin ve ardından analizi çalıştırmak için Tamam'a tıklayın.
  10. Analiz tamamlandıktan sonra, Tarama menüsüne tıklayın ve Plaka Veri Yardımcı Programlarını seçin. Ardından, Plaka Veri Yardımcı Programları iletişim kutusunda, analiz sonuçlarını dışa aktarmak için Ölçümleri Dışa Aktar'a tıklayın.
  11. Hücre ve Görüntü Ölçümleri'ne ve ardından Tamam'a tıklayın.
  12. Ölçümleri Dışa Aktarma Sihirbazı - Adım 1 sayfasında, plakayı seçin ve İleri'ye tıklayın.
  13. Ölçümleri Dışa Aktarma Sihirbazı - Adım 2 sayfasında, Son'a tıklayın.
  14. Veri Dışa Aktarmayı Yapılandır sayfasında, veri türlerini seçin (yani, kuyu adı, toplam hücre numarası, DAPI+ için alt toplam hücre numarası, Texas Red+ için alt toplam hücre numarası, FITC+ için alt toplam hücre numarası, DAPI+Texas Red+ için alt toplam hücre numarası, DAPI+FITC+ için alt toplam hücre numarası, DAPI+FITC+Texas Red+ için alt toplam hücre numarası, DAPI+ hücrelerinin yüzdesi, DAPI+Texas Red+ hücrelerinin yüzdesi, DAPI+FITC+ hücrelerinin yüzdesi ve DAPI+Texas Red+FITC+ hücrelerinin yüzdesi) ve ardından Tamam'a tıklayın.
  15. Metin dosyası olarak dışa aktar sayfasında, dosyayı kaydetmek için hedefi seçin ve Tamam'a tıklayın.
  16. Dosyayı Microsoft Excel'de açın. Sonuçlar her site tarafından sunulacaktır (Tablo 2). Kuyu başına 36 site var. Analiz aracı olan Pivot Table'ı kullanarak, 36 sitenin verilerini özetleyin (yani, hücre sayılarının toplamı ve tüm 36 sitedeki belirtilen hücre yüzdesinin ortalamaları) (Tablo 3).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yeniden programlama deneylerini takiben, yukarıda açıklandığı gibi yüksek içerikli görüntüleme analizi kullanarak iCM'leri ölçtük. Yüksek içerikli görüntüleme analizi için kullanılan 36 görüntüleme bölgesinin kompozit görüntüleri Şekil 1'de gösterilmiştir. iCM'ler bu deneylerde çift pozitif hücreler (α-aktinin+Titin-eGFP+) olarak tanımlanır. Yüksek içerikli görüntüleme analizi, hücrelerin ~% 26'sının M-G-T-H transdüksiyonunu takiben her iki kardiyak belirteç sergilediği...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Önceki yeniden programlama çalışmaları, akış sitometrisi kullanarak yeniden programlama verimliliğini değerlendirdi ve iki ayrı deneyde immünositokimya kullanarak iCM'lerin yapısal kalitesini gösterdi. Akış sitometrisi analizi, çok daha fazla sayıda başlangıç hücresi gerektirir, böylece deneylerin ölçeğini arttırır. Buna karşılık, yüksek içerikli görüntüleme analizi, nispeten az sayıda hücre ile tek bir deneyle iCM yeniden programlamasının hem kalitesini hem de miktarını değerlendirebili...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yüksek içerikli görüntüleme analizi, David Westover ve Joshua Bauer'in yardımıyla Vanderbilt Yüksek Verimli Tarama (HTS) Çekirdek Tesisinde gerçekleştirildi. HTS Core, Vanderbilt Kimyasal Biyoloji Enstitüsü ve Vanderbilt Ingram Kanser Merkezi'nden (P30 CA68485) destek almaktadır. Bu çalışma, AHA Yenilikçi Proje Ödülü 18IPA34110341 ve NIH R01 HL146524 (Y-.J. N.) ve AHA doktora sonrası burs ödülü 20POST35210170 (Z.Z.) tarafından desteklenmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
A83-01Tocris2939
anti-tavuk Alexa 488ThermofisherA11039
anti-GFP antikoruInvitrogenA10262
anti-fare Alexa 555ThermofisherA21422
anti-&alfa;-aktinin antikoruSigmaA7811
DAPI çözeltisiVektör laboratuvarlarıH1200
Fugene 6PromegaE2691
İnsülin-Transferrin-SelenyumG takviyesiInvitrogen41400-045
Orta 199Invitrogen11150059
MEM vitamin çözeltisiInvitrogen11120-052
MetaXpress yazılımıMoleküler cihaz
Micro XL otomatik hücre görüntüleme sistemiMoleküler cihaz
Minimal esansiyel amino asit çözeltisiSigmaM7145
Opti-MEMGibco31905-070
PES filtresi (0.45 & mikro; m)Thomas bilimsel1159T84
Platninum E hücreleriHücre BiolabsRV-101
PolibrenSigmaH9268
SB431542SigmaS4317
Evrensel engelleme tamponuBiogeneXHK083-50K

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  2. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  3. Ifkovits, J. L., Addis, R. C., Epstein, J. A., Gearhart, J. D. Inhibition of TGFbeta signaling increases direct conversion of fibroblasts to induced cardiomyocytes. PLoS One. 9 (2), 89678(2014).
  4. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  5. Muraoka, N., et al. MiR-133 promotes cardiac reprogramming by directly repressing Snai1 and silencing fibroblast signatures. The EMBO Journal. 33 (14), 1565-1581 (2014).
  6. Umei, T. C., et al. Single-construct polycistronic doxycycline-inducible vectors improve direct cardiac reprogramming and can be used to identify the critical timing of transgene expression. International Journal of Molecular Sciences. 18 (8), 1805(2017).
  7. Wang, L., et al. Stoichiometry of Gata4, Mef2c, and Tbx5 influences the efficiency and quality of induced cardiac myocyte reprogramming. Circulation Research. 116 (2), 237-244 (2015).
  8. Zhang, Z., Zhang, A. D., Kim, L. J., Nam, Y. J. Ensuring expression of four core cardiogenic transcription factors enhances cardiac reprogramming. Science Reports. 9 (1), 6362(2019).
  9. Zhang, Z., Zhang, W., Nam, Y. J. Stoichiometric optimization of Gata4, Hand2, Mef2c, and Tbx5 expression for contractile cardiomyocyte reprogramming. Science Reports. 9 (1), 14970(2019).
  10. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nature Communications. 6, 8243(2015).
  11. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  12. Zhou, H., et al. ZNF281 enhances cardiac reprogramming by modulating cardiac and inflammatory gene expression. Genes & Development. 31 (17), 1770-1783 (2017).
  13. Zhou, Y., et al. Bmi1 is a key epigenetic barrier to direct cardiac reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  14. Muraoka, N., et al. Role of cyclooxygenase-2-mediated prostaglandin E2-prostaglandin E receptor 4 signaling in cardiac reprogramming. Nature Communications. 10 (1), 674(2019).
  15. Yamakawa, H., et al. Fibroblast growth factors and vascular endothelial growth factor promote cardiac reprogramming under defined conditions. Stem Cell Reports. 5 (6), 1128-1142 (2015).
  16. Abad, M., et al. Notch inhibition enhances cardiac reprogramming by increasing MEF2C transcriptional activity. Stem Cell Reports. 8 (3), 548-560 (2017).
  17. Protze, S., et al. A new approach to transcription factor screening for reprogramming of fibroblasts to cardiomyocyte-like cells. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 53 (3), 323-332 (2012).
  18. Addis, R. C., et al. Optimization of direct fibroblast reprogramming to cardiomyocytes using calcium activity as a functional measure of success. Journal of Molecular and Cell Cardiology. 60, 97-106 (2013).
  19. da Silva Lopes, K., Pietas, A., Radke, M. H., Gotthardt, M. Titin visualization in real time reveals an unexpected level of mobility within and between sarcomeres. The Journal of Cell Biology. 193 (4), 785-798 (2011).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cardiac ReprogrammingHigh Content ImagingInduced Cardiomyocyte like CellsFlow CytometryImmunocytochemistryTranscription Factor ReprogrammingFibroblast ConversionAutomated Image AnalysisReprogramming EfficiencyGenetic Screening
Video Coming Soon

Related Articles