Yöntem makalesi

Klonal Hematopoez Çalışması İçin Farelerde Kemik İliği Nakli İşlemleri

DOI:

10.3791/61875

⸱

26 Mayıs 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Genetics, University of Virginia School of Medicine, 2Department of Cardiology, Xinqiao Hospital, Army Medical University, 3Department of Cardiology, Osaka City University Graduate School of Medicine, 4Hematovascular Biology Center, Robert M. Berne Cardiovascular Research Center, University of Virginia School of Medicine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kemik iliği naklinin (BMT) üç yöntemini tarif ediyoruz: toplam vücut ışınlamalı BMT, korumalı ışınlamalı BMT ve fare modellerinde klonal hematopoez çalışması için ön koşullandırması olmayan BMT yöntemi (benimseyen BMT).

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonal hematopoez, hematopoetik kök ve progenitör hücrelerde (HSPC) somatik mutasyonların birikmesinden kaynaklanan yaygın bir yaşla ilişkili durumdur. Sürücü genlerindeki mutasyonlar, hücresel zindelik sağlayan, somatik mutasyonu barındıran progeny lökositlere giderek daha fazla yol açan genişleyen HSPC klonlarının gelişmesine yol açabilir. Klonal hematopoez kalp hastalığı, inme ve mortalite ile ilişkili olduğundan, bu süreçleri modelleyen deneysel sistemlerin geliştirilmesi, bu yeni risk faktörünün altında yer alan mekanizmaları anlamanın anahtarıdır. Toplam vücut ışınlama (TBI) gibi farelerde miyeloablatif koşullandırmayı içeren kemik iliği nakli prosedürleri, bağışıklık hücrelerinin kardiyovasküler hastalıklardaki rolünü incelemek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, kemik iliği nişine ve kalp ve beyin gibi diğer ilgi alanlarına eşzamanlı hasar, bu prosedürlerle kaçınılmazdır. Bu nedenle laboratuvarımız TBI'ın neden olduğu olası yan etkileri en aza indirmek veya önlemek için iki alternatif yöntem geliştirmiştir: 1) ışınlama kalkanı ile kemik iliği nakli ve 2) koşulsuz farelere benimseyen BMT. Korumalı organlarda, lokal çevre korunarak klonal hematopoez analizine izin verirken, yerleşik bağışıklık hücrelerinin işlevi bozulmamıştır. Buna karşılık, koşullanmamış farelere benimseyen BMT, hem organların yerel ortamlarının hem de hematopoetik nişinin korunması ek avantaja sahiptir. Burada, üç farklı hematopoetik hücre rekonstrüt yaklaşımını karşılaştırıyoruz ve kardiyovasküler hastalıkta klonal hematopoez çalışmaları için güçlü yönlerini ve sınırlamalarını tartışıyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonal hematopoez (CH), yaşlı bireylerde sıklıkla gözlenen ve genetik mutasyon taşıyan genişletilmiş hematopoetik kök ve progenitör hücre (HSPC) klonunun bir sonucu olarak ortaya çıkan bir durumdur1. 50 yaşına kadar, çoğu bireyin her HSPC2'deortalama beş eksonik mutasyon elde etmiş olacağı ileri sürülmektedir , ancak bu mutasyonların çoğu birey için çok az fenotipik sonuçlara neden olacaktır. Bununla birlikte, bu mutasyonlardan biri HSPC'ye rekabet avantajı sağlıyorsa (örneğin, çoğalmasını, kendini yenilemesini, hayatta kalmasını veya bunların bir kombinasyonunu teşvik ederek), bu mutant klonun diğer HSPC'lere göre tercihli genişlemesine yol açabilir. Sonuç olarak, mutasyona uğramış HSPC olgun kan hücrelerine yol açtıkça mutasyon hematopoetik sisteme giderek daha fazla yayılacak ve periferik kan içinde mutasyona uğramış hücrelerin farklı bir popülasyonuna yol açacaktır. Onlarca farklı aday sürücü genlerindeki mutasyonlar hematopoetik sistem içindeki klonal olaylarla ilişkili olsa da, bunlar arasında DNA metiltransferaz 3 alfa (DNMT3A) ve on bir translokasyon 2 (TET2) mutasyonları en yaygın3 'tür. Çeşitli epidemiyolojik çalışmalar, bu genetik mutasyonları taşıyan bireylerin kardiyovasküler hastalık (CVD), inme ve tüm nedensel mortalite3, 4 ,5,6,7riskinin önemli ölçüde daha yüksek olduğunu bulmuştur. Bu çalışmalar CH ile CVD ve inme insidansının artması arasında bir ilişki olduğunu tespit etmekle birlikte, bu ilişkinin nedensel mi yoksa yaşlanma süreci ile paylaşılan bir epifenomenon mu olduğunu bilmiyoruz. Bu ilişkinin daha iyi anlaşılması için, CH'nin insan durumunu doğru bir şekilde özetleyen uygun hayvan modelleri gereklidir.

Zebra balığı, fare ve insan dışı primatlar 8 , 9 , 10 , 11,12,13,14kullanılarak grubumuz ve diğerleri tarafından çeşitli CH hayvan modelleri kurulmuştur. Bu modeller genellikle genetiği değiştirilmiş hücrelerin nakliyle, bazen Cre-lox rekombinasyonunu veya CRISPR sistemini kullanarak hematopoetik rekonsyon yöntemlerini kullanır. Bu yaklaşım, hematopoetik hücrelerdeki belirli bir gen mutasyonunun hastalık gelişimine nasıl katkıda bulunduğunu değerlendirmek için analizini sağlar. Ek olarak, bu modeller genellikle mutant hücrelerin etkilerini normal veya vahşi tip hücrelerden ayırt etmek için konjenik veya muhabir hücreler kullanır. Çoğu durumda, donör hematopoetik kök hücreleri başarılı bir şekilde engrafe etmek için bir ön koşullandırma rejimi gereklidir.

Şu anda, kemik iliğinin alıcı farelere nakli iki ana kategoriye ayrılabilir: 1) miyeloablatif şartlandırma ve 2) koşulsuz transplantasyon. Miyeloablatif koşullandırma, toplam vücut ışınlama (TBI) veya kemoterapi15olmak üzere iki yöntemden biriyle elde edilebilir. TBI, alıcıyı ölümcül bir gama veya X-ışını ışınlama dozuna tabi tutularak, hızla bölünen hücrelerde DNA kırılmaları veya çapraz bağlantılar üreterek, onarılamaz hale getirerekgerçekleştirilir 16. Busulfan ve siklofosfamide, hematopoetik nişi bozan ve benzer şekilde hızla bölünen hücrelere DNA hasarı veren iki yaygın olarak kullanılan kemoterapi ilacıdır. Miyeloablatif önkoşulların net sonucu, alıcının hematopoetik sistemini yok eden hematopoetik hücrelerin apoptozudur. Bu strateji sadece donör HSPC'lerin başarılı bir şekilde yerleştirilmesine izin verir, aynı zamanda alıcının bağışıklık sistemini baskılayarak greft reddini de önleyebilir. Bununla birlikte, miyeloablatif önkoşul, doku ve organlara ve yerleşik bağışıklık hücrelerine zarar vermenin yanı sıra yerli kemik iliği nişinin tahrip edilmesi gibi ciddi yan etkilere sahiptir17. Bu nedenle, özellikle ilgi organlarının zarar görmesi açısından, bu istenmeyen yan etkilerin üstesinden gelmek için alternatif yöntemler önerilmiştir. Bu yöntemler, alıcı farelerin korumalı ışınlanması ve koşulsuz farelere benimseyen BMT9,17. Bir kurşun bariyerlerin yerleştirilmesiyle toraks, karın boşluğu, kafa veya diğer bölgeleri ışınlamadan korumak, ilgi çekici dokuları ışınlamanın zarar verici etkilerinden korur ve yerleşik bağışıklık hücresi popülasyonlarını korur. Öte yandan, HSPC'lerin koşullanmamış farelere benimseyen BMT'si, doğal hematopoetik niş koruduğu için ek bir avantaja sahiptir. Bu yazıda, farelerde birkaç transplantasyon rejiminden sonra HSPC engraftasyonunun protokollerini ve sonuçlarını, özellikle HSPC'nin TBI farelerine, ışınlamadan kısmen korunan farelere ve koşulsuz farelere teslimini açıklıyoruz. Genel amaç, araştırmacıların her yöntemin farklı fizyolojik etkilerini ve CH ve kardiyovasküler hastalıkların ayarlanmasındaki deneysel sonuçları nasıl etkilediklerini anlamalarına yardımcı olmaktır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan konularını içeren tüm prosedürler Virginia Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Ön koşuldan önce

  1. Alıcı fareleri ışınlamadan önce antibiyotik takviyeli suya (5 mM sülfamethoxazole, 0.86 mM trimethoprim) ~24 saat yerleştirin. Bu, enfeksiyonu önlemek için gereklidir, çünkü bağışıklık sistemi ışınlamadan sonra baskılanacak ve ışınlamadan sonra 2 hafta boyunca korunacaktır. Bu noktada, beslenmeyi teşvik etmek ve ışınlamadan sonra kilo kaybını ve dehidratasyonu önlemek için fareleri bir beslenme / hidrasyon jeli ile destekleyin.

figure-protocol-1
Şekil 1: Çeşitli önkoşul kurulumlarını gösteren görüntüler. (A) Gama ışını (Sezyum-137) kullanılarak pasta kafes toplam vücut ışınlama kurulumu: Radyasyon ışını ışınlayıcının arkasından y ekseni yönünde (yatay radyasyon) gelir. (B) X-ışını kullanılarak fare kafesi toplam vücut ışınlama kurulumu: Fare kafesi yansıtıcı odaya yerleştirilir. Radyasyon ışını ışınlayıcının tepesinden koni şeklinde (dikey radyasyon) gelir. Radyasyon kaynağından kafese olan mesafe 530 mm'dir. (C) X-ışını ışınlayıcısında ayarlanabilir tepsi: Bu kurulum X-ışını kullanılarak kısmen korumalı ışınlama için kullanılır. Radyasyon ışını ışınlayıcının tepesinden koni şeklinde (dikey radyasyon) gelir. Radyasyon kaynağından tepsiye olan mesafe 373 mm ve yarıçapı 250 mm'dir. (D) Toraks koruyucu: Anestezik fareler bir tepsiye yerleştirilir. Fareler, kollar ve bacaklar tamamen uzatılmış olarak supine pozisyonlarında birbirine ters yerleştirilir. Kurşun kalkanın alt ucu xiphisternum kemiği ve üst ucu timus ile hizalanır. (E) Karın koruyucu: Anesteziye uğramış fareler, anüsle hizalanmış kurşun kalkanının alt ucu ve diyaframın altındaki üst uç ile toraks koruyucu düzeneğindeki gibi yerleştirilir. (F) Gama ışını (Sezyum-137) kullanılarak baş koruyucu ışınlama kurulumu: Uyuşturulmuş farenin ataları bantlanır ve fare konik bir kısıtlayıcıya yerleştirilir. Siyah kurşun kalkan (işaretli) farenin başını ve kulaklarını kaplar. Radyasyon ışını ışınlayıcının arkasından Y ekseni yönünde (yatay radyasyon) gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Alıcı farelerin önkoşullanması (isteğe bağlı)

  1. Toplam vücut ışınlama
    1. Alıcı fareleri aynı ışınlama dozunu almak için eşit dilimlenmiş bir pasta kafese veya hesaplanan yarıçap içindeki yansıtıcı hazneye bir fare kafesine yerleştirin; bununla birlikte, düzgün ışınlama sağlamak için pasta kafesi başına en fazla 8 fare ve fare kafesi başına 5 fare önerilir (Şekil 1A,B).
    2. Tam miyeloablasyon elde etmek için, alıcı farelerin 4-24 saat arayla ayrılmış iki 5,5 Gy fraksiyonunda toplam 11 Gy radyasyon dozu aldığından emin olun.
      NOT: Kesirler arasında 4 h aralığı uygulanarak en uygun engraftment elde edilebilirken, bu, işçilik ve/veya ışınlayıcı kullanılamadığında yararlı olabilecek 24 saat aralığına kadar uzatılabilir.
  2. Kısmen korumalı ışınlama
    1. Alıcı fareleri ketamin (80–100 mg/kg) ve ksilazin (5–10 mg/kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile uyuşturun. Fare hareketinin kısıtlanması, koruma işlemi sırasında hedefleme organlarının düzgün ışınlanması ve etkili bir şekilde korunmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir.
    2. Toraks ve karın koruyucu için, X-ışını ışınlayıcısının radyasyon ışınını dikey olarak fareye yönlendirin (Şekil 1C).
      1. Uyuşturulduğu fareleri, radyasyon kaynağını yukarıdan ortalayarak düz bir tabağa yerleştirin. Birbirine ters çevrilmiş fareleri kollar ve bacaklar tamamen uzatılmış bir şekilde bir geri zeka pozisyonuna yerleştirin (Şekil 1D,E).
        NOT: X-ışını ışınlayıcı tesisi, bu deney için, aynı anda iki farenin tek tip ışınlama sağlayan etkili yarıçap içinde konumlandırılabilmesini sağlar. Etkili yarıçap radyasyon kaynağı ve tepsi arasındaki mesafeye göre hesaplanırken, aynı anda ışınlanabilen hayvan sayısı belirli ışınlayıcıya bağlı olacaktır.
      2. Farelerin ışınlama prosedürü sırasında hareketsiz hale getirilmesini sağlamak için farelerin pençelerini bant kullanarak tabağa sabitleyin. Kurşun kalkanını koruma gerektiren bölgeleri kapsayacak şekilde yerleştirin.
      3. Toraks kalkanı için, farenin xiphisternum kemiğinden timusa kadar olan uzunluğu ölçerek ve ışınlama kaynağından yeterli koruma sağlayacak kalınlığı hesaplayarak kurşun kalkanı hazırlayın. Kurşun kalkanı, alt ucu xiphisternum kemiğine hiza olacak şekilde yerleştirin. Kurşun bariyerin üst ucu timusa yakın olacaktır (Şekil 1D).
      4. Karın kalkanı için, farenin anüsünden diyaframa kadar olan uzunluğu ölçerek ve ışınlama kaynağından yeterli koruma sağlayacak kalınlığı hesaplayarak kurşun kalkanı hazırlayın. Kurşun kalkanı, alt ucun anüsle hizalaması için yerleştirin. Kurşun kalkanın üst ucu diyaframın altına sığar (Şekil 1E).
        NOT: Kurşun kalkanın kohortlar arasında tutarlı olacak şekilde yerelleştirilmesi, farelerin büyüklüğüne göre bazı varyasyonları azaltabilir.
    3. Baş koruyucu için, Sezyum ışınlayıcının radyasyon ışınını yatay olarak fareye yönlendirin.
      1. Uyuşturulmuş bir farenin önceden testerelerini dikkatlice karın bölgesine bantleyin. Bu, kolların tam doz ışınlama almasını ve kalkan tarafından kapsanmamasını sağlar.
      2. Baş koruması için, fareyi bir kurşun kalkanın içine sığan konik bir kısıtlayıcıya yerleştirin. Fare konik kısıtlayıcının içine girdikten sonra, kısıtlayıcıyı kurşun kalkan içindeki yuvaya kaydırın (Şekil 1F). Kurşun kalkan, farenin başını ve kulaklarını tamamen örtmelidir (~3,2 cm), farenin vücudunun geri kalanını ışınlama için açıkta bırakmalıdır. Koruyucunun kalkanın içindeki konumu, kalkanın içinde veya dışında daha fazla kaydırarak farklı büyüklükteki hayvanlara uyacak şekilde ayarlanabilir.
      3. Fareleri ışınlama için kaynağa dik olarak ışınlayıcının içine yerleştirin.
    4. Fareleri 4-24 saat arayla ayrılmış iki 5,5 Gy ışınlama fraksiyonuna (toplam 11 Gy dozu) maruz kalın.
    5. Her ışınlama fraksiyonundan sonra, hipotermiyi önlemek ve anesteziden iyileşmeye yardımcı olmak için anestezili farelerin olduğu kafesleri ısıtılmış paspaslara veya kırmızı ısı lambalarının altına yerleştirin.
      NOT: Sıcaktan kaçamadıkları için lamba kullanırken uyuşturulmış fareyi aşırı ısıtmamak için dikkatli olunmalıdır. Yukarıda açıklandığı gibi, hayvanların konumlandırılması ve kurşun kalkanın kalınlığı, ışınlayıcının özel özelliklerine (radyasyon tipi / ışın yönü vb.) dayanan çalışmalar arasında farklılık gösterebilir. Araştırmacıların deneylerini buna göre ayarlamaları gerekecektir.

3. Kemik izolasyonu

NOT: İdeal olarak, donör fareler ve alıcı fareler yaş olarak ve 8-12 hafta içinde benzer olmalıdır. Heterojenliği en aza indirmek için (aynı genotipe sahip fareler kullanırken bile) donör olarak en az 3 fare kullanmak (tek donör yerine) tercih edilir. Tek bir farenin altı kemiğinden (iki uyluk kemiği, iki kaval kemiği ve iki humeri) yaklaşık 40 milyon kırılmamış kemik iliği hücresi elde edilebilir. Her alıcı fareye 5 milyon kemik iliği hücresi nakli tipik olarak engraftasyon sağlayacaktır.

  1. Donör fareleri anestezi olmadan servikal çıkık ile ötenazi (hücrelerin kimyasal kirlenmesini önlemek için tercih edilen yöntem) ve her fareyi emici bir ped üzerine yerleştirin.
  2. % 70 etanol spreyi kullanarak cildi dezenfekte edin.
  3. Göğüs kafesinin altındaki deride küçük bir enine kesim yapın ve cildi kesiğin her iki tarafında sıkıca tutun, baş ve ayaklara doğru ters yönde yırtın. Cildi tüm uzuvlardan soyun.
  4. Omuzları ve dirsek eklemlerini kesin ve humeri elde etmek için bir Kimwipe yardımıyla bağlı kasları ve bağ dokularını çıkarın.
  5. Uyluk kemiği ve kalça kemikleri arasındaki kalça eklemlerini dikkatlice yerinden sökün. Uyluk kemiği başı boyunca kesmek ve bacakları ayırmak için künt makas kullanın. Uyluk kemiği ve kaval kemiğini ayırmak için diz eklemini kesin ve uyluk kemiği ve kaval kemiğini hasat etmek için bir Kimwipe yardımıyla bağlı kasları ve bağ dokularını dikkatlice çıkarın.
    NOT: Bu adım sırasında kemik epifizini sağlam tutmak için özellikle dikkat edin. Sterilite kaybı nedeniyle kırık kemikleri atın. Kalça kemikleri ve omurga kemikleri uyluk kemiği, kaval kemiği ve humerusa ek olarak toplanabilir. Omurga kemiklerini toplamak için, kemikleri parçalara ayırmak ve kemik iliği hücrelerini toplamak için bir harç ve bir pestle kullanılabilir.
  6. İzole edilmiş kemikleri aynı genotipteki farelerden 20 mL buz gibi steril PBS içeren 50 mL konik tüpe yerleştirin ve daha fazla kullanıma kadar buzda tutun. Kemikleri uygun genotiplere sahip tüplere doğru şekilde yerleştirmeye özellikle dikkat edin.
  7. Her fare arasında eldiven değiştiren her donör hayvan için yukarıdaki adımları tekrarlayın. Ayrıca, her fare arasında% 70 etanol ile temiz makas ve diğer aletler.

4. Kemik iliği hücre izolasyonu

NOT: Biyogüvenlik sınıfı II kabinde aşağıdaki adımları uygulayın.

  1. Tüp setlerinin hazırlanması: 18 G iğne kullanarak steril 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünün dibinde küçük bir delik açın ve altta 100 μL buz gibi steril PBS içeren steril 1,5 mL mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
    NOT: 0,5 mL mikrosantrifüj tüpüne sadece altı kemik sığabileceği için, tüm kemikleri aynı anda işlemek için yeterli tüp setleri hazırlanması önerilir.
  2. PBS'yi aspire edin ve izole edilmiş kemikleri steril 100 mm hücre kültürü kabına aktarın. Her kemiği ince epoplar kullanarak tutarak, bir otoklavda sterilize edilmiş küçük makas kullanarak epifizleri dikkatlice kesin. Kesilen kemikleri hazırlanan tüp setlerine yerleştirin.
  3. Tüpleri 4 °C'de 35 s için 10.000 x g'da santrifüj edin.
  4. Santrifüjlemeden sonra, kemik iliğinin kemiklerden başarıyla çıkarıldığını onaylayın. Kemikler, 1,5 mL mikrosantrifüj tüpünün dibinde nispeten büyük bir kırmızı pelet ile beyaz ve yarı saydam görünmelidir. 0,5 mL mikrosantrifüj tüpünü atın.
    NOT: Görsel muayenede 1,5 mL'lik tüpün altındaki kemik iliği tespit edilemezse, kemiği tekrar kesin ve 4.3 adımını tekrarlayın.
  5. Kemik iliğini 1 mL buz gibi PBS'de yeniden depolayın, ardından hücre süspansiyonu aynı genotipten eşleşen 50 mL konik tüpe aktarın.
  6. Hücreleri 10 kez 10 mL şırınga ile 18 G iğneden geçirerek ayrıştırın.
  7. Tek hücreli süspansiyonları 70 μm hücre süzgeçten filtreleyin. 10 mL'lik son hacme ilave buz gibi PBS ekleyin ve pipet yardımının nazik kullanımıyla hücreleri yeniden kullanın.
  8. 4 °C'de 10 dakika boyunca 310 x g'da santrifüj.
  9. Süpernatantı epire edin ve hücre peletini 10 mL serumsuz RPMI ortamı ile yeniden diriltin. Hücre sayımı için bu malzemeden 30 μL ayırın.
  10. Hücre konsantrasyonu bir hücre sayacı ile belirleyin ve transplantasyon için gerekli hücre süspansiyonunun hacmini hesaplayın. 0 BMT örneği için, her alıcı fare için 5 x10 6 kemik iliği hücresi gereklidir.
    NOT: Rekabetçi bir BMT için, donör hücrelerin (örneğin, CD45.2+) ve rakip hücrelerin (örneğin, CD45.1 + ) bir karışımınıiçeren toplam 5 x 106 kemik iliği hücresi hazırlayın. Ekstra kemik iliği hücrelerinin hazırlanması şiddetle tavsiye edilir. Örneğin, deneysel grup başına 10 alıcı fare varsa, genellikle 12 alıcı fare için yeterli hücre hazırlarız.
  11. Hesaplanan hücre süspansiyon hacmini yeni bir 50 mL konik tüpe aktarın. 4 °C'de 10 dakika boyunca 310 x g'da santrifüj.
  12. Uygun hücre yoğunluğunu ve hacmini elde etmek için serumsuz RPMI ortamının hesaplanan miktarını kullanarak süpernatantı aspire edin ve hücreleri yeniden biriktirin. Tipik olarak, 200 μL retro yörünge enjeksiyonu için en uygun hacimdir.

5. Kemik iliği hücrelerinin ışınlanmış farelere nakli

  1. Alıcı fareleri% 5 izofluran ile uyuşturun.
  2. Fareler uyuşturulurken, insülin şırıngalı 28-30 G'lik bir iğne kullanarak retro-orbital damara yavaşça 200 μL kemik iliği hücresi enjekte edin.
    1. Alternatif olarak, donör hücrelerin teslimini kuyruk damarı intravenöz enjeksiyonu ve femoral intramedüller enjeksiyon ile, sırasıyla maksimum 0,2 mL ve 25 μL hacimde gerçekleştirin.
  3. Hücreler enjekte edildikten sonra, ağrı kesici için gözün yüzeyine bir damla proparakain içeren göz damlası yerleştirin. Hayvanın daha sonra bilincini geri kazanmasına izin verilebilir.

6. Kemik iliği hücrelerinin koşullu olmayan farelere nakli

  1. Alıcı fareleri% 5 izofluran soluyarak uyuşturun.
  2. 28-30 G insülin şırındingli ışınlanmamış alıcı farelere retro-yörüngesel olarak genotipten 5 x 106 kırılmamış kemik iliği hücresi enjekte edin.
  3. 6.1 ve 6.2 adımlarını art arda 3 gün boyunca tekrarlayın, böylece alıcı fareler toplam 1.5 x 107 kemik iliği hücresi ile nakledilecektir.
    NOT: Ön koşullandırma işlemi yapılmadan evlat edinilen BMT 3 gün üst üste kemik iliği nakli gerektirdiğinden, her enjeksiyon için göz değiştirme girişiminde bulunulmalıdır.
  4. Enjeksiyondan sonra, etkilenen göze bir damla proparakanin içeren göz damlası sürün.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Üç BMT/pre-conditioning yönteminin donör hücre engraftmenti üzerindeki etkisini karşılaştırmak için, donör hücrelerin periferik kan ve kalp dokusundaki fraksiyonları BMT sonrası 1 aylık akış sitometrisi ile analiz edildi. İzole hücreler, lökositlerin farklı alt kümelerini tanımlamak için spesifik lökosit belirteçleri için lekelendi. Bu deneylerde WT B6'ya yabani tip(WT) C57BL/6 (CD45.2) donör kemik iliği hücreleri teslim edildi. SJL-PtprcaPrpcb/...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Klonal hematopoez çalışmaları için üç BMT yöntemi tanımladık: total vücut ışınlamalı BMT, kısmi kalkanlı ışınlamalı BMT ve ön koşullandırma içermeyen daha az yaygın olarak kullanılan bir BMT yöntemi (benimsenen BMT). Bu yöntemler klonal hematopoezin kardiyovasküler hastalık üzerindeki etkisini değerlendirmek için kullanılmıştır. Araştırmacılar bu yöntemleri çalışmalarının özel amacına uyacak şekilde değiştirebilirler.

Klonal hematopoez modelleri
Klonal hematopoez, mutant he...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından K. Walsh'a (HL131006, HL138014 ve HL132564), S. Sano'ya (HL152174), M. A. Evans'a Amerikan Kalp Derneği hibesi (20POST35210098) ve H. Ogawa'ya Japonya Kalp Vakfı hibesi ile desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0.5ml mikrosantrifüjFisher Scientific05-408-121genel tedarik
1.5ml mikrosantrifüjFisher Scientific05-408-129genel tedarik
1/2 cc LO-DOSE İNSÜLİN ŞIRINGAEXELINT26028genel tedarik
Mutlak Etanol (200 prfof)Fisher kimyasal200559genel tedarik
BD 1mL Tüberkülin Şırıngalar 25G 5/8 İnç İğneBecton Dickinson309626genel tedarik
BD PrecisionGlide İğne 18G (1.22mm X 25mm)Becton Dickinson395195genel tedarik
Sezyum-137 IşınlayıcıJL Shepherd Mark IVekipmanı
DietGel 76AŞeffaf H2O70-01-5022genel tedarik
Falcon 100 mm TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü KabıYaşam Bilimleri353003genel tedarik
Falcon 50 mL Konik Santrifüj TüpleriFisher Scientific352098genel tedarik
Fisherbrand steril hücre süzgeçleri, 70 μ mFisher Scientific22363548genel tedarik
Graefe ForsepsGüzel Bilim Araçları11051-10genel tedarik
Sertleştirilmiş İnce MakasGüzel Bilim Araçları14090-09genel tedarik
Isothesia (Isoflurane) çözeltisiHenry Schein29404Çözelti
KetaminZoetis043-304enjeksiyon
Kimwipes Hassas Görev SilecekleriKimtech ScienceKCC34155genel tedarik
PBS pH7.4 (1X)Gibco10010023Çözümü
RadDisk – Kemirgen Işınlayıcı DiskBraintree ScientificIRD-P Mgenel tedarik
RPMI Orta 1640 (1X)Gibco11875-093Orta
Sülfametoksazol ve TrimetoprimTEVA0703-9526-01enjeksiyon
XylazineAkorn139-236enjeksiyon
X-ışını ışınlayıcıRad kaynağıRS-2000ekipmanı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, M. A., Sano, S., Walsh, K. Cardiovascular disease, aging, and clonal hematopoiesis. Annual Review of Pathology: Mechanisms of Disease. 15 (1), 419-438 (2020).
  2. Welch, J. S., et al. The origin and evolution of mutations in acute myeloid leukemia. Cell. 150 (2), 264-278 (2012).
  3. Jaiswal, S., et al. Age-related clonal hematopoiesis associated with adverse outcomes. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2488-2498 (2014).
  4. Dorsheimer, L., et al. Association of mutations contributing to conal hematopoiesis with prognosis in chronic ischemic heart failure. JAMA Cardiology. 4 (1), 25(2019).
  5. Genovese, G., et al. Clonal hematopoiesis and blood-cancer risk inferred from blood DNA sequence. New England Journal of Medicine. 371 (26), 2477-2487 (2014).
  6. Jaiswal, S., et al. Clonal hematopoiesis and risk of atherosclerotic cardiovascular disease. New England Journal of Medicine. 377 (2), 111-121 (2017).
  7. Bick, A. G., et al. Genetic interleukin 6 signaling deficiency attenuates cardiovascular risk in clonal hematopoiesis. Circulation. 141 (2), 124-131 (2020).
  8. Fuster, J. J., et al. Clonal hematopoiesis associated with TET2 deficiency accelerates atherosclerosis development in mice. Science. 355 (6327), 842-847 (2017).
  9. Wang, Y., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis in nonconditioned mice accelerates age-associated cardiac dysfunction. JCI Insight. 5 (6), 135204(2020).
  10. Sano, S., et al. Tet2-mediated clonal hematopoiesis accelerates heart failure through a mechanism involving the IL-1β/NLRP3 inflammasome. Journal of the American College of Cardiology. 71 (8), 875-886 (2018).
  11. Sano, S., et al. JAK2-mediated clonal hematopoiesis accelerates pathological remodeling in murine heart failure. JACC: Basic to Translational Science. 4 (6), 684-697 (2019).
  12. Yu, K. R., et al. The impact of aging on primate hematopoiesis as interrogated by clonal tracking. Blood. 131 (11), 1195-1205 (2018).
  13. Sano, S., et al. CRISPR-mediated gene editing to assess the roles of Tet2 and Dnmt3a in clonal hematopoiesis and cardiovascular disease. Circulation Research. 123 (3), 335-341 (2018).
  14. Stachura, D. L., et al. Clonal analysis of hematopoietic progenitor cells in the zebrafish. Blood. 118 (5), 1274-1282 (2011).
  15. Gyurkocza, B., Sandmaier, B. M. Conditioning regimens for hematopoietic cell transplantation: one size does not fit all. Blood. 124 (3), 344-353 (2014).
  16. Bacigalupo, A., et al. Defining the intensity of conditioning regimens: working definitions. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (12), 1628-1633 (2009).
  17. Abbuehl, J. P., Tatarova, Z., Held, W., Huelsken, J. Long-term engraftment of primary bone marrow stromal cells repairs niche damage and improves hematopoietic stem cell transplantation. Cell Stem Cell. 21 (2), 241-255 (2017).
  18. Shao, L., et al. Total body irradiation causes long-term mouse BM injury via induction of HSC premature senescence in an Ink4a- and Arf-independent manner. Blood. 123 (20), 3105-3115 (2014).
  19. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  20. Koch, A., et al. Establishment of early endpoints in mouse total-body irradiation model. PLOS One. 11 (8), 0161079(2016).
  21. Ismaiel, A., Dumitraşcu, D. L. Cardiovascular risk in fatty liver disease: the liver-heart axis-literature review. Frontiers in Medicine. 6, 202(2019).
  22. Amann, K., Wanner, C., Ritz, E. Cross-talk between the kidney and the cardiovascular system. Journal of the American Society of Nephrology. 17 (8), 2112-2119 (2006).
  23. Liao, X., et al. Distinct roles of resident and nonresident macrophages in nonischemic cardiomyopathy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4661-4669 (2018).
  24. Honold, L., Nahrendorf, M. Resident and monocyte-derived macrophages in cardiovascular disease. Circulation Research. 122 (1), 113-127 (2018).
  25. Lavine, K. J., et al. The macrophage in cardiac homeostasis and disease. Journal of the American College of Cardiology. 72 (18), 2213-2230 (2018).
  26. Ginhoux, F., Guilliams, M. Tissue-resident macrophage ontogeny and homeostasis. Immunity. 44 (3), 439-449 (2016).
  27. Mildner, A., et al. Microglia in the adult brain arise from Ly-6C hi CCR2+ monocytes only under defined host conditions. Nature Neuroscience. 10 (12), 1544-1553 (2007).
  28. Cronk, J. C., et al. Peripherally derived macrophages can engraft the brain independent of irradiation and maintain an identity distinct from microglia. Journal of Experimental Medicine. 215 (6), 1627-1647 (2018).
  29. Lu, R., Czechowicz, A., Seita, J., Jiang, D., Weissman, I. L. Clonal-level lineage commitment pathways of hematopoietic stem cells in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (4), 1447-1456 (2019).
  30. Gibson, B. W., et al. Comparison of cesium-137 and X-ray irradiators by using bone marrow transplant reconstitution in C57BL/6J mice. Comparative Medicine. 65 (3), 165-172 (2015).
  31. Cui, Y. Z., et al. Optimal protocol for total body irradiation for allogeneic bone marrow transplantation in mice. Bone Marrow Transplantation. 30 (12), 843-849 (2002).
  32. Kim, C. K., Yang, V. W., Bialkowska, A. B. The role of intestinal stem cells in epithelial regeneration following radiation-induced gut injury. Current Stem Cell Reports. 3 (4), 320-332 (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Total V cut I nlamasI nlama Z rhlamaAdoptif BMTAk SitometrisiTet2 Eksik H crelerDon r H cre EntegrasyonuHematopoetik K k H crelerKardiyovask ler Hastal k

İlgili makaleler