Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu

4.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61884

⸱

27 Ekim 2020

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Research Division, Instituto Nacional de Perinatologia, 2Department of Immunobiochemistry, Instituto Nacional de Perinatologia, 3Department of Obstetrics, Instituto Nacional de Perinatologia, 4Department of Academic Programs and Continuing Education, Instituto Nacional de Perinatologia, 5Department of Infectology and Immunology, Instituto Nacional de Perinatologia, 6Clinical Research Branch, Instituto Nacional de Perinatologia, 7Department of Nutrition and Bioprogramming, Instituto Nacional de Perinatologia, 8Department of Human Genetics and Genomics, Instituto Nacional de Perinatologia, Mexico City, Mexico

Bu makalede

Özet

Bu protokol, adipositlerden yüksek kaliteli RNA elde etme metodolojisi ve akış sitometrisi ile analiz için çoklu membrana bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF-makrofajların fenotipleştirilmesi dahil olmak üzere, canlı adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon-SVF hücrelerinin insan viseral yağından tek bir işlemde izolasyonu için etkili bir kollajenaz sindirim yöntemi sağlar.

Özet

Viseral yağ dokusu (VAT), metabolik, hormonal ve immün süreçleri kontrol eden farklı biyoaktif molekülleri serbest bırakan, esas olarak olgun adipositler ve stromal vasküler fraksiyon (SVF) hücrelerinden oluşan aktif bir metabolik organdır; Şu anda, bu süreçlerin yağ dokusu içinde nasıl düzenlendiği belirsizdir. Bu nedenle, her hücre popülasyonunun yağ dokusunun patofizyolojisine katkısını değerlendiren yöntemlerin geliştirilmesi çok önemlidir. Bu protokol, izolasyon adımlarını açıklar ve bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanılarak insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF'nin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için gerekli sorun giderme yönergelerini sağlar. Ayrıca, protokol ayrıca makrofaj alt kümelerini tanımlamak ve gen ekspresyonu çalışmaları için olgun adiposit RNA izolasyonu gerçekleştirmek için optimize edilmiştir, bu da bu hücre popülasyonları arasındaki etkileşimi inceleyen çalışmaların yapılmasına izin verir. Kısaca, KDV biyopsileri yıkanır, mekanik olarak kıyılır ve tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için sindirilir. Santrifüjlemeden sonra, olgun adipositler, SVF peletinden yüzdürme yoluyla izole edilir. RNA ekstraksiyon protokolü, aşağı akış ekspresyon deneyleri için adipositlerden yüksek miktarda toplam RNA (miRNA'lar dahil) verimi sağlar. Aynı zamanda, SVF hücreleri, akış sitometrisi analizi yoluyla makrofaj alt kümelerini (pro- ve anti-inflamatuar fenotip) karakterize etmek için kullanılır.

Giriş

Beyaz yağ dokusu sadece yağ hücrelerinden veya adipositlerden değil, aynı zamanda makrofajlardan, düzenleyici T hücreleri (Treg'ler) olarak diğer bağışıklık hücrelerinden ve eozinofillerden, preadipositlerden ve fibroblastlardan oluşan heterojen bir hücre popülasyonu içeren stromal vasküler fraksiyon (SVF) olarak bilinen yağsız bir hücre fraksiyonundan oluşurve vasküler ve bağ dokusu ile çevrilidir 1,2. Yağ dokusu (AT) artık otokrin, parakrin ve endokrin etkileri ile farklı hücreler tarafından üretilen ve dokuya salınan adipokinler, sitokinler ve mikroRNA'lar aracılığıyla metabolizma ve iltihaplanma ile ilgili fizyolojik süreçleri düzenleyen bir organ olarak kabul edilmektedir 3,4. İnsanlarda beyaz yağ dokusu, deri altı yağ dokusu (SAT) ve viseral yağ dokusunu (VAT) içerir ve aralarında önemli anatomik, moleküler, hücresel ve fizyolojik farklılıklar vardır 2,5. SAT, insan AT'sinin %80'ini temsil ederken, VAT karın boşluğunda, özellikle mezenter ve omentumda bulunur ve metabolik olarak daha aktiftir6. Ayrıca VAT, vücut ağırlığı, insülin duyarlılığı, lipid metabolizması ve inflamasyon üzerinde önemli etkisi olan aracıları salgılayan bir endokrin organdır. Sonuç olarak, KDV birikimi abdominal obeziteye ve tip-2 diyabet, metabolik sendrom, hipertansiyon ve kardiyovasküler hastalık riski gibi obezite ile ilişkili hastalıklara yol açar ve obezite ile ilişkili mortalitenin daha iyi bir yordayıcısını temsil eder 6,7,8,9.

Homeostatik koşullarda, adipositler, makrofajlar ve diğer bağışıklık hücreleri, anti-enflamatuar mediatörlerin salgılanması yoluyla KDV metabolizmasını sürdürmek için işbirliği yapar10. Bununla birlikte, aşırı KDV genişlemesi, aktive edilmiş T hücrelerinin, NK hücrelerinin ve makrofajların alımını teşvik eder. Nitekim yağsız KDV'de makrofajların oranı %5 iken, obezitede bu oran %50'ye kadar yükselmekte, makrofaj polarizasyonu ile anti-inflamatuardan pro-inflamatuar fenotipe doğru kronik inflamatuar bir ortam oluşturmaktadır10,11.

Obezite pandemisinin bir sonucu olarak, diğerlerinin yanı sıra adiposit biyolojisi, epigenetik, inflamasyon, endokrin özellikler ve hücre dışı veziküller olarak ortaya çıkan alanlar dahil olmak üzere farklı KDV araştırma konularını ele alan şaşırtıcı sayıda rapor ortaya çıkmıştır 8,10,12,13. Bununla birlikte, KDV ortamı, adipositler ile yerleşik veya gelen makrofajlar arasındaki karışma ile tanımlansa da, çoğu çalışma yalnızca bir hücre popülasyonuna odaklanmıştır ve bu hücrelerin KDV'deki etkileşimi ve patofizyolojik sonuçları hakkında çok az bilgi vardır11,14. Ayrıca, AT'de adiposit-makrofaj etkileşimini ele alan değerli çalışmalar, in vivo hazırlama koşullarından yoksun hücre hatları kullanılarak gerçekleştirilmiştir 11,14,15. Bu hücrelerin KDV'deki etkileşimini veya özel katkısını incelemek için uygun bir strateji, KDV metabolizmasını düzenleyen in vivo özellikleri mümkün olduğunca benzer şekilde yansıtan in vitro tahliller gerçekleştirmek için her iki hücre tipinin de aynı yağ biyopsisinden izole edilmesini gerektirir.

AT'yi kırmak için mekanik kuvvetlere dayanan enzimatik olmayan ayrışma yöntemleri minimum manipülasyon sağlasa da, enzimatik yöntemlere kıyasla hücre geri kazanımında daha düşük etkinliğe ve düşük hücre canlılığına sahip olduklarından ve daha büyük bir doku hacmine ihtiyaç duyulduğundan, amaç SVF hücrelerini incelemek ise bu yöntemler kullanılamaz16,17. Kollajenaz kullanılarak enzimatik sindirim, WAT18 gibi fibröz dokuların kollajen ve hücre dışı matriks proteinlerinin yeterli sindirimine izin veren nazik bir yöntemdir ve tripsin etkisiz veya zararlı olduğundasıklıkla kullanılır 19. Protokol, bir kollajenaz enzimatik sindirim tekniği kullanarak, insan KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositlerin ve SVF hücrelerinin tek bir işlemde verimli bir şekilde izole edilmesi için temel sorun giderme yönergeleri sağlar ve aşağı akış ekspresyon uygulamaları için mikroRNA'lar da dahil olmak üzere olgun adipositlerden toplam RNA'nın yüksek verimini (miktar, saflık ve bütünlük) sağlamak için bilgi verir. Eşzamanlı olarak, protokol, akış sitometrisi20 ile daha fazla analiz için çoklu zara bağlı belirteçlerin boyanması yoluyla SVF hücrelerinden makrofaj alt kümelerini tanımlamak için optimize edilmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokol, Instituto Nacional de Perinatologia'nın IRB'si (212250-3210-21002-06-15) tarafından onaylanmıştır. Katılım gönüllülük esasına dayalıydı ve kayıtlı tüm kadınlar bilgilendirilmiş onam formunu imzaladı.

1. Viseral yağ dokusu toplanması

  1. Doğum sancısı olmadan tekil gebelikleri olan sağlıklı yetişkin kadınlardan sezaryen sırasında kısmi omentektomi yoluyla KDV biyopsileri alın.
  2. Rahim kapanması ve hemostaz yapıldıktan sonra, daha büyük omentum tanımlamaya devam edin ve ıslak bir kompres üzerinde uzatın. Maruz kalan AT KDV'dir.
  3. En büyük kan damarını bulun ve daha büyük omentum tabanına 7 x 5 cm'lik hayali bir çizgi izleyin.
  4. Bir avasküler bölge belirleyin ve KDV'nin dış tarafını delmek için Kelly forseps kullanın.
  5. KDV'nin delindiği bölgede proksimal ve distal tarafı sıkıştırmak için Ochsner forseps kullanın ve dokuyu kesmek için Metzenbaum makası kullanın.
  6. Daha büyük omentumu 1 numaralı siyah ipek ile bağlayın.
  7. Ochsner forsepslerini çıkarın ve hemostazı değerlendirin.
  8. KDV biyopsisini steril bir kaba koyun ve hemen laboratuvara taşıyın.

2. Viseral yağ dokusunun enzimatik sindirimi ve olgun adipositlerin ve stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin izolasyonu

  1. KDV biyopsisini tartın ve 1x PBS pH 7.4 ile durulayın.
  2. 4 g KDV'yi kesin ve dokuyu bir diseksiyon tepsisinde küçük parçalara ayırmak için makas kullanın.
  3. Kıyılmış KDV'yi steril bir 50 mL santrifüj tüpüne aktarın, 20 mL PBS ekleyin ve kırmızı kan hücrelerinin fazlalığını gidermek için hafifçe çalkalayın.
  4. PBS'yi atın ve prosedürü iki kez tekrarlayın.
  5. KDV'yi yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne aktarın ve 25 mL sindirim solüsyonu ekleyin (% 0.25 kollajenaz tip II, 5 mM glikoz, PBS'de% 1.5 albümin).
  6. 37 °C'de 60 dakika boyunca 125 rpm'de bir orbital çalkalayıcıda inkübe edin.
  7. Sindirilmiş dokuyu üç kat gazlı bezden geçirerek yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne süzün.
  8. 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  9. SFV hücreleri pelette kalırken, olgun adipositlere karşılık gelen bir üst faz olan iki faz elde edilir. Olgun adipositleri bir transfer pipeti kullanarak yeni bir steril 50 mL santrifüj tüpüne nazikçe aktarın.
  10. 20 mL soğuk PBS ekleyin, hafifçe çalkalayın ve 4 °C'de 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
  11. PBS'yi atın ve prosedürü iki kez tekrarlayın.
  12. Olgun adipositleri 1.5 mL DNase-RNaz içermeyen bir mikrosantrifüj tüpüne nazikçe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın.
  13. 4 °C'de 1 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin ve bir P200 mikropipet kullanarak fazla PBS'yi çıkarın. Gerekirse bu adımı tekrarlayın.
  14. 300 μL olgun adiposit süspansiyonunu 1.5 mL DNase-RNaz içermeyen mikrosantrifüj tüplerine yavaşça aktarın. Olgun adipositleri RNA ekstraksiyonuna kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Adipositler bir pelet oluşturmaz.
  15. Adipositler ayrıldıktan sonra (adım 2.9), SVF peletini tüpün dibinde tutarak sindirim solüsyonunun çoğunu bir transfer pipeti ile aspire edin.
  16. SVF hücreli peleti, bir transfer pipeti kullanarak 50 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
  17. Hücre peletini nazikçe yıkayın, yukarı ve aşağı pipetleyerek 20 mL soğuk 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
  18. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dekantasyon yoluyla hızla atın.
  19. 2.17 ve 2.18 adımlarını tekrarlayarak ikinci bir yıkama gerçekleştirin.
  20. SVF peletine oda sıcaklığına (RT) dengelenmiş, 5 mL kırmızı kan hücresi lizis tamponu ekleyin ve tekrarlanan pipetleme ile askıya alın. Girdap yapmayın.
  21. RT'de 5 dakika inkübe edin ve 800 x g'da 5 dakika santrifüjleyin. Bir transfer pipeti kullanarak süpernatanı dikkatlice çıkarın ve uygun şekilde atın.
  22. Lizis tamponunu nötralize etmek için 10 mL soğuk 1x PBS ekleyin ve hücre peleti ayrılana kadar hafifçe karıştırın.
  23. SVF peleti elde etmek ve PBS'yi atmak için 800 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Tüpün dibinde beyaz bir pelet görünmelidir.
  24. Tekrarlanan pipetleme ile RT'de 5 mL 1x PBS'deki hücreleri yeniden süspanse edin ve üç kat gazlı bezden yeni bir 50 mL konik tüpe süzülün. Daha sonra, bu hücreler akış sitometrisi ile makrofaj alt popülasyon karakterizasyonu için kullanılacaktır.

3. Olgun adipositlerden RNA ekstraksiyonu

  1. RNA bozulmasını önlemek için RNase dekontaminasyon spreyi kullanarak temiz bir alan hazırlayın. RNA prosedürleri için ayrılmış bir pipet seti kullanın. Kullanılan tüm tüpler ve uçlar RNaz içermemelidir.
  2. Olgun adiposit süspansiyonunu (bölüm 2.14) -80 °C'ye kadar saklanmışsa 4 °C'de çözün.
    NOT: Birden fazla donma-çözülme döngüsünden kaçının.
  3. 1.000 μL asit-guanidinyum-fenol bazlı reaktif ekleyerek hücreleri parçalayın ve homojenize etmek için bir P1000 mikropipet ile iyice karıştırın.
  4. Nükleoprotein komplekslerinin ayrışmasını artırmak için RT'de 5 dakika inkübe edin.
  5. RT'de 12.000 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj hücresi lizatı. Üç faz elde edilecektir: adiposit lipidlerine karşılık gelen bir üst faz (sarı), nükleik asitlere karşılık gelen bir orta faz (pembe) ve bir pelet (hücresel kalıntı).
  6. Bir P200 mikropipet kullanarak lipit tabakasını dikkatlice çıkarın.
  7. Orta fazı 2 mL'lik yeni bir tüpe aktarın, lipid kalıntısı ve pelet bozulmasından kaçının (yaklaşık 700 μL).

4. MikroRNA'lar dahil toplam RNA'nın saflaştırılması

NOT: Yüksek kaliteli toplam RNA elde etmek için kolon tabanlı bir toplam RNA saflaştırma yöntemi kullanılır.

  1. Bölüm 3.7'den numuneye eşit hacimde etanol (%95-100), yaklaşık 700 μL ekleyin ve tüpü 10 saniye ters çevirerek elle karıştırın.
  2. Karışımın 700 μL'sini bir toplama tüpüne yerleştirilmiş bir kolona aktarın, santrifüjleyin ve akışı atın.
  3. Sütunu yeniden yükleyin ve 4.2 adımını tekrarlayın.
  4. Kolonu yeni bir toplama tüpüne aktarın.
  5. Kolona ve santrifüje 400 μL ön yıkama tamponu ekleyin. Akışı atın ve bu adımı tekrarlayın.
  6. Kolona 700 μL yıkama tamponu ekleyin ve 2 dakika santrifüjleyin.
  7. Kolonu dikkatlice nükleaz içermeyen bir tüpe aktarın.
  8. Doğrudan kolon matrisine 50 μL nükleaz içermeyen su ekleyin ve RNA'yı santrifüjleme yoluyla elüte edin. 200 μL'lik mikrofüj tüpleri kullanarak 10 μL'lik alikotlar hazırlayın.
  9. Hemen buza alikotlar koyun ve RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirlemek için bunlardan birini kullanın.
  10. RNA bütünlüğünü ve mikroRNA konsantrasyonunu ölçmek için 100 ng/μL'ye ayarlanmış 5 μL toplam RNA'dan oluşan bir alikot hazırlayın.
  11. Kullanana kadar -80 °C'de saklayın.

5. Olgun adiposit RNA konsantrasyonunun, saflığının ve bütünlüğünün belirlenmesi; mikroRNA miktar tayini testi

NOT: RNA konsantrasyonu ve saflık tayinleri bir UV-Vis spektrofotometresi kullanılarak gerçekleştirilir; RNA bütünlüğü ve miRNA nicelemesi, bir RNA kalite kontrol analizörü kullanılarak gerçekleştirilir.

  1. Numune okuyucuyu moleküler dereceli suyla yıkayın ve silin.
  2. 2 μL elüsyon suyu (boş) yükleyin, ayarı RNA olarak değiştirin ve Boş düğmesine tıklayın.
  3. 2 μL numune yükleyin ve Ölç düğmesine tıklayın.
  4. Okuma tamamlandıktan sonra, A260/A280 ve A260/A230 oranlarının yanı sıra RNA miktarını (ng/μL) kaydedin (Şekil 1A).
    NOT: OD260/OD280 ve OD260/OD230 oranı 2.0 civarında olan RNA saf kabul edilir.
  5. Üreticinin talimatlarını izleyerek bir RNA bütünlük kiti kullanarak RNA bütünlük numarasını (RIN) ölçün (Şekil 1B).
    NOT: BIR RIN =10, bozulmamış RNA'ya karşılık gelirken, bir RIN ≤ 3.0, güçlü bir şekilde bozulmuş bir RNA'yı gösterir. İfade mikrodizileri veya RT-qPCR için RIN ≥ 6.0 ile RNA kullanın.
  6. Üreticinin talimatlarını izleyerek mikroRNA'ların konsantrasyonunu ve yüzdesini belirlemek için küçük bir RNA kiti kullanın (Şekil 1C).
    NOT: Küçük ve mikro RNA'ların fazla tahmin edilmesini önlemek için, RIN ≥ 6.0 ile RNA örneklerini kullanın.

6. Stromal vasküler fraksiyon hücrelerinin sayısı ve canlılığı

  1. 10 μL SVF hücre süspansiyonunu (bölüm 2.24) 90 μL %0.4 Tripan Mavisi Çözeltisine (son seyreltme 1:10) seyreltin ve standart bir hemositometreye 10 μL uygulayın.
  2. Canlı hücreleri, ölü hücreler hariç, sayım odasının köşesindeki dört karede dikkatlice sayın.
  3. Orijinal süspansiyonda bulunan hücre konsantrasyonunu belirleyin: Hücre konsantrasyonu = Toplam hücre sayısı/4 x seyreltme faktörü (10) x 10.000 = Hücreler/mL
  4. Elde edilen hücresel verimi (doku gramı başına hücre) hesaplamak için, hücresel konsantrasyonu orijinal toplam numune hacmi (mL cinsinden) ile çarpın ve sindirilen dokunun ağırlığına (gram cinsinden) bölün.
  5. Hücre canlılığını canlı hücrelerin yüzdesi olarak şu şekilde değerlendirin: % Canlılık = (Canlı hücre sayısı / Toplam hücre sayısı) x 100.

7. Stromal vasküler fraksiyondan makrofaj alt gruplarının karakterizasyonu

  1. 4 °C'de 5 dakika boyunca 800 x g'da santrifüjleme yoluyla akış sitometrisi ve pelet hücreleri için toplam 1 x 106 SVF hücresi/mL'yi 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne aktarın.
  2. Peleti gevşetmek için dikkatlice vorteksleyin ve hücreleri RT'de 100 μL 1x PBS'de yeniden süspanse edin.
  3. Bir hücre yüzeyi antijeni için spesifik olan her bir florokrom konjuge monoklonal antikorun önceden titre edilmiş optimal konsantrasyonunu ekleyin; hafifçe karıştırın ve RT'de karanlıkta 15 dakika inkübe edin.
  4. Fazla soğuk 1x PBS (≈ 1 mL) ekleyin ve SVF'yi 400 x g'de 4 °C'de 5 dakika santrifüjleyin.
  5. Süpernatantları dekantasyon ile hızla atın. Peletleri rahatsız etmemeye dikkat edin.
  6. 500 μL 1x parçalama çözeltisi ekleyin ve tüpleri doğrudan ışıktan koruyarak RT'de 15 dakika inkübe edin.
  7. 400 °C'de 5 dakika boyunca 4 x g'da santrifüjledikten sonra çözeltiyi çıkarın ve veri alınana kadar karanlıkta 2-8 °C'de saklayın.
  8. Elde etmeden önce agregasyonu azaltmak için hücreleri düşük hızda iyice vorteksleyin.
  9. SVF peletini RT'de 5 mL kılıf sıvısı içinde yeniden süspanse edin ve ardından hücre ayırıcı hatlarının tıkanmasını azaltmak için akış sitometrisi ile analizden önce üç kat gazlı bezden yeni bir 5 mL yuvarlak tabanlı polipropilen test tüpüne süzün.
  10. Analizden önce her tüpü kısaca vorteksleyin.
  11. İlgilenilen örneklerden veri elde edin. Akış analizi için en az 10.000 olay sayın.
    NOT: Bir hücre sıralama akış sitometresi kullanıyorsanız, sonraki çalışmalarda uygulama için makrofajları ayırın.

8. Geçit stratejisi

  1. Singlet popülasyonunu belirlemek için İleri Dağılım (FSC) alanına göre yüksekliği veya genişliği çizin (Şekil 2A).
  2. Hücresel kalıntıları atarak FSC'ye karşı Yan Dağılım (SSC) alanını çizen hücreleri seçin (Şekil 2B).
  3. Seçilen hücrelerden, CD45'i hematopoietik hücreler olarak ifade eden popülasyonları tanımlayın (Şekil 2C) ve CD45 / CD14 çift pozitif hücreleri makrofajlar olarak tanımlayın (Şekil 2D).
  4. CD45+/CD14+ makrofajlarından negatif ve pozitif HLA-DR hücrelerini tespit edin (Şekil 2E).
    NOT: Antikor paneli için kompanzasyon kontrollerini dahil edin ve panel için yeterli olan çok renkli bir akış sitometresinde spektral örtüşmeyi ayarlayın. Üç lazerle (405 nm mor lazer, 488 nm mavi lazer ve 640 nm kırmızı lazer) donatılmış bir sitometre ve belirtilen florokromlar için dedektörler kullanarak akış sitometrisi analizi yapıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, parsiyel omentektomi sonrası sağlıklı gebe kadınlardan elde edilen KDV biyopsilerinden canlı olgun adipositleri ve SVF hücrelerini tek bir işlemde izole etmek için kollajenaz sindirimi ve ardından diferansiyel santrifüjleme kullanan enzimatik bir yöntemi açıklar. Bu durumda, RNA ekstraksiyonu için adipositleri ve makrofaj fenotiplemesi için SVF'yi kullanıyoruz.

RNA ekstraksiyon protokolü, yeterli saflıkta, yüksek bütünlükte RNA ve olgun adipositlerden mikroRNA'lar elde edilmesini ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

KDV, metabolik düzenleme ve inflamasyonda çok önemli bir rol oynar. Obezite ile ilişkili kronik inflamasyonda adipositlerin ve immün hücrelerin rolüne olan ilginin artması, AT'de bulunan SVF ve yağ hücrelerini ayırmak için farklı tekniklerin geliştirilmesine yol açmıştır. Bununla birlikte, çoğu teknik, adipositler ve SVF hücreleri arasındaki etkileşimlerle ilgili çalışmalar için çok önemli olabilecek tek bir prosedürde aynı KDV biyopsisinden aşağı akış uygulamaları için uygun olan bu iki farklı hücre setinin elde edilmes...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların ifşa edecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma Instituto Nacional de Perinatologia (hibe numaraları: 3300-11402-01-575-17 ve 212250-3210-21002-06-15) ve CONACyT, Fondo Sectorial de Investigacion en Salud y Seguridad Social (FOSISS) (hibe numarası 2015-3-2-61661) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
0,2 mL PCR tüpleriAxygenPCR-02-CRNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriAxygenMCT-150-CRNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan
10 mL serolojik pipetlerCorningCLS4101-50EAAyrı ayrı plastik sarılı
10 ve mikro; L üniversal pipet ucuAxygenT-300-L-RRNase, DNaz içermez ve pirojenik olmayan
10 &mikro; L üniversal pipet ucuAxygenT-300-R-SRNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan
1000 &mikro; L üniversal pipet ucuAxygenT-1000-BRRNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan
2.0 mL mikrosantrifüj tüpüAxygenMCT-200-CRNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan
200 &mikro; L üniversal pipet ucuAxygenT-200-Y-RRNase, DNaz içermeyen ve pirojenik olmayan
2100 Biyoanalizör CihazıAgilent
G2939BA-2101 Biyoanalizör PCAgilentG2953CA2100 PC'ye önceden yüklenmiş Uzman Yazılım
5 ml Yuvarlak Tabanlı Polistiren Test TüpüCorning352003 Çıtçıtlı kapak, steril
50 mL santrifüj tüpleriCorningCLS430828-100EAPolipropilen, konik tabanlı ve steril
Asit-guanidinyum-fenol bazlı reaktifZymo ResearchR2050-1-200TRI Reaktifi veya benzeri
Agilent RNA 6000 Nano KitAgilent5067-1511-Agilent
Küçük RNA KitiAgilent5067-1548-APC
/Cy7 anti-insan CD14 AntikoruBioLegend3256200.4 mg / 106< / sup> hücreleri, monositler / makrofajlar üzerinde bulunur, klon HCD14
Baker-250 ml, steril olmayan
Sığır serum albüminiSigma-AldrichA3912-100GIsı şoku fraksiyonu, pH 5.2, & ge; % 96
Talaş hazırlama istasyonuAgilent5065-9951-Kollajenaz
tip IIGibco17101-015Toz
D-(+)-GlikozSigma-AldrichG8270-100GToz
Direct-zol RNA MiniprepZymo ResearchR205150 mL TRI reagen
Diseksiyon forseps-Çelik, tırtıklı çeneler ve yuvarlak uçlar
Diseksiyon tepsisi-Paslanmaz çelik
Etil alkolSigma-AldrichE7023-500ML200 & kanıt, moleküler biyoloji için
FACS Akış Kılıfı SıvısıBD Biosciences
342003-FACS Lizasyon ÇözeltisiBD Biosciences
349202-FACSAria III Akış Sitometresi/Hücre SıralayıcısıBD Biosciences
648282-FASCDiva YazılımıBD Biosciences642868Yazılımı v6.0 önceden yüklenmiş
HematitometreSigmaZ359629-1EA-Manuel
hücre sayacı-
Mayo diseksiyon makasları-Paslanmaz çelik
Mikrosantrifüj-Ayarlanabilir sıcaklık
Nanodrop spektrofotometresiThermo Scientific
ND2000LAPTOP-Orbital çalkalayıcı-Ayarlanabilir sıcaklık ve hız
P10  Değişken Hacim  Mikropipet Termo Bilimsel-Finnpipet46420401 ila 10 μ L
P1000  Değişken Hacim  Mikropipet Thermo Scientific-Finnpipette4642090100 ila 1000 μ L
P2  Değişken Hacim  Mikropipet Thermo Scientific-Finnpipette46420100.2 ila 2 & mu; L
P200  Değişken Hacim  Mikropipet Thermo Scientific-Finnpipette464208020 ila 200 μ L
PCR tüpü saklama rafıAxygenR96PCRFSP-PE
/Cy5 anti-insan HLA-DR Antikoru BioLegend3076080.0625 mg / 106< / sup> hücreleri, makrofajlarda bulunur, klon L243
PE / Cy7 anti-insan CD45Antikoru BioLegend3040160.1 mg / 106< / sup> hücreleri, lökositlerde bulunur, klon H130
Fosfat tamponlu salinSigma-AldrichP3813-10PAKTozu, pH 7.4, 1 L çözelti hazırlamak için
Pipet kontrolörü-
Kırmızı Kan Hücreleri Lizis TamponuRoche11 814 389 001İnsan tam kanından kırmızı kan hücrelerinin tercihli lizisi için
Soğutmalı santrifüj-50 mL konik tüpler için beyaz adaptör
Steril Numune kabı--
Transfer pipetiThermo Scientific-Samco204-1SSteril
Tripan MaviGibco15250-061%0,4
Çözelti Tüp rafları-Farklı tüp boyutları için
Vortex Mini ShakerCientifica SENNABV101-
ile birlikte verilir

Kaynaklar

  1. Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-derived stromal vascular fraction cells: update on clinical utility and efficacy. Critical Reviews in Eukaryotic Gene Expression. 25 (2), 145-152 (2015).
  2. Ibrahim, M. M. Subcutaneous and visceral adipose tissue: structural and functional differences. Obesity Reviews. 11 (1), 11-18 (2010).
  3. Barchetta, I., Cimini, F. A., Ciccarelli, G., Baroni, M. G., Cavallo, M. G. Sick fat: the good and the bad of old and new circulating markers of adipose tissue inflammation. Journal of Endocrinological Investigation. 42 (11), 1257-1272 (2019).
  4. Scheja, L., Heeren, J. The endocrine function of adipose tissues in health and cardiometabolic disease. Nature Reviews Endocrinology. 15 (9), 507-524 (2019).
  5. Ronquillo, M. D., et al. Different gene expression profiles in subcutaneous and visceral adipose tissues from Mexican patients with obesity. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 616-626 (2019).
  6. Mittal, B. Subcutaneous adipose tissue and visceral adipose tissue. Indian Journal of Medical Research. 149 (5), 571-573 (2019).
  7. West-Eberhard, M. J. Nutrition, the visceral immune system, and the evolutionary origins of pathogenic obesity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (3), 723-731 (2019).
  8. Kaminski, D. A., Randall, T. D. Adaptive immunity and adipose tissue biology. Trends in Immunology. 31 (10), 384-390 (2010).
  9. Elffers, T. W., et al. Body fat distribution, in particular visceral fat, is associated with cardiometabolic risk factors in obese women. PLoS One. 12 (9), 0185403(2017).
  10. Macdougall, C. E., et al. Visceral adipose tissue immune homeostasis is regulated by the crosstalk between adipocytes and dendritic cell subsets. Cell Metabolism. 27 (3), 588-601 (2018).
  11. Sarvari, A. K., et al. Interaction of differentiated human adipocytes with macrophages leads to trogocytosis and selective IL-6 secretion. Cell Death & Disease. 6 (1), 1613(2015).
  12. Gao, X., Salomon, C., Freeman, D. J. Extracellular vesicles from adipose tissue-A potential role in obesity and type 2 diabetes. Frontiers in Endocrinology. 8 (1), Lausanne. 202(2017).
  13. Crujeiras, A. B., et al. Genome-wide DNA methylation pattern in visceral adipose tissue differentiates insulin-resistant from insulin-sensitive obese subjects. Translational Research. 178 (1), 13-24 (2016).
  14. Surmi, B. K., Hasty, A. H. Macrophage infiltration into adipose tissue: initiation, propagation and remodeling. Future Lipidology. 3 (5), 545-556 (2008).
  15. Suganami, T., Nishida, J., Ogawa, Y. A paracrine loop between adipocytes and macrophages aggravates inflammatory changes: role of free fatty acids and tumor necrosis factor alpha. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 25 (10), 2062-2068 (2005).
  16. Bellei, B., Migliano, E., Tedesco, M., Caputo, S., Picardo, M. Maximizing non-enzymatic methods for harvesting adipose-derived stem from lipoaspirate: technical considerations and clinical implications for regenerative surgery. Scientific Reports. 7 (1), 10015(2017).
  17. Senesi, L., et al. Mechanical and enzymatic procedures to isolate the stromal vascular fraction from adipose tissue: preliminary results. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7 (1), 88(2019).
  18. Seaman, S. A., Tannan, S. C., Cao, Y., Peirce, S. M., Lin, K. Y. Differential effects of processing time and duration of collagenase digestion on human and murine fat grafts. Plastic and Reconstructive Surgery. 136 (2), 189-199 (2015).
  19. Duarte, A. S., Correia, A., Esteves, A. C. Bacterial collagenases - A review. Critical Reviews in Microbiology. 42 (1), 106-126 (2016).
  20. Bravo-Flores, E., et al. Macrophage populations in visceral adipose tissue from pregnant women: potential role of obesity in maternal inflammation. International Journal of Molecular Sciences. 19 (4), 1074(2018).
  21. Conde-Green, A., et al. Shift toward mechanical isolation of adipose-derived stromal vascular fraction: review of upcoming techniques. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 4 (9), 1017(2016).
  22. Oberbauer, E., et al. Enzymatic and non-enzymatic isolation systems for adipose tissue-derived cells: current state of the art. Cell Regeneration. 4 (7), London, England. 1-14 (2015).
  23. van Dongen, J. A., et al. Comparison of intraoperative procedures for isolation of clinical grade stromal vascular fraction for regenerative purposes: a systematic review. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (1), 261-274 (2018).
  24. Winnier, G. E., et al. Isolation of adipose tissue derived regenerative cells from human subcutaneous tissue with or without the use of an enzymatic reagent. PLoS One. 14 (9), 0221457(2019).
  25. Gentile, P., Piccinno, M. S., Calabrese, C. Characteristics and potentiality of human adipose-derived stem cells (hASCs) obtained from enzymatic digestion of fat graft. Cells. 8 (3), 282(2019).
  26. Hagman, D. K., et al. Characterizing and quantifying leukocyte populations in human adipose tissue: impact of enzymatic tissue processing. Journal of Immunological Methods. 386 (1-2), 50-59 (2012).
  27. Lockhart, R., Hakakian, C., Aronowitz, J. Tissue dissociation enzymes for adipose stromal vascular fraction cell isolation: a review. Journal of Stem Cell Research & Therapy. 5 (12), 1000321(2015).
  28. Condé-Green, A., et al. Comparison between stromal vascular cells' isolation with enzymatic digestion and mechanical processing of aspirated adipose tissue. Plastic and Reconstructive Surgery. 134 (4), 54(2014).
  29. Markarian, C. F., et al. Isolation of adipose-derived stem cells: a comparison among different methods. Biotechnology Letters. 36 (4), 693-702 (2014).
  30. Aguena, M., et al. Optimization of parameters for a more efficient use of adipose-derived stem cells in regenerative medicine therapies. Stem cells international. 2012 (1), 303610(2012).
  31. Yang, X. F., et al. High efficient isolation and systematic identification of human adipose-derived mesenchymal stem cells. Journal of Biomedical Science. 18 (1), 59(2011).
  32. Conde-Green, A., et al. Effects of centrifugation on cell composition and viability of aspirated adipose tissue processed for transplantation. Aesthetic Surgery Journal. 30 (2), 249-255 (2010).
  33. Hoareau, L., et al. Effect of centrifugation and washing on adipose graft viability: a new method to improve graft efficiency. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 66 (5), 712-719 (2013).
  34. Xie, Y., et al. The effect of centrifugation on viability of fat grafts: an evaluation with the glucose transport test. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 63 (3), 482-487 (2010).
  35. Bourin, P., et al. Stromal cells from the adipose tissue-derived stromal vascular fraction and culture expanded adipose tissue-derived stromal/stem cells: a joint statement of the International Federation for Adipose Therapeutics and Science (IFATS) and the International Society for Cellular Therapy (ISCT). Cytotherapy. 15 (6), 641-648 (2013).
  36. Kanneganti, T. D., Dixit, V. D. Immunological complications of obesity. Nature Immunology. 13 (8), 707-712 (2012).
  37. Lee, M. J., Wu, Y., Fried, S. K. Adipose tissue heterogeneity: implication of depot differences in adipose tissue for obesity complications. Molecular Aspects of Medicine. 34 (1), 1-11 (2013).
  38. Raajendiran, A., Tsiloulis, T., Watt, M. J. Adipose tissue development and the molecular regulation of lipid metabolism. Essays in Biochemistry. 60 (5), 437-450 (2016).
  39. Rostam, H. M., et al. The impact of surface chemistry modification on macrophage polarisation. Immunobiology. 221 (11), 1237-1246 (2016).
  40. Chamberlain, L. M., Holt-Casper, D., Gonzalez-Juarrero, M., Grainger, D. W. Extended culture of macrophages from different sources and maturation results in a common M2 phenotype. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 103 (9), 2864-2874 (2015).
  41. Williams, M. R., Cauvi, D. M., Rivera, I., Hawisher, D., De Maio, A. Changes in macrophage function modulated by the lipid environment. Innate Immunity. 22 (3), 141-151 (2016).
  42. Baer, P. C., Geiger, H. Adipose-derived mesenchymal stromal/stem cells: tissue localization, characterization, and heterogeneity. Stem Cells International. 2012 (1), 812693(2012).
  43. Bajek, A., et al. Does the liposuction method influence the phenotypic characteristic of human adipose-derived stem cells. Bioscience Reports. 35 (3), 00212(2015).
  44. van Harmelen, V., et al. Effect of BMI and age on adipose tissue cellularity and differentiation capacity in women. International Journal of Obesity and Related Metabolic Disorders. 27 (8), 889-895 (2003).
  45. Hemmrich, K., Denecke, B., Paul, N. E., Hoffmeister, D., Pallua, N. RNA isolation from adipose tissue: an optimized procedure for high RNA yield and integrity. Laboratory Medicine. 41 (2), 104-106 (2010).
  46. Mendez, V., et al. A rapid protocol for purification of total RNA for tissues collected from pigs at a slaughterhouse. Genetics and Molecular Research. 10 (4), 3251-3255 (2011).
  47. Pena, R. N., Canovas, A., Estany, J. Technical note: Efficient protocol for isolation of total ribonucleic acid from lyophilized fat and muscle pig samples. Journal of Animal Science. 88 (2), 442-445 (2010).
  48. Pratt, S. L., Burns, T. A., Owens, M. D., Duckett, S. K. Isolation of total RNA and detection procedures for miRNA present in bovine-cultured adipocytes and adipose tissues. Methods in Molecular Biology. 936 (1), 181-194 (2013).
  49. Cirera, S. Highly efficient method for isolation of total RNA from adipose tissue. BMC Research Notes. 6 (1), 472(2013).
  50. Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent). Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (6), (2010).
  51. Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. Flow cytometry analyses of adipose tissue macrophages. Methods in Enzymology. 537 (1), 297-314 (2014).
  52. Berry, R., Rodeheffer, M. S. Characterization of the adipocyte cellular lineage in vivo. Nature Cell Biology. 15 (3), 302-308 (2013).
  53. Jang, Y., et al. Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Animal. 51 (2), 142-150 (2015).
  54. Nicoletti, G. F., De Francesco, F., D'Andrea, F., Ferraro, G. A. Methods and procedures in adipose stem cells: state of the art and perspective for translation medicine. Journal of Cellular Physiology. 230 (3), 489-495 (2015).
  55. Palumbo, P., et al. Methods of isolation, characterization and expansion of human adipose-derived stem cells (ASCs): an overview. International Journal of Molecular Sciences. 19 (7), 1897(2018).
  56. Raposio, E., Bertozzi, N. How to isolate a ready-to-use adipose-derived stem cells pellet for clinical application. European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 21 (18), 4252-4260 (2017).
  57. Silva, K. R., et al. Characterization of stromal vascular fraction and adipose stem cells from subcutaneous, preperitoneal and visceral morbidly obese human adipose tissue depots. PLoS One. 12 (3), 0174115(2017).
  58. Wankhade, U. D., Shen, M., Kolhe, R., Fulzele, S. Advances in adipose-derived stem cells isolation, characterization, and application in regenerative tissue engineering. Stem Cells International. 2016 (1), 3206807(2016).
  59. Zavan, B., et al. Persistence of CD34 stem marker in human lipoma: searching for cancer stem cells. International Journal of Biological Sciences. 11 (10), 1127-1139 (2015).
  60. Dey, A., Allen, J., Hankey-Giblin, P. A. Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation: blood monocytes versus tissue macrophages. Frontiers in Immunology. 5 (1), 683(2014).
  61. Liddiard, K., Taylor, P. R. Understanding local macrophage phenotypes in disease: shape-shifting macrophages. Nature Medicine. 21 (2), 119-120 (2015).
  62. Prieur, X., et al. Differential lipid partitioning between adipocytes and tissue macrophages modulates macrophage lipotoxicity and M2/M1 polarization in obese mice. Diabetes. 60 (3), 797-809 (2011).
  63. Wang, H., et al. CD68(+)HLA-DR(+) M1-like macrophages promote motility of HCC cells via NF-kappaB/FAK pathway. Cancer Letters. 345 (1), 91-99 (2014).
  64. Yamamoto, Y., et al. Decreased human leukocyte antigen-DR expression in the lipid raft by peritoneal macrophages from women with endometriosis. Fertility and Sterility. 89 (1), 52-59 (2008).
  65. Italiani, P., Boraschi, D. From monocytes to M1/M2 macrophages: phenotypical vs. functional differentiation. Frontiers in Immunology. 5 (1), 514(2014).
  66. Perdiguero, E. G., Geissmann, F. The development and maintenance of resident macrophages. Nature Immunology. 17 (1), 2-8 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Adipoz Doku zolasyonuOlgun AdipositlerKollagenaz SindirimiRNA EkstraksiyonuAk SitometrisiH cre Canl l AnaliziSantrif gasyon Protokolnsan Viseral Ya
İnsan Viseral Yağ Dokusundan Canlı Adiposit ve Stromal Vasküler Fraksiyonun RNA Analizi ve Makrofaj Fenotiplemesine Uygun İzolasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.