İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Fitzwilliam Seibertz; Martyn Reynolds; Niels Voigt

doi:10.3791/61890

Yöntem makalesi

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

DOI:

10.3791/61890

⸱

22 Aralık 2020

Fitzwilliam Seibertz¹^,² , Martyn Reynolds³ , Niels Voigt¹^,²^,⁴

¹Institute of Pharmacology and Toxicology, University Medical Center Goettingen, Goettingen, Germany, ²DZHK (German Center for Cardiovascular Research), Partner Site Goettingen, Germany, ³Cairn Research Ltd, Faversham, United Kingdom, ⁴Cluster of Excellence "Multiscale Bioimaging: from Molecular Machines to Networks of Excitable Cells" (MBExC), University of Goettingen, Germany

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, yüksek hızlı modüler fotometri sistemi kullanarak indüklenmiş pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositlerden kaynaklanan eylem potansiyellerinin optik edinimi ve karakterizasyonu açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyomiyosit elektrofizyolojisini ölçmek için geleneksel hücre içi mikroelektrot teknikleri son derece karmaşık, emek yoğun ve tipik olarak düşük verimde gerçekleştirilir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı ve sürekli genişlemesi kardiyovasküler araştırmalarda yeni bir standart sunun ve elektrofizyolojik verilerin verimini tek bir hücre düzeyinde artırmak için alternatif yöntemler artık gereklidir. VF2.1Cl, membran potansiyelindeki dalgalanmalara hızlı bir tek kanallı, yüksek büyüklükte tepki sağlayan yakın zamanda türetilmiş voltaja duyarlı bir boyadır. Diğer mevcut voltaj göstergelerinden daha üstün kinetiklere sahiptir ve geleneksel mikroelekrod tekniklerine eşdeğer işlevsel verileri kullanıma sunmaktadır. Burada, modüler ve son derece uygun fiyatlı bir fotometri sistemi kullanarak harici tempolu insan iPSC türevli kardiyomiyositlerde basitleştirilmiş, invaziv olmayan eylem potansiyeli karakterizasyonunu gösteriyoruz.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik modellemesi ve kardiyak ilaç taraması için verimli platformların inşası, çeşitli aritmik bozukluklar için terapötik stratejilerin geliştirilmesi için gereklidir. İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin hızlı genişlemesi, izole hasta türevli kardiyomiyositler (iPSC-CM) kullanılarak insan hastalığı modellemesi ve farmakolojik araştırmalara umut verici yollar üretmiştir. Bu hücrelerin yama kelepçesi (akım kelepçesi) yoluyla elektrofizyolojik karakterizasyonu için "altın standart" teknikler, eylem potansiyelini (AP) morfolojiyi ve süresini ölçebilir, ancak bu yöntem inanılmaz derecede karmaşık ve yavaştır ve yüksek ver....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücresel hazırlıklar

NOT: Bu protokolde kullanılan insan iPSC'leri sağlıklı donörlerden türetilmiş ve daha önce açıklandığı gibi WNT sinyalizasyon ve laktat saflaştırma tekniklerinin tam tanımlı küçük molekül modülasyonu kullanılarak monolayerlerde farklılaştırılmıştır¹²^,¹³^,¹⁴. iPSC-CM'ler her 2-3 günde bir aşağıda özetlenen bir kültür ortamı ile sürdürülmektedir.

Bazal ortam (RPMI 1640) ve %2 takviye (B27) kültür ortamı hazırlayın. 4 °C'de saklayın. Oda sıcaklığında (RT) kullanın.
Bazal ortam (RPMI 1640), %2 takviye (B27) v....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Şekil 3: İzole edilmiş yerli kardiyomiyositlerin optik eylem potansiyeli (AP) profilleri ve insan kaynaklı pluripotent kök hücre türetilmiş kardiyomiyositler (iPSC-CM). (A) APD 50 ve APD_90'ın Ortalama ± SEM'i_(n = 7, sağ) ile tek bir murine kardiyomiyosit (ortada) temsili optik AP. (B) TEK bir insan iPSC türetilmiş kardiyomiyosit (ort.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, elektrofizyolojik modelleme ve kardiyak ilaç taraması için uygun izole iPSC-CM'lerden ayrıntılı AP profillerini kolayca elde etmek için temel bir protokol açıklıyoruz. Seyrek tohumlu iPSC-CM'lerimizden hem gösterge işlevselliğini hem de metodolojik doğruluğu öneren düzenli ve sağlam AP'ler tespit ediyoruz.

iPSC yeniden programlama için geniş ticari metodoloji yelpazesi ve kardiyak farklılaşma protokolleri için standardizasyon eksikliği nedeniyle, iPSC tabanlı modeller işlevlerinde ve m.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cairn Research Ltd, video dosyasının üretim maliyetlerini karşılayarak bu yayını destekledi.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Cairn Research Ltd.'yi bu yayının üretim maliyetlerini kapsayan nazik finansal katkıları için kabul etmek istiyor. Ayrıca, Bayan Ines Mueller ve Bayan Stefanie Kestel'e mükemmel teknik destekleri için teşekkür ederiz.

Yazarların araştırmaları Alman Kardiyovasküler Araştırmalar Merkezi (DZHK), Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Alman Araştırma Vakfı, VO 1568/3-1, IRTG1816 RP12, SFB1002 TPA13 ve Almanya'nın Mükemmellik Stratejisi - EXC 2067/1- 390729940) ve Else-Kröner-Fresenius Stiftung (EKFS 2016_A20) kapsamında.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
Ad	Şirket	Katalog numarası
Reaktifler< / güçlü >
0.25 Tripsin EDTA & nbsp;	Gibco
B27 Takviyesi	Gibco
CaCl2	Carl Roth	HN04.2
D (+) - Susuz glukoz & nbsp; BioChemica	ITW Reaktifleri	A1422
Fetal Sığır Serumu	Gibco	10270-106
FluoVolt Membran Potansiyel Kiti	Canlandırıcı	F10488
HEPES	Carl Roth	HN77.4
KCl	Sigma-Aldrich	6781.1
Lamanin	Sigma-Aldrich	114956-81-9
Matrigel	BD	354230
NaCl	Sigma-Aldrich	9265.2
Nifedipin	Sigma-Aldrich	21829-25-4
Penisilin / Streptomisin	İnvitrojen ve nbsp;	15140
ROCK İnhibitörü Y27632	Stemolekül	04-0012-10
RPMI 1640 Orta	Gibco
Versene EDTA	Gibco	15040033
Ekipman< / güçlü >
495LP Dikroik Işın Ayırıcı ve nbsp;	Chroma Teknolojisi
Axopatch 200B Amplifikatör ve nbsp;	Moleküler Cihazlar
Daire Lamelleri, Kalınlık 0	Thermo Scientific	CB00100RA020MNT0
Digidata 1550B	Moleküler Cihazlar
Çift OptoLED Güç Kaynağı	Cairn Araştırma
ET470/40x Uyarma Filtresi	Chroma
ET535/50m	Chroma
Kazınmış Neubauer Hemacytometer	Hausser Scientific
Filtre Küpleri	Cairn Araştırma
IX73 Ters Mikroskop	Olimpos
MonoLED	Cairn Araştırma
Çok Bağlantı Noktalı Adaptörler	Cairn Araştırma
Miyopacer Hücre Stimülatörü	IonOptix
Optomask Deklanşör	Cairn Araştırma
Optoscan Sistem Kontrol Cihazı	Cairn Research
PH-1 Sıcaklık Kontrollü Platform	Warner Instruments
Fotoçoğaltıcı Dedektör	Cairn Araştırma
PMT Amplifikatör Eki	Cairn Research
PMT Tedarik Eki	Cairn Research
RC-26G Açık Banyo Odası	Warner Instruments
SA-OLY/2AL Sahne Adaptörü	Olimpos
T565lpxr Dikroik Işın Ayırıcı	Chroma Teknolojisi
T660lpxr Dikroik Işın Ayırıcı	Chroma Teknolojisi
TC-20 Çift Kanallı Sıcaklık Kontrol Cihazı	npi Elektronik
UPLFLN 40X Objektif	Olympus
USB 3.0 Renkli Kamera	Görüntüleme Kaynağı
Software
Clampex 11.1	Moleküler Cihazlar
Clampfit 11.1	Moleküler Cihazlar
IC Yakalama 2.4	Görüntüleme Kaynağı
Prizma 8	Grafik Pedi

252000561750404461870010TechnologyTechnology

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Miller, E. W. Small molecule fluorescent voltage indicators for studying membrane potential. Current Opinion in Chemical Biology. 33, 74-80 (2016).
Liang, P., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

nsan iPSC Kardiyomiyositleri Voltaj Duyarl Boya G r nt leme Fotometri Sistemi Floresans Tespiti Elektrofizyolojik Analiz H cre K lt r Haz rlama Optik Kay t D zene i la Tarama Uygulamas Repolarizasyon Parametreleri

İnsan kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Türevli Kardiyomiyositlerde Tek Hücreli Optik Eylem Potansiyeli Ölçümü

Bu makalede

Özet

Özet

Giriş

Protokol

Sonuçlar

Tartışma

Açıklamalar

Teşekkürler

Malzemeler

Kaynaklar

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

İlgili makaleler