Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Farem Hamile mi? Yüksek Frekanslı Ultrason Değerlendirmesi

7.4K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61893

⸱

18 Mart 2021

 , 
1Department of Pediatrics, New York University Grossman School of Medicine, 2Department of Anesthesiology, New York University Grossman School of Medicine, 3Department of Cell Biology, New York University Grossman School of Medicine

Bu makalede

Özet

Yüksek çözünürlüklü ultrason, hamilelik durumunu, gebelik yaşını ve gebelik kayıplarını belirleyerek zamanlanmış hamile fareler gerektiren deneyleri kolaylaştırmaya yardımcı olabilir. Burada sunulan, fare gebeliklerini ve hamileliği taklit edebilecek potansiyel tuzakları (görüntü yapıtları) değerlendirme yöntemlerini gösteren bir protokoldür.

Özet

Fare, birçok insan hastalığı ve biyolojik süreç için tercih edilmiş memeli hayvan modelidir. Gelişimsel biyoloji genellikle çeşitli zaman noktalarında gelişen süreçleri belirlemek için aşamalı hamile fareler gerektirir. Ayrıca, model farelerin optimal ve verimli üremesi, zamanlanmış gebeliklerin değerlendirilmesini gerektirir. En yaygın olarak, fareler bir gecede çiftleşir ve vajinal bir fişin varlığı belirlenir; ancak, bu tekniğin pozitif tahmin değeri yetersizdir ve farenin gerçekten hamile olup olmadığını bilmek için beklemek gerekir. Yüksek çözünürlüklü ultrason biyomikroskop görüntüleme için etkili ve verimli bir araçtır: 1) Bir farenin hamile olup olmadığı; 2) Fare hangi gebelik aşamasına ulaştı; ve 3) rahim içi kayıpların olup olmadığı. Embriyolara ve fetüslere ek olarak, araştırmacı bunları gravid uterusla karıştırmamak için karın boşluğundaki ortak eserleri de tanımalıdır. Bu makalede, açıklayıcı örneklerle birlikte görüntüleme için bir protokol sağlanabilir.

Giriş

Fare, birçok insan hastalığı ve biyolojik süreçler için tercih edilen memeli modelidir1,2,3,4. Gelişimsel biyoloji alanındaki araştırmalar genellikle çeşitli zaman noktalarında gelişen süreçleri belirlemek için aşamalı-hamile fareler gerektirir5,6,7,8. Ayrıca, model farelerin optimal ve etkili üremesi, özellikle araştırmacılar bir gen mutasyonunun gelişim üzerindeki etkilerini incelerken, zamanlanmış gebeliklerin değerlendirilmesini gerektirir. Tipik olarak, araştırmacılar bir gecede heterozipöz fareleri çiftleşir, ertesi sabah erken saatlerde vajinal bir fiş arar ve bir hamileliğin9. Rahim içi kaybın belirlenmesi tipik olarak yenidoğan bir çöpü Genotiplerin Mendelian oranları için kontrol etmek, daha sonra çeşitli gebelik aşamalarında hamile farelerden ödün vererek geriye doğru çalışmak ve embriyoları geriye doğru kurtarmakla başlar. Araştırmacılar kilo alımını pozitif gebeliğin bir ölçüsü olarak belirleyebilirler10,11; bununla birlikte, özellikle genetik olarak tasarlanmış farelerde, kilo alımının belirgin olmayabileceği rahim içi kayıp olduğunda çöpler çok küçük olabilir ve daha sonra resorbed olabilir (özellikle hamileliğin başlarında, ~E6.5–8.5). Fare, örneğin iyi huylu bir karın tümörü nedeniyle yanlış hamile görünebilir. Özünde, kişi "kör" çalışır.

Yüksek çözünürlüklü ultrason biyomikroskop, gravid uterusun doğrudan görselleştirilmesine ve fare embriyolarının geliştirilmesine izin verir12,13,14,15,16. Başlangıçta embriyonik fare kardiyovasküler fizyolojisini değerlendirmek için yöntemler geliştirmemize rağmen16,17, fare ürememizi kolaylaştırmak için bu görüntüleme yönteminin yararını tanıdık. Özellikle, artık bir farenin hamile olup olmadığını "görmek" için beklemek zorunda kalmadık, bariz kilo alımına veya bir çöp teslimatına dayanarak; Gravid durumunu belirleyebilir ve baraj hamile değilse fareleri hızlı bir şekilde yeniden eşleyebiliriz. Ayrıca, rahim içi kayıplar da kolayca görüntülenebilir ve fareden ödün vermeden bir kayıp zaman çizelgesi belirlenebilir (şematik için Şekil 1'e bakın). Zaman, değerli model fareler ve fonlar böylece kurtarılabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Bu protokoldeki tüm adımlar, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından yayınlanan Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nu takip eder ve New York Üniversitesi Grossman Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Zamanlanmış gebelikler için farelerin çiftleşmesi

  1. Bir kafesteki uygun dişi fareyi (genellikle bir heterozygote) gece çiftleşme için uygun erkek fare (genellikle bir heterozygote) ile eşleştirin.
  2. Ertesi sabah fareleri ayırın. Alternatif olarak, dişi ve erkek fareleri sürekli çiftleşir, böylece hamilelik şansını artırır.
    NOT: Bununla birlikte, doğru zamanlanmış bir gebelik alternatif ile garanti edilemez ve fare embriyolarının ultrason ile evrelemesi, özellikle hastalık süreci intrauterin büyüme geriliği ile sonuçlandığında net değildir. Gen varyantını taşıyan embriyoların küçük olduğu varsayılırsa, gebelik yaşını ölçmek için daha büyük wildtype çöp eşlerini arayın.
    1. İsteğe bağlı: Vajinal tıkacı arayın. Vajinal fiş yoksa, dişi fare çiftleşmemiştir. Vajinal bir fiş varsa, dişi farenin hamile kalmaması hala muhtemeldir.
  3. Gece çiftleşmeden sonraki günü E0.5 olarak zaman.
  4. Hamileliği belirlemek için E6.5–E.8.5'te görüntüleme gerçekleştirin ve fare hamile değilse fareleri yeniden eşleyin (bkz. adım 1.1).
    NOT: Bu aşamada, dişi baraj açıkça göze hamile değildir; bu nedenle, ultrason görüntüleme erken belirleme ve yeniden çiftleşme sağlar.

2. Anestezi ve fare hazırlanması

  1. Hamile fareyi anestezik indüksiyon odasına yerleştirin.
  2. İndüksiyon odasında hamile farenin yatıştırılmasını sağlamak için 1 L/dk akış hızında% 2-3 konsantrasyonda oda havası veya tıbbi oksijen ile izofluran karıştırın.
    NOT: Sedasyon genellikle 1-2 dakika içinde gerçekleşir. Fare hareketsiz yatacak ve nefes alışı yavaşlamış olacak.
  3. Fareyi görüntüleme platformuna hızla aktarın. Görüntüleme platformu genellikle fareyi sıcak tutmaya yardımcı olabilecek ısıtma elemanları dana sahiptir.
  4. Farenin burnunu anestezik burun kemiğine yerleştirin.
  5. İzofluran/oksijen karışımını görüntüleme platformu burunkonuna hızla yeniden yönlendirin. 1 L/dk akışta %2-%3 oranında izofluran sağlayın.
  6. Pençe sıkışması, kornea refleksi, solunum seviyesi ve herhangi bir hareketle sedasyon seviyesini belirleyin.
    NOT: Kornea refleksi başlangıçta, fare uyuşturulurken kurumasını önlemek için gözlere nemlendirici merhem uygulanarak belirlenebilir (fare gözlerini kapatmaz).
  7. Fare sırtüstü yatarken (sırtında), pençeleri görüntüleme platformunun elektrokardiyogram (EKG) pedlerine bantleyin.
    NOT: Ancak, bu tür görüntülemeler için EKG gerekli değildir.
  8. Kürkü hamile barajın karnından aşağıdaki gibi çıkarın:
    1. Karın kürkü, yanal kenarlara kadar dahil olmak üzere% 70 etanol ile iyice ıslatın. Platforma kaçacak kadar çok uygulamayın.
      NOT: Etanol, su yerine tıraş yağı olarak daha iyi çalışır.
    2. Karnı dikkatlice tıraş etmek için jilet kullanın. Meme uçlarını kesmemeye dikkat edin.
    3. Tıraş edilen kürkü karından gazlı bez veya bazı mendillerle silin.
    4. Alternatif olarak, kürklerin çoğunu çıkarmak için kürk makaslarını kullandıktan sonra bir depilatory krem kullanın.

3. (Tahmin edilen) hamile farenin transabdominal görüntülenmesi

  1. Karın tıraş edildikten sonra, izofluranları% 1-% 1.5'e düşürün, hala 1 L / dk akış hızını koruyun. Sedasyon seviyesini solunum seviyesine ve herhangi bir hareketin yanı sıra pençe sıkışması ve/veya kornea refleksine göre izleyin.
    NOT: Anestezi yapılan farenin kalp atış hızı, çekirdek (rektal) sıcaklığa bağlı olarak tipik olarak 400-500/dk olacaktır. Hızlı bir hamilelik kontrolü amacıyla, fareyi fizyolojik bir çekirdek sıcaklığına ısıtmayın; kalp atış hızı 400-450/dk'ya yakın olacaktır, ancak fare uzun süreli görüntüleme ile soğuduğunda düzensiz bir ritimle daha da düşebilir.
    1. Daha da önemlisi, respirasyonların düzensiz veya ıstıraplı değil, derinlik ve düzenli olarak orta düzeyde olduğundan emin olun (nefes alma: derin, yavaş ve düzensiz, derin interkostal ve subkoztal geri çekmelerle).
      NOT: Havalandırılmayan, uyuşturulmuş farenin solunum hızı tipik olarak 60-100/dk olacaktır https://az.research.umich.edu/animalcare/guidelines/guidelines-anesthesia-and-analgesia-mice https://ahcs.ninds.nih.gov/ACUC_pages/pg_003_anesth_animals.html.
  2. Karın bölgesine ultrason (akustik kavrama) jelini cömertçe uygulayın.
  3. Görüntüleme dönüştürücüsünü yatay bir düzlemde yönlendirmek için karın üzerine yerleştirin: görüntüleme sisteminde sol-sağ yönelim elde etmek için probu yönlendirin; görüntüleme probunun yan tarafında belirtilen "nokta" veya sırt sağa bakacak şekilde olmalıdır.
    NOT: Görüntüleme probını farenin sağına kaydırmak, ultrason sistemindeki ilgili görüntüyü farenin sağına kaydırmalıdır (farenin kuyruğundan "yukarı" baktığınızı düşünün - farenin sağı monitörde kalacaktır).
    1. Tipik olarak, görüntüleme sisteminin dönüştürücü montaj ve ray manipülatör sistemini kullanın. Burada, görüntüleme dönüştürücüslerinin elle tutulduğu (iki el birden daha sabittir) ve karın çevresinde daha hızlı hareketlere izin veren "serbest el" görüntüleme kullanılmıştır. Bu hareketler, aşağıda özetlenecek gibi, hem rotasyonel hem de çevirisel hareketleri içerir. Ancak, bu daha fazla pratik gerektirir.
  4. Ekranda mesaneyi tanımlayın (Video 1).
  5. Mesaneden kaudally tarama, vajinayı tanımlamak. Daha sonra, kraniyal yönde yavaşça ve sorunsuz bir şekilde tarama yaparak, vajinanın sol ve sağ rahim boynuzlarına çatallanmasını tanımlayın (Şekil 2; Video 1).
  6. Uterusun (sol ve sağ rahim boynuzları) incelenmesine başlayın13 (Şekil 3; Video 2).
    NOT: Orta gebelik (E10.5 veya E11.5) kadar fare embriyoları sağ ve sol çevreler boyunca konumlandırılacaktır. Büyüdükçe, uterusun daha distal kısımları ve bunlara karşılık gelen embriyoları dışa ve arkaya dönecektir. Embriyolar daha da büyüdükçe (E15.5 ve daha sonra, genellikle), fare fetüsleri neredeyse rastgele çeşitli yönlere yerleştirilecek ve bir uterusu proksimalden distal'e "izlemek" zorlaşır.
    1. Bir farenin hamile olup olmadığını kontrol etmek için hızlı bir şekilde tarayın. Bu hızlı yöntem sadece gravid uterus ve fare embriyolarının tanınmasıni gerektirir.
    2. Alternatif olarak, her rahim boynuzundaki embriyoları (canlı, ölü, resorbed) numaralandırmak için ekstra zaman ayırın.
      NOT: Genel olarak, canlı bir embriyo kalp, uzuvlar, ventriküllü kafa ve gözler gibi farklı organlar sergiler. Ölü bir embriyo, sadece ölmediği sürece homojen, "duygusal" bir görünüm alır. Resorbed embriyolar gravid görünümlü bir uterusun ortasında kesin bir ekojenik noktaya sahiptir (Şekil 4, Şekil 5, Şekil 6, Şekil 7, Şekil 8).
    3. Bir embriyonun gerçekten hayatta olup olmadığını belirlemek için kalp atışını ve/veya kan akışını arayın.
      NOT: Renk Doppler akış haritalaması, hem embriyoda hem de göbek kordonunda kan akışının varlığını belirlemeye yardımcı olabilir. Genel olarak bu E8.5'ten büyük embriyolara uygulanabilir.
    4. Gravid uterusu taklit edebilecek potansiyel eserleri tanıyın (Şekil 9, Şekil 10). Ek olarak, bağırsak gazı ve diğer ultrason "gölge" eserleri rahim boynuzu segmentlerini gizleyebileceğinden, uterusun yeterli görselleştirilmesini sağlamak için görüntülemeyi birden fazla bakış noktasından gerçekleştirin.
  7. Anket tamamlandıktan sonra, jeli karından gazlı bez veya mendille silin. Jel fareyi soğutma eğiliminde olduğu sürece mümkün olduğunca çıkarmaya çalışın.
  8. Pençeleri çıkarın ve fareyi anestezik burun kafesinden çıkarın.
  9. Fareyi yavaşça kafesine geri hareket ettirin. Uyanıp bir dakika içinde hareket etmeye başlamalı.
    NOT: Genetiği değiştirilmiş farelerin anesteziden kurtulması biraz daha uzun sürebilir ve daha yakından izlenmesi gerekebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Bu protokol, bir araştırmacının erken aşamalar da dahil olmak üzere bir farenin hamile olup olmadığını güvenle belirlemesine ve hamile barajını feda etmeye gerek kalmadan doğum öncesi embriyonik veya fetal kayıpların olup olmadığını belirlemesine izin verecektir. Bu protokol özellikle genetik olarak tasarlanmış fareleri yetiştirirken yararlıdır; tipik olarak, homozigot yavrular elde etmek için heterozipöz x heterozipöz haçlar, doğum öncesi ölümcüllüğe neden olan uygun gelişimin başarısız olmasına yol açar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Görüntülemenin en önemli ilk adımı vajinayı tanımlamak ve daha sonra rahim boynuzunun sola ve sağa çatallanmasını belirlemektir. Her rahim boynuzu takip ederek, görüntüleyicinin bağırsak döngülerini uterus olarak yanlış tanımlama olasılığı daha düşüktür. Ayrıca, bağırsak görünümündeki varyasyonları anlamak (dışkı maddesi olan / olmayan) bunları uterustan ayırt etmek önemlidir; bazen, bağırsak halkalarındaki dışkı "topları" gravid (hamile) uterusu taklit edebilir. Diğer yazarlar gebelik tanısını ve fare embriyonik gelişim...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

hiç kimse.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Tüy dökücü krem
Etanol, %
Kürk makası
Gazlı bez veya KimWipes
İzofluran
Tıbbi oksijen (isteğe bağlı)
Tıbbi bant
Fare görüntüleme sistemi (anestezi kurulumu ve görüntüleme platformu dahil)Fujifilm Visual SonicsÇeşitli40 MHz merkez frekanslı ultrason dönüştürücü probu olan herhangi
bir sistem Jiletli (emniyetli tıraş bıçağı değil)
Tartı (fareyi tartmak için)
Ultrason jeli
70

Kaynaklar

  1. Bogue, M. A., et al. Mouse Phenome Database: an integrative database and analysis suite for curated empirical phenotype data from laboratory mice. Nucleic Acids Research. 46, 843-850 (2018).
  2. Ito, R., Takahashi, T., Ito, M. Humanized mouse models: Application to human diseases. Journal of Cellular Physiology. 233 (5), 3723-3728 (2018).
  3. Law, M., Shaw, D. R. Mouse Genome Informatics (MGI) is the international resource for information on the laboratory mouse. Methods in Molecular Biology. 1757, 141-161 (2018).
  4. Rydell-Törmänen, K., Johnson, J. R. The applicability of mouse models to the study of human disease. Methods in Molecular Biology. 1940, 3-22 (2019).
  5. Hinton, R. B., Yutzey, K. E. Heart valve structure and function in development and disease. Annual Reviews of Physiology. 73, 29-46 (2011).
  6. Dickinson, M. E., et al. High-throughput discovery of novel developmental phenotypes. Nature. 537 (7621), 508-514 (2016).
  7. Tam, P. P. L., et al. Formation of the embryonic head in the mouse: attributes of a gene regulatory network. Current Topics in Developmental Biology. 117, 497-521 (2016).
  8. Palis, J. Hematopoietic stem cell-independent hematopoiesis: emergence of erythroid, megakaryocyte, and myeloid potential in the mammalian embryo. FEBS Letters. 590 (22), 3965-3974 (2016).
  9. Behringer, R., Gertsenstein, M., Nagy, K. V., Nagy, A. Selecting female mice in estrus and checking plugs. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (8), (2016).
  10. Heyne, G. W., et al. A simple and reliable method for early pregnancy detection in inbred mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (4), 368-371 (2015).
  11. Finlay, J. B., Liu, X., Ermel, R. W., Adamson, T. W. Maternal weight gain as a predictor of litter size in Swiss Webster, C57BL/6J, and BALB/cJ mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 54 (6), 694-699 (2015).
  12. Zhou, Y. Q., et al. Applications for multifrequency ultrasound biomicroscopy in mice from implantation to adulthood. Physiological Genomics. 10 (2), 113-126 (2002).
  13. Ji, R. P., Phoon, C. K. L. Noninvasive localization of nuclear factor of activated T cells c1-/- mouse embryos by ultrasound biomicroscopy-Doppler allows genotype-phenotype correlation. Journal of the American Society of Echocardiography. 18 (12), 1415-1421 (2005).
  14. Kulandavelu, S., et al. Embryonic and neonatal phenotyping of genetically engineered mice. ILAR Journal. 47 (2), 103-117 (2006).
  15. Mu, J., Slevin, J. C., Qu, D., McCormick, S., Adamson, S. L. In vivo quantification of embryonic and placental growth during gestation in mice using micro-ultrasound. Reproductive Biology and Endocrinology. 6, 34(2008).
  16. Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Cardiovascular imaging in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 6 (1), 15-38 (2016).
  17. Phoon, C. K. L., Turnbull, D. H. Ultrasound biomicroscopy-Doppler in mouse cardiovascular development. Physiological Genomics. 14 (1), 3-15 (2003).
  18. Peavey, M. C., et al. A novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse. Journal of Visualized Experiments. (128), e56207(2017).
  19. Greco, A., et al. High frequency ultrasound for in vivo pregnancy diagnosis and staging of placental and fetal development in mice. PLoS One. 8 (10), 77205(2013).
  20. Flores, L. E., Hildebrandt, T. B., Kühl, A. A., Drews, B. Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 38(2014).
  21. Norton, W. B., et al. Refinements for embryo implantation surgery in the mouse: comparison of injectable and inhalant anesthesias - tribromoethanol, ketamine and isoflurane - on pregnancy and pup survival. Laboratory Animal. 50 (5), 335-343 (2016).
  22. Thaete, L. G., Levin, S. I., Dudley, A. T. Impact of anaesthetics and analgesics on fetal growth in the mouse. Laboratory Animal. 47 (3), 175-183 (2013).
  23. Phoon, C. K. L., et al. Tafazzin knockdown in mice leads to a developmental cardiomyopathy with early diastolic dysfunction preceding myocardial noncompaction. Journal of the American Heart Association. 1 (2), (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fare Gebelik DeğerlendirmesiGestasyonel Yaş BelirlemeUterin Boynuz GörüntülemeEmbriyo TespitiGebelik Kaybı TanımlamaAbdominal Artifakt TanımaTransdüser KonumlandırmaMesane Vajina LokalizasyonuFare Üretim Protokolü
Farem Hamile mi? Yüksek Frekanslı Ultrason Değerlendirmesi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.