Yöntem makalesi

Seri Kristalografi Deneyleri için Endotiapepsin Kristallerinin Büyümesini Optimize Etme

DOI:

10.3791/61896

⸱

4 Şubat 2021

 , 
1Swiss Light Source, Paul Scherrer Institut

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalenin amacı, izleyiciye, büyük, tek protein kristallerini büyütmek için küçük hacimli, buhar-difüzyon protokollerini seri kristalografi için büyük hacimli bir toplu mikro-kristalizasyon yöntemine nasıl dönüştürecekleri konusunda sağlam bir anlayış kazandırmaktır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, hem senkrotronlarda hem de XFEL'lerde seri kristalografi deneyleri için uygun büyük hacimli (> 100 μL) mikro-kristalin bulamaçların oluşturulmasını kolaylaştırmak için bir protokol sunulmaktadır. Yöntem, protein kristal faz diyagramının anlaşılmasına ve bu bilginin nasıl kullanılabileceğine dayanmaktadır. Yöntem üç aşamaya ayrılmıştır: (1) kristal morfolojisini optimize etmek, (2) partiye geçiş ve (3) ölçeklendirme. Aşama 1, küp benzeri bir morfolojide sunulan, umarım ama zorunlu olarak değil, iyi kırınımlı, tek kristaller bulmayı içerir. Aşama 2'de, Aşama 1 koşulu kristal büyüme süresi ile optimize edilir. Bu strateji, buhar difüzyonu ile yetiştirilen kristalleri partiye dönüştürebilir. Kristal büyümesi yaklaşık 24 saat içinde gerçekleştiğinde, protein ve çökeltici karışımının bir morfogramı çizilebilir ve bir ölçekleme stratejisinin temeli olarak kullanılabilir (Aşama 3). Kristaller toplu olarak yetiştirilebildiğinde, ölçekleme denenebilir ve hacim arttıkça kristal boyutu ve konsantrasyonu optimize edilebilir. Endotiapepsin bu protokol için bir gösteri proteini olarak kullanılmıştır. Sunulan kararların bazıları endotiapepsine özgüdür. Bununla birlikte, uygulanma şekillerinin, başkalarının kendi projelerine uyarlayabilecekleri bu prosedür hakkında bir düşünme biçimine ilham vereceği umulmaktadır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Oda sıcaklığı (RT) makromoleküler kristalografi, yapısal biyoloji topluluğunda tekrar popülerdir. X-ışını Serbest Elektron Lazer (XFEL) ışık kaynaklarının geliştirilmesi, RT numune dağıtım yaklaşımlarının 1,2,3,4'ün geliştirilmesini teşvik etmiştir ve bu yöntemler şimdi senkrotronlar 5,6,7,8'e uygulanmıştır. RT yöntemleri sadece 9,10,11,12 pompa-prob deneysel stragetiesolasılığını açmakla kalmaz, aynı zamandaproteinler 13,14,15,16,17 içindeki alternatif konformasyonel durumları desteklediklerine dair kanıtlar da vardır.

Bununla birlikte, kriyo-yöntemlerin 1990'ların sonlarında RT yaklaşımları üzerinde çekiş kazanmasının başlıca nedeni, sıfırın altındaki kristal sıcaklıkları18 ile radyasyon hasarının yavaşlamasıydı. Kriyo-yöntemler19, tek bir protein kristalinden tam bir veri kümesinin toplanmasına izin vermeye başladı. XFEL'lerdeki ve senkrotronlardaki modern RT yöntemleri, hızlı (> 100 Hz) kristal dağıtım stratejilerinin geliştirilmesiyle tek kristalli radyasyon hasarı sorununu çözdü 1,2,3,4. Bu yöntemler, ayrı ayrı maruz kalan binlerce kristalden tam bir veri kümesinin toplanmasına izin verir. Bu nedenle bu RT dağıtım yaklaşımları, homojen mikro kristaller (> 100 μL < 50 μm kristal) içeren büyük miktarlarda çözeltilerin üretilmesini gerektirir. Bununla birlikte, kriyo-yöntemler sadece tek kristaller gerektirme eğiliminde olduğundan, bu tür mikro-kristalin bulamaçlar oluşturma yöntemleri şu anda protein kristalografi laboratuvarlarında her yerde bulunmamaktadır.

Literatürde, seri kristalografi örnekleri için mikro-kristalizasyon optimizasyon prosedürünün bölümlerinin nasıl yapılacağına dair örnekler vardır. Burada, membran ve çözünür proteinler arasında bir ayrım yapılmalıdır. Lipidik kübik faz (LCP) için monoolein (veya başka bir lipit) içinde yetiştirilen mikro-membran protein kristallerinin büyümesini optimize etmek için protokolleriyi tanımlanmıştır 20,21,22. Bununla birlikte, LCP olmayan koşullarda yetiştirilen membran proteinleri de dahil olmak üzere çözünür proteinlerin mikro-kristalizasyonu için yöntemler genellikle eksiktir. Önceki çalışmalar, mikro-kristal tarama 23,24, çekirdeklenme 24'ün arttırılması ve serbest arayüz difüzyonu 25 kullanılarak ölçeklendirme gibi sürecin belirli bölümlerine odaklanmıştır, ancak tam bir yöntem değildir.

Bununla birlikte, yakın zamanda tam bir protokol sunmaya çalışan26 yöntem tanımlanmıştır. Protein kristalografisinin birçok yönü gibi, yeni değildir. Önerilen fikirlerin çoğu Rayment (2002)27 tarafından zaten tanımlanmıştır. Yöntem, kristalograflara, buhar difüzyonu kullanılarak yetiştirilen tek bir kristalden, binlerce mikro kristali büyütmek için bir parti metodolojisine dönüşümün nasıl gerçekleştirileceğini göstermeyi amaçlamaktadır. Yöntem, ortak bir başlangıç noktası olarak buhar difüzyonuna odaklanmaktadır, çünkü tüm Protein Veri Bankası (PDB) birikimlerinin% 95'i buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen kristallerden gelmektedir26. Bununla birlikte, buhar difüzyonu, mikro-kristalizasyon26 için ideal bir yöntem değildir, bu nedenle buhar difüzyonunu toplu kristalizasyona dönüştürmek için bir metodoloji açıklanmaktadır. Kristaller toplu olarak yetiştirilebildikten sonra, daha büyük hacimlere ölçeklendirme yolları daha pratik hale gelir. Protein kristalizasyonunun değişkenlikleri göz önüne alındığında, yazarlar bu yöntemin başarısız olmadığını vurgulayacaktır. Bununla birlikte, protokol, en azından, bir proteinin "kristalleşme alanı" hakkında bir fikir vermelidir.

Bu yöntem, protein kristalleşme faz diyagramına ve bu diyagramın anlaşılmasının mikro-kristalleşme optimizasyonu sırasında nasıl bir rehber görevi görebileceğine dayanır. Bir protein faz diyagramı genellikle sırasıyla x ve y eksenlerinde çökeltici ve protein konsantrasyonlarına sahip bir x / y grafiği olarak tasvir edilir (Şekil 1A). Saf su noktasından (sol alt köşe - Şekil 1A), çözünürlük çizgisine ulaşılana kadar hem protein hem de çökeltici konsantrasyonu artar. Çözünürlük çizgisi aşırı doygunluk noktasını işaretler (mor çizgi - Şekil 1A). Bir protein aşırı doymuş olduğunda, çözelti termodinamik olarak kararsız hale gelir ve iki faza ayrılmaya başlar: 'protein bakımından zengin' ve kararlı bir doymuş çözelti. Bu ayırma, çözünürlük çizgisinin ötesinde herhangi bir yerde meydana gelebilir ve kinetiği, proteinin özelliklerine ve çözeltinin bileşenlerine bağlıdır.

Protein ve çökeltici konsantrasyonları çok büyük olduğunda, protein kararsız bir şekilde çözeltiden ayrışacak ve amorf çökelti ile sonuçlanacaktır (pembe bölge - Şekil 1A). Bununla birlikte, çekirdeklenme bölgesinde sıralı faz ayrımı meydana gelebilir [ayrıntılı açıklama için Garcia-Ruiz (2003)28'e bakınız] ve kristal çekirdeklerin oluşma eğilimi vardır (yeşil bölge - Şekil 1A). Çekirdeklenme ve büyüme, proteini çözeltiden uzaklaştırır ve düşüşü, çözünürlük çizgisine ulaşılana kadar büyümenin devam edebileceği metastabil bölgeye taşır [ayrıntılı tartışma için McPherson ve Kuznetsov (2014)29'a bakınız]. Diyagram, kristalleşme koşullarının büyük çoğunluğu için, brüt bir aşırı basitleştirme30'dur. Bununla birlikte, bundan bağımsız olarak, diyagramın haritalanması, çözünürlük çizgisinin ve çekirdeklenmenin kinetiğinin belirlenmesine izin verdiği için diyagram mikro-kristalograflar için hala büyük bir faydaya sahiptir.

Mikro kristaller oluşturma açısından, kristalleşme sırasında optimize edilmesi gereken iki faktör, kristallerin sayısı (Xn) ve ortalama, en uzun boyutlarıdır (Xs). X n, çekirdeklenme olaylarının sayısı (n ) ile orantılı olacaktır (Eq. 1).

figure-introduction-1     Ek. 1

X s, çözünürlük çizgisinin (Ps) üzerindeki serbest protein konsantrasyonunun Xn'ye bölünmesiyle orantılıdır (Eq. 2).

figure-introduction-2     Ek. 2

Mükemmel bir durumda, her çekirdeklenme olayı olası bir kristal üretecek ve bu kristallerin her biri, çözeltideki mevcut proteine eşit erişime sahip olacaktır. Şekil 2 , Xn ve Xs arasındaki ilişkinin ideal bir senaryosundan grafiksel bir gösterimdir. Pratik olarak, bir kristalografın Xn ve Xs üzerinde sahip olduğu temel kontrol, çekirdeklenme miktarını etkilemek veya tohum kristallerinin eklenmesidir. Mikro-kristalograf, Xn'nin nasıl arttırılacağına karar vermelidir, böylece uygun bir kristal konsantrasyonu ve kristal boyutu oluşturulabilir.

Kristalleşme tekniklerinin çoğunluğu bir "geçiş dönemi" gerektirir (Şekil 1B). Örneğin, bir buhar difüzyon deneyinde, protein ve çökeltici çözeltileri karıştırıldıktan sonra, damla kuyu çözeltisi ile dengelendikçe her birinin konsantrasyonları değişecektir. Bu değişikliklerin, düşüşün yavaş yavaş kristalleşme eğiliminin artacağı çekirdeklenme bölgesine geçeceği umulmaktadır. Kristaller çekirdeklenmeye ve büyümeye başladıkça, çözeltideki protein miktarı düşmeye başlayacak ve daha fazla çekirdeklenme olasılığını azaltacaktır. Nihai çekirdeklenme miktarı protein ve duruma özgü olacak ve ayrıca çekirdeklenme bölgesine nüfuz etme derinliğine bağlı olacaktır. Bir geçiş adımı gerektiren yöntemlerin sınırlı nükleasyon bölgesi penetrasyonu göz önüne alındığında, çekirdeklenme seviyesi nihayetinde metastabil çekirdeklenme bölgesi sınırındaki çekirdeklenme oranı ile sınırlı olacaktır.

Bir mikro-kristalograf için çekirdeklenme seviyesini artırabilmenin önemi nedeniyle, bir parti kristalizasyon metodolojisine geçmek önemlidir. Parti tüm çekirdeklenme bölgesinden daha fazla yararlanabilir (Şekil 1C). Parti yöntemlerinde fikir, protein ve çökelticiyi birlikte karıştırmaktır, böylece bileşen konsantrasyonlarında herhangi bir değişikliğe gerek kalmadan aşırı doymuş bir çözelti oluşturulur. Çekirdeklenme, karıştırıldıktan hemen sonra mümkün olmalıdır. Bu nedenle parti yöntemleri, tüm çekirdeklenme bölgesine teorik olarak ulaşılmasını sağlar. Metastabil nükleasyon sınırının ötesinde nükleasyon kinetiğindeki herhangi bir artış daha sonra kullanılabilir.

Kristal çekirdeklenmenin bazal seviyesi büyük bir Xn üretmek için yeterli değilse, mikro tohumlama yöntemleri kullanılabilir. Mikro tohumlamada, önceden yetiştirilmiş kristaller, taze kristal büyümesi için bir iskele görevi görebilecek kristalin parçalardan oluşan bir bulamaç oluşturmak için parçalanır31,32. Mikro tohumlama, seri kristalografik numune hazırlamada, kristal çekirdeklenmeyi arttırmaya gerek kalmadanXn'yi arttırmanın bir yolu olarak yaygın olarak kullanılmaktadır (Şekil 1C).

Buhar difüzyonundan partiye geçiş, deneysel başlangıç noktasını aşırı doymamış veya metastabil bölgelerden çekirdeklenme bölgesine taşımak olarak bir faz diyagramı üzerinde görselleştirilebilir. Bu, protein ve / veya çökeltici konsantrasyonlarını ve / veya ikisinin damla içindeki oranını artırarak (Şekil 1D) ve hangi koşulların kristallerin hızla ortaya çıktığını gözlemleyerek (< 24 saat)26 yapılabilir. Tam buhar difüzyon damlası dengesi günler veya haftalar sürebilir33. Bu nedenle, hızla ortaya çıkan kristalleri gösteren koşulları arayarak, parti koşulları, mikro-parti34,35,36,37 gibi alternatif kristalizasyon tarama formatlarına geçmek zorunda kalmadan bulunabilir.

Çekirdeklenme bölgesi bulunduktan sonra, bir parti durumu bulunur ve bir morfogram - burada, kaba bir faz diyagramı - oluşturulabilir. Morfogram, tohumlu parti veya düz parti protokolünün kullanılıp kullanılmayacağını düşünürken büyük yarar sağlar. Xn'yi protein ve çökeltici konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizerek, nükleasyon kinetiğinin bir değerlendirmesi yapılabilir26. Xn , tüm çekirdeklenme bölgesinde düşük kalırsa, Xn'yi kristal büyümesini sınırlayacak kadar büyük yapmak için tohumlanmış parti gerekebilir. Bu değerlendirme, daha büyük hacimlere (> 100 μL) ölçeklendirme işleminin ilk adımıdır.

Bu yöntem, kristalizasyon laboratuvarlarının çoğunda standart buhar difüzyon kristalizasyon ekipmanı kullanılarak gerçekleştirilebilecek şekilde tasarlanmıştır. Ekipmanın mevcut olması durumunda, bu sürecin birçok bölümünü kolaylaştıracak teknikleri tanımlayan birçok çalışma da yapılmıştır. Bunlar, bunlarla sınırlı olmamak üzere, dinamik ışık saçılması (DLS) 25,27, doğrusal olmayan görüntüleme 20,24,25, toz kırınım 20,24,27 ve elektron mikroskobu 26'yı içerir [güzel bir inceleme için bkz.

Bu çalışmanın amacı, küçük hacimli (< 500 nL) buhar difüzyon kristalizasyonundan büyük hacimli (> 100 μL) parti kristalizasyonuna geçiş yönteminin görsel bir gösterimini sağlamaktır. Cryphonectria parasitica'dan endotiapepsin, bu çeviriyi göstermek için örnek bir sistem olarak kullanılmıştır. Mikro kristallerin gerekli olduğu deney türü ve numune dağıtım yöntemi, ideal Xs çıktısınıetkileyecektir 26. Milisaniye zaman çözünürlüğü41 veya gaz-dinamik sanal nozullar42 gerektiren karıştırma deneyleri için, < 5 μm'lik bir son Xs istenebilir. Bu durumda amaç, fotonla aktive edilen bir pompa-prob deneyi için ve sabit hedefli bir dağıtım yaklaşımı kullanarak yaklaşık 1.5 Å'ye kırınım yapan protein kristalleri üretmekti.

Endiyotiapepsin kullanan böyle bir seri kristalografi deneyinin örnek gereksinimlerinin bir örneğini vermek için, Tablo 1 , varsayımsal bir deneyin deneysel parametrelerini göstermektedir. Örnek bilgiler aşağıda açıklanan protokole dayanmaktadır. İsabet oranları ve veri toplama gereksinimleri hakkında bazı konservatif tahminler göz önüne alındığında, 50 mg, tüm deney için toplam numune tüketim tahminidir.

Şekil 3 , başlangıçtaki küçük hacimli buhar difüzyon kristalizasyonundan büyük ölçekli partiye kadar tüm optimizasyon sürecinin akış şemasını göstermektedir. Seri kristalografi projelerinin çoğunluğu için, bu protokol Adım 2'de başlayacaktır: hedef protein zaten kristalize edilmiş olacağından, 'partiye geçiş'. Bununla birlikte, Adım 1, bütünlük ve okuyuculara önemini hatırlatmak için dahil edilmiştir. İyi kırılan, tek, büyük bir kristale yol açan bir durum bulmak, mikro kristal optimizasyonu için en iyi başlangıç noktasıdır. Adım 2'de, bu durum daha sonra buhar difüzyonundan partiye optimize edilebilir ve çekirdeklenme ve metastabil bölgelerin bir morfogramı çizilebilir. Bu yapıldıktan sonra, toplu iş koşulunun daha büyük birimlere ölçeklendirilmesi Adım 3'te gerçekleştirilebilir. Akış şemasının sonunda, bir kristalograf endotiapepsin için tekrarlanabilir, büyük hacimli (> 100 μL), mikro-kristalizasyon, parti protokolü oluşturmuş olacaktır. Bu yöntem daha sonra ilgilendikleri özel proteine uygulanabilir.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Tüm 96 kuyucuklu oturma-damla kristalizasyon deneyleri, 2 veya 3 damla plakalar kullanılarak kurulmuştur. Tüm 96 delikli ekranların hazırlanmasını ve izlenmesini kolaylaştırmak için bir sıvı taşıma robotu ve bir kristalizasyon görüntüleyicisi/oteli kullanıldı. Kristalizasyon deneyleri için tüm reaktif konsantrasyonları, karıştırmadan önce başlangıç konsantrasyonlarında verilir.

1. Kristal morfolojisini optimize etme

NOT: Adım 1.1.1. ve 1.1.6. Endotiyapepsin kristalleşme koşullarının nasıl bulunduğunu ve bu koşulların tek, iyi kırınım yapan kristaller veren tek bir koşul bulmak için nasıl optimize edildiğini açıklayın.

  1. Seyrek matris optimizasyonu
    1. Taze endotiapepsin çözeltisi hazırlayın.
      NOT: Endotiyapesin, Superan 600 olarak tedarik edildiğinde, tampon olarak depolama çözeltisinden dışarı aktarılmalı ve konsantre edilmelidir.
      1. 4 °C'de 3 l 0.1 m Na asetat pH 4.6 hazırlayın.
      2. 20 cm diyaliz tüpünü kesin ve tamponda kısa bir süre yıkayın. Tüpün bir ucunu bir klips kullanarak kapatın, 50 mL endotiyapepsin çözeltisini tüpe yerleştirin ve ardından diğer ucunu kapatın.
      3. Çözeltiyi, Na Asetat tamponunun 1 L'sinde 4 ° C'de en az 4 saat (veya gece boyunca) diyalize bırakın. Depolama tamponunun bileşenleri nedeniyle, diyaliz torbasındaki çözelti şimdi yaklaşık 100 mL olacaktır.
      4. Endiyotiapepsin içeren diyaliz torbasını taze bir litre 4 °C, 0.1 M Na Asetat pH 4.6'ya aktarın. Bu adımı bir kez daha tekrarlayın, böylece orijinal tampon Na Asetat'a karşı 2000 kat seyreltilmiştir.
      5. Endiyotiapepsin şimdi yaklaşık 10 mg / mL'de olacaktır. 10 kDa santrifüj konsantratör ve santrifüj kullanarak 100 mg/mL'ye konsantre edin.
      6. Flaş, endotiyapepsin çözeltisini sıvı azot içinde 50 μL alikotta soğutun ve -80 ° C'de saklayın.
    2. PACT Premier 96 kuyucuklu seyrek matrisli bir ekran hazırlayın.
      1. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak, kuyu başına tek bir alt kuyucuğa 100 nL 70 mg / mL endotiyapepsin ve 100 nL kuyu çözeltisi dağıtın. Kristalleşme tamponunun eklenmesi üzerine proteini ve kuyu çözeltisini 3 kez karıştırın.
      2. Plakayı kapatın ve 28 gün boyunca 20 ° C'de bırakın, ilk hafta boyunca her gün ve daha sonra 4 hafta boyunca her hafta görüntü çekin.
    3. Seyrek matris analizi
      1. Tek endotiapepsin kristalleri üreten isabetleri tanımlayın. PACT ekranından, MgCl2 içeren koşullar iğne kümeleri yerine singleton olarak büyüdü.
    4. Seyrek matris optimizasyonu
      1. Adım 1.1.3.1'de tanımlanan koşulları içeren MgCl2'den , farklı kuyucuk bileşenlerini rastgele birleştiren ve değiştiren 96 kuyucuklu bir ekran oluşturun.
      2. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak, kuyu başına tek bir alt kuyucuğa 100 nL 70 mg / mL endotiyapepsin ve 100 nL kuyu çözeltisi dağıtın. Kristalleşme tamponunun eklenmesi üzerine proteini ve kuyu çözeltisini 3 kez karıştırın.
      3. Plakayı kapatın ve 28 gün boyunca 20 ° C'de bırakın, ilk hafta boyunca her gün ve daha sonra 4 hafta boyunca her hafta görüntü çekin.
    5. Optimizasyon analizi
      1. Uygun elektronik tablo yazılımını kullanarak, kristallere yol açan kristalleşme koşullarını kristal kalitesine ve yağış seviyesine göre sıralayın, kristal yok (0) ideal (5) ve düşük (0) ila yüksek (5), sırasıyla. Kristal kalitesi ile ilgili olarak, geniş kriterler kutu benzeri bir morfolojiye sahip tek kristallerdir.
      2. Kristalleşme koşulu içeriği ile kristal miktarı ve yağış seviyesi arasında bir Pearson korelasyon analizi gerçekleştirin.
      3. Bu verileri ısı haritası olarak çizin. Tercih edilen sonuçlarla ilişkili bileşenleri ve koşulları arayın.
    6. Kırınım analizi.
      1. Bir X-ışını kırınım deneyi gerçekleştirerek Adım 1.1.5'te tanımlanan koşullardan yetiştirilen kristallerin seri kristalografi için uygun olduğunu onaylayın.
      2. Tanımlanan koşulların her birinden endotiyapepsin kristallerinin bir örneğini 100 veya 293 K'da veri toplanmasına izin veren desteklere yükleyin ve bir X-ışını kırınım deneyi gerçekleştirin. Kriyo altında çalışıyorsanız, kriyo-koruyucu olarak% 25 etilen glikol kullanın.
      3. Bu verileri uygun bir yazılım paketi aracılığıyla işleyin. Endotiapepsin kristalleri 1.5 Å'nin ötesine kırılmalıdır. İkiz kristaller seri kristalografik veri işlemeyi önemli ölçüde zorlaştırabileceğinden, eşleştirmeyi kontrol edin.
      4. Kristaller singletonsa ve 1.5 Å'ya kırınımdaysa, Adım 2'ye geçin. Değilse, Adım 1.1.2'ye geri dönün ve umut verici koşulları belirlemek için daha seyrek matrisli ekranlar deneyin. Adım 1.1.5'te yapılan analizlerden sonra. ve 1.1.6., yaklaşık ideal olarak %25 (w/v) PEG 6.000, 0.1 M Tris-HCl pH 7.0 ve 0.15 M MgCl2 kristalleşme koşulu bulunmuş olmalıdır.

2. Toplu işleme geçiş

  1. Morfogram deneyi
    1. Bir mikro kristal tohum stoğu oluşturun.
      NOT: Tohum stokları yaparken, tohumları görev için özel olarak yetiştirilen kristallerden yapmak en iyi uygulamadır. Bu, tekrarlanabilirliğe büyük ölçüde yardımcı olur. Adım 2.1.1.1'den 2.1.1.11'e kadar olan Adım 2.1.1.11'de sunulan diğer fikirler, her zaman standart sayıda kuyudan (burada 5) yetiştirilen kristalleri kullanmak ve donma-çözülme döngülerini reddetmek için yapıldıktan sonra stokları aliquot'tur.
      1. Kristalizasyon tamponunu içeren kuyucuklara sahip 96 delikli bir kristalizasyon plakası hazırlayın: %25 (w/v) PEG 6.000, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 ve 0,15 M MgCl2.
      2. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak, 200 nL defrosted 70 mg / mL endotiyapepsin ve 200 nL kuyu çözeltisini kuyu başına tek bir alt kuyucuğa dağıtın. Kristalleşme tamponunun eklenmesi üzerine proteini ve kuyu çözeltisini 3 kez karıştırın.
      3. Plakayı kapatın ve 24 saat bekletin.
      4. 1,5 mL'lik bir santrifüj tüpünü 250 μL kristalizasyon tamponu ve 10-15 1 mm cam boncukla doldurun. Santrifüj tüpünü 5-10 dakika soğumaya bırakın.
      5. Kristalli 5 kuyu seçin, kuyuları neşterle açın ve pipet ucu kullanarak kuyucuklardaki kristalleri ezin.
      6. Buzlu santrifüj tüpünden 1 μL tampon aspire edin ve ezilmiş kristal bulamacını homojenize etmek için kullanın. Homojen hale geldikten sonra, tüm bulamacı aspire edin ve soğutulmuş santrifüj tüpünde toplayın.
      7. 5 alt kuyunun her biri için Adım 2.1.2.6'yı tekrarlayın.
      8. Tamponu, havuzlanmış bulamaçları ve boncukları içeren santrifüj tüpünü 30 sn boyunca 1000 rpm'de vorteks.
      9. Santrifüj tüpünü 30 saniye boyunca buza geri koyun.
      10. 2.1.2.8 ve 2.1.2.9 adımlarını iki kez daha yineleyin.
      11. Tohum stoğu artık hazırdır ve 10 μL'lik partiler halinde alıkonulabilir ve -20 °C'de saklanabilir.
    2. Morfogram deneyi yapın.
      1. 2 damla 96 delikli ızgara ekranı hazırlayın. PEG 6.000 konsantrasyonunu plaka kolonları boyunca %5 ila %40 (w/v) arasında değiştirin, tamponu ve tuzu sırasıyla 0,1 M Tris-HCl pH 7,0 ve 0,15 M MgCl2'de tutun.
      2. Endotiyapepsinin 0.1 M Na Asetat pH 4.6'da 100 ila 12.5 mg / mL'de 8 adımda sıralı bir seyreltme hazırlayın. Plakanın her sırası için farklı bir endotiyapepsin konsantrasyonu kullanılacaktır.
      3. Bir sıvı taşıma robotu kullanarak, 150 nL endotiapepsin hem alt kuyucuk 1 hem de 2'ye dağıtın. Alt kuyu 1'de, kuyu çözeltisinin 150 nL'sini dağıtın. Alt kuyu 2'de, 50 nL defrost edilmiş tohum stoğunu ve 100 nL kuyu çözeltisini çoklu aspire edin ve daha sonra her ikisini de protein çözeltisine dağıtın. Kristalleşme tamponu ilavesinden sonra çözeltileri 3 kez karıştırın.
      4. Plakayı kapatın ve her 0, 3, 6, 12, 18, 24 saatte bir, daha sonra ilk hafta boyunca her gün ve sonraki dört hafta boyunca her hafta görüntü alarak 20 ° C'de bırakın. Otomatik görüntüleme mümkün değilse, 1. günde saatlik görüntüleme konusunda endişelenmeyin.
  2. Morfogram analizi
    1. 24 saat sonra çekilen görüntülere bakarak, her bir kuyuda bulunan kristallerin sayısını tahmin edin ve bu tahminleri sağlanan "morfogram jeneratörü" çalışma sayfasına kaydedin. Bu tahminlerin kesin olması gerekmez; Binlerce mikro kristali tek tek saymak, eğer varsa, pratik veya gerekli değildir. Temel olarak, tahminlerin tüm plaka üzerinde tutarlı olmasını sağlamaya çalışın.
      NOT: 24 h kuralı, Beale et al . (2019)26'da yapılan gözlemlere dayanmaktadır. Buhar difüzyon kristalleşme koşullarının dengelenmesi günler veya haftalar sürebilir. Hızlı görünen kristallerin, damla bileşenlerinin kademeli dengelenmesinden ziyade bir toplu işlem yoluyla büyümesi daha olasıdır. Bu nedenle, 24 saatlik kriter biraz keyfidir ve bir parti ile buhar difüzyon deneyi arasındaki kesin bir kesme süresi, durumun spesifik karışımına bağlı olacaktır [bkz . (2019) Tüm ayrıntılar için 26 ].
    2. Belirtilen kutulara endotiapepsin ve PEG 6.000'in başlangıç konsantrasyonlarını girin.
    3. Çalışma sayfası, sonuçları sırasıyla x ve y eksenlerinde çökeltici ve protein konsantrasyonu ile geleneksel faz diyagramı biçiminde otomatik olarak çizecektir. Sadece tohumlanmış damlalarında kristallere yol açan iyi koşullar, diyagramın metastabil bölgesini (şeffaf mavi) gösterirken, hem tohumlanmış hem de tohumlanmamış damlalarda kristalleri olan koşullar çekirdeklenme bölgesini (katı yeşil) gösterir.
      NOT: İdeal olarak, çekirdeklenme bölgesinin çoğunluğu diyagramda bulunmalıdır (yani, diyagramın altında bazı berrak kuyucuklar vardır ve bazı çökeltiler yüksek protein ve çökeltici konsantrasyonlarında görünür olmalıdır). Durum böyle değilse, belki de deneyi tekrarlayın, ancak protein ve / veya çökeltici konsantrasyonunu artırın (mümkünse).
    4. Kristal 24 saatten daha kısa bir sürede ortaya çıktıysa, Adım 2.3.1'e geçin. Değilse, Adım 2.4'e geçin ve toplu işleme doğru optimize etmeye devam edin.
  3. Kristal analizi
    1. Adım 1'in sonunda belirtildiği gibi, bir sonraki adıma geçmeden önce, bu kristallerin istenen morfolojiye ve kırınım kalitesine sahip olduğundan emin olun. Morfoloji ile ilgili olarak, kristaller gözlemlenebilir şekilde ikiz haline getirilmiş ve iğne topu benzeri veya fan benzeri yapılar yerine singleton olarak mı oluşuyor? Kırınım ile ilgili olarak, mümkünse kristallerden kırınım verileri toplayın. Bu kristaller kırılmazsa, daha büyük bir hacimde yetişen kristallerin kırılması olası değildir.
    2. Morfogram deneyinden endotiyapepsin kristallerinin bir örneğini 100 veya 293 K'da veri toplanmasına izin veren desteklere yükleyin ve bir X-ışını kırınım deneyi gerçekleştirin. Kriyo altında çalışıyorsanız, kriyo-koruyucu olarak% 25 etilen glikol kullanın.
    3. Bu verileri uygun bir yazılım paketi aracılığıyla işleyin. Endotiapepsin kristalleri 1.5 Å'nin ötesine kırılmalıdır. Kristal örneği boyunca, hücre boyutunu, toplam gözlem sayısını ve mozaisiteyi gözlemleyin; Bu ölçümler, kırınım yapan kristallerin homojenliği hakkında bir gösterge verecektir.
    4. Kristal morfolojisi ve kırınım kalitesi yeterliyse, Adım 3'e geçin.
  4. Kristal büyüme süresini optimize edin.
    NOT: Morfogram analizi (Adım 2.2), kristalleşme başlangıç noktasının bir göstergesini verecektir (yani, çökeltici ve protein çözeltileri karıştırıldığında damlanın bulunduğu faz diyagramının bölgesi). Düşüş metastabil bölgede mi yoksa çözünürlük çizgisinin altında mı? Parti kristalizasyonu çekirdeklenme bölgesinde başlar (Şekil 1C). Bu adımın amacı, bu başlangıç noktasını çözünürlük çizgisinin veya metastabil bölgenin altından çekirdeklenme bölgesine taşımaktır (Şekil 1D). Tohumlanan Adım 2.2'den düşerse. Kristalleri hızla vermiştir, bu, damla karışımının zaten metastabil bölgede olduğunun bir göstergesidir, eğer değilse, o zaman damlanın aşırı doymuş olmaması muhtemeldir.
    1. Kristal büyüme süresini optimize etme.
      1. Adım 2.1.3'teki ile aynı ekranı kullanarak, 3 damlalı bir plakada 96 delikli bir buhar difüzyon kristalizasyon deneyi hazırlayın.
      2. Endotiapepsinin başlangıç protein konsantrasyonunu y ekseninde arttırın (yani, proteini daha fazla konsantre edin, belki de endotiapepsin için 120 mg / mL).
      3. Adım 2.1.3.2'de olduğu gibi, plakanın her sırası sırayla daha düşük bir protein konsantrasyonu içerecek şekilde seri seyreltme gerçekleştirin.
      4. Plakadaki üç damlanın her birinde farklı damla oranları kullanın: 1: 1, 1: 2 ve 2: 1, protein: çökelti.
      5. Plakayı ilk gün 0, 3, 6, 12, 18, 24 saat ve ardından ilk hafta boyunca her gün ve sonraki dört hafta boyunca her hafta görüntüleyin veya görüntüleyin. Otomatik görüntüleme mümkün değilse, 1. günde saatlik görüntüleme konusunda endişelenmeyin.
      6. En hızlı görünen kristalleri üreten damlaları tanımlayın ve bunları kristal büyümesi 24 saat içinde gerçekleşene kadar tekrarlanan optimizasyonların başlangıç noktaları haline getirin.
      7. Hızla ortaya çıkan bir kristal durumu tanımlandığında, morfogramı ölçeklemeye başlamak için bir başlangıç olarak yeniden çizmek için Adım 2.1'e dönün.

3. Ölçeklendirme

  1. Ölçeklendirme yollarını derecelendirin. Bu aşamada, tek bir ölçeklendirme rotasına karar vermek gerekli değildir, yalnızca seçenekleri sırayla araştırılabilmeleri için tanımlamak ve sıralamak gerekir. Ölçekleme prosedürü sırasında parti karışımının hacmi arttıkça, çekirdeklenme hızında ve kristal boyutları aralığında değişiklikler meydana gelecektir. Bununla birlikte, ölçeklendirilmiş hacim arttıkça bileşen konsantrasyonlarının dikkatli bir şekilde ayarlanmasıyla bunların üstesinden gelinebilir.
    NOT: Adım 3.1.1 ve 3.1.2, morfogramdan bir toplu iş protokolünün mü yoksa tohumlanmış toplu iş protokolünün mü daha uygun olduğunun nasıl ayırt edileceğini açıklar.
    1. Düz toplu iş protokolü
      1. Çekirdeklenme bölgesindeki Xn, protein ve / veya çökeltici konsantrasyonu ile orantılı mıdır? Yani, Xn, çökeltici ve / veya protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak artar mı? -Evet? Git Adım 3.1.1.2. Hayır? Git Adım 3.1.2. 
      2. İstenilen boyutta kristaller veren koşulları bulun ve Adım 3.2'ye gidin.
    2. Tohumlanmış toplu iş protokolü
      1. Xn , çekirdeklenme bölgesi boyunca düz mü? Örneğin, Xn , çökeltici ve / veya protein konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak artmaz.
      2. İstenilen büyüklükte kristaller veren tohumlanmış koşulları bulun ve Adım 3.2'ye gidin. Tüm kristaller çok büyükse - Adım 3.1.2.3'e gidin.
      3. Morfogram deneyini tekrarlayın (Adım 2.1), ancak bu sefer tohumlanmış kuyucuklarda kullanılan tohum stoğunun konsantrasyonunu artırın. Tohum stoğu, oluşumunda daha fazla kristal kullanılarak arttırılabilir. Örneğin, Adım 2.1.1.5'te 5 kuyu yerine 10 kuyu kullanın.
      4. Plakayı ilk 0, 3, 6, 12, 18, 24 saat boyunca görüntüleyin veya görüntüleyin.
      5. Xn artmış olmalıydı ve Xs tohumlanmış damlalarda azalmış olmalıydı. Daha küçük kristallere ihtiyaç duyulursa bu döngüyü tekrarlayın ve ardından tohumlanmış parti protokolünü izleyin.
  2. Kademeli olarak ölçeklendirme
    1. 96 delikli plakalarda ölçekleme. Endotiyapepsin morfogramından, ölçekleme için başlangıçta kristalizasyon koşulu 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 ve% 30 (w / v) PEG 6.000 kullanan düz bir parti yöntemi seçildi. 100 mg / mL endotiyapepin, kristalizasyon tamponu ile 1: 1 oranında karıştırılır.
      1. 100 μL 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl 2 ve %30 (w/v) PEG 6.000 ile 2-3 kuyucuklu 96 delikli bir oturma damlası plakasında2-3 kuyucuk hazırlayın.
      2. Taze çözülmüş 100 mg / mL endotiyapepsin çözeltisi kullanarak, kuyu başına 0.5 μL protein ve 0.5 μL çökeltici dağıtın, kapatın ve 20 ° C'de saklayın.
      3. Plakayı ilk 0, 3, 6, 12, 18, 24 saat boyunca görüntüleyin veya görüntüleyin. Xs ve Xn aralığındaki değişikliklere dikkat edin.
      4. Değişiklikler meydana geldiyse, 3.2.1.1 ila 3.2.1.2 arasındaki adımları tekrarlayın, ancak Xs ve Xn aralığındaki değişiklikleri geri yüklemek için protein, çökeltici ve / veya tohum konsantrasyonunu artırın veya azaltın.
      5. Xs ve Xn aralığı kabul edilebilir olduğunda, Adım 3.2.2'ye geçin.
    2. 24 kuyu delikli asılı damla plakalarda ölçeklendirme
      1. Kuyunun kenarlarını vakumlu gres ile yağlayarak 24 delikli asılı damla plakasından oluşan tek bir kuyu hazırlayın.
      2. 0,5 mL 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 ve %30 (w/v) PEG 6.000 hazırlayın ve yağlanmış suyu iyice doldurun.
      3. Taze çözülmüş endotiyapepsin çözeltisi kullanarak, cam bir örtünün yüzeyine 1 μL protein pipet edin. Pipet, protein damlası üzerine 1 μL kristalizasyon tamponu koyun ve pipet kullanarak karıştırın.
      4. Plakayı ilk 0, 3, 6, 12, 24 saat boyunca görüntüleyin veya görüntüleyin. Xs ve Xn aralığındaki değişikliklere dikkat edin.
      5. Değişiklikler meydana geldiyse, 3.2.2.1 ila 3.2.2.4 arasındaki adımları tekrarlayın, ancak Xs ve Xn aralığındaki değişiklikleri geri yüklemek için protein, çökeltici ve / veya tohum konsantrasyonunu artırın veya azaltın.
      6. Xs ve Xn aralığı kabul edilebilir olduğunda/varsa, Adım 3.2.2.7'ye geçin.
      7. 3.2.2.1 ile 3.2.2.5 arasındaki adımları tekrarlayarak deneyin toplam hacmini kademeli olarak 10 μL'ye yükseltin.
      8. 10 μL veya daha büyük bir hacimdeyken, Adım 3.2.3'teki santrifüj tüplerine geçin.
    3. Santrifüj tüplerinde kireçleme
      NOT: Endotiyapepsin parti durumunun iyileştirilmesi esas olarak 200 μL hacim noktasında gerçekleşmiştir (bkz. İşlem, 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 ve %30 (w/v) PEG 6.000 kristalleşme koşulu ile başladı. Bununla birlikte, PEG konsantrasyonu sonuçta% 40'a (w / v) değişti. Tohumlar ayrıca Xn'yi kontrol etmek için gerekliydi ve kristallerin çok büyük büyümesini önlemek için kristal büyümesinin söndürülmesi gerekiyordu. 3.2.3.1 ila 3.2.3.7 arasındaki adımlar, koşul optimizasyonu sürecini detaylandırır. Adım 3.2.4. Son toplu iş protokolünü açıklayın.
      1. 1 mL kristalizasyon tamponu hazırlayın: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 ve %30 (w/v) PEG 6.000.
      2. Taze çözülmüş 100 mg / mL endotiyapepsin kullanarak, 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 25 μL protein ekleyin.
      3. Kristalleşme tamponunu bir pipet ucu ile 1:1 oranında protein çözeltisi ile iyice karıştırın. Tüpü 20 ° C'de yüksek ajitasyona sahip bir tabanca / rotatöre yerleştirin.
      4. Düzenli (5, 10, 30, 60 dakika, 2, 5, 10, 24 saat) 2.5 μL alikot alın ve bir hemositometrede görüntüleyin. Xn ve Xs aralığını kaydedin.
      5. Değişiklikler meydana geldiyse, Adım 3.2.3.1'i tekrarlayın. 3.2.3.4'e kadar. ancak Xs ve Xn aralığındaki herhangi bir değişikliği geri yüklemek için protein, çökeltici ve / veya tohum konsantrasyonunu artırın veya azaltın
      6. Xs ve Xn aralığı kabul edilebilir olduğunda, Adım 3.2.3.7'ye geçin.
      7. 3.2.2.1 ile 3.2.2.5 arasındaki adımları tekrarlayarak deneyin toplam hacmini kademeli olarak 200 μL veya daha büyük bir değere yükseltin.
    4. Son tohumlanmış toplu iş protokolü
      1. Tohum stoğu hazırlayın.
        1. 2 mL kristalizasyon tamponu hazırlayın: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 ve %40 (w/v) PEG 6.000.
        2. Taze çözülmüş 100 mg / mL endotiyapepsin kullanarak, 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 100 μL protein ekleyin.
        3. Kristalleşme tamponunu bir pipet ucu ile 1:1 oranında protein çözeltisi ile iyice karıştırın. 50 μm kristallerin büyümesine izin vermek için tüpü 24 saat boyunca 20 ° C'de yüksek ajitasyona sahip bir tabanca / rotatöre yerleştirin.
        4. 50 μm kristal bulamacına 10-15 adet 1 mm cam boncuk ekleyin.
        5. Bulamaç ve boncukları içeren santrifüj tüpünü 30 s boyunca 1000 rpm'de vorteks.
        6. Santrifüj tüpünü 30 saniye boyunca buza geri koyun.
        7. 3.2.4.1.5 ve 3.2.4.1.6 Adımlarını 10 kez daha tekrarlayın.
        8. Bu şimdi 1x tohum stoğunun 200 μL'sidir. 1,8 mL kristalizasyon tamponu ekleyerek tohum stoğunu 10x seyreltin. 10x tohum stoğunu 50 μL'lik partiler halinde aliquot edin ve -20 ° C'de saklayın.
      2. Tohumlanmış toplu iş protokolü.
        1. Kristalleşme tamponunu hazırlayın: 0,1 M Tris-HCl pH 7,0, 0,15 M MgCl2 ve %40 (w/v) PEG 6.000.
        2. Bir santrifüj tüpünde, 100 μL kristalizasyon tamponunu 50 μL taze çözülmüş 10x tohum stoğu ile karıştırın.
        3. Taze çözülmüş 100 mg / mL endotiyapepsin kullanarak, 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpüne 150 μL protein ekleyin.
        4. Kristalleşme tamponu/tohum karışımını bir pipet ucu ile endotiyapepsin çözeltisi ile iyice karıştırın ve tüpü 20 °C'de yüksek ajitasyona sahip bir tabanca/rotatöre yerleştirin.
        5. Düzenli 2.5 μL alikot alarak kristalleşmeyi izleyin ve kristalleri bir hemositometrede görüntüleyin. Xn ve Xs aralığını kaydedin.
        6. Yaklaşık 80 dakika sonra, kristaller 15 μm'lik bir Xs'ye ulaştığında, 150 μL 0.05 M Na Asetat pH 4.6, 0.05 M Tris-HCl pH 7.0, 0.075 M MgCl2 ve% 20 (w / v) PEG 6.000 (endotiyapepsin tamponu ve kristalizasyon tamponundan oluşan bir çözelti, karışık 1: 1) ekleyerek reaksiyonu söndürün.
        7. Kristalleri 20 °C'de saklayın.
      3. Protokol, amaçlanan deney için kabul edilebilir bir kristal boyutu aralığı ve sayısı üretti mi? Evet - BİTTİ - Hayır - Adım 3.1'e dönün. tıklayın ve alternatif bir ölçeklendirme seçeneği deneyin. Örneğin, farklı bir protein: çökeltici oranı mümkün olabilir veya bu daha önce yapılmadıysa tohum eklenebilir. Bunların hepsi tükendiğinde, Adım 1'de yeni bir koşul bulmak gerekebilir.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kristal morfolojisini optimize etme
Kristal morfolojisini optimize eden 1. Adım, okuyucuya önemini hatırlatmak için dahil edilmiştir. Zayıf kırınım iğne toplarından mükemmel mikro kristaller oluşturmak mümkün olabilir; Bununla birlikte, yazarlar ikisini ayrı ayrı optimize etmenin daha iyi olduğunu öne süreceklerdir. İlk olarak, buhar difüzyonu yoluyla iyi kırılan, tek kristale yol açan koşulları bulun ve daha sonra iki adımı bir araya getirmeye çalışmak yerine bu koşulları toplu hale getirin. Bu aşamada, yüksek çekirdeklenme koşullarını keşfetmek gerekli değildir; morfoloji ve kırınım kalitesi temel hedeflerdir.

Endotiyapepsinin mikro-kristalleşmesine başlamadan önce, PDB'den biriken yapı kristalizasyon koşullarının bir analizi yapıldı. Enthothiapepsin'in 48 birikiminin 47'si için kristalleşme koşulları ve yaklaşık protokoller elde edilebilir. Bunların hepsi genel olarak Moews ve Bunn (1970) tarafından yürütülen endotiapepsinin ilk kristalleşmesine dayanıyordu46. Bu koşulların benzerlikleri ve 'klasik' kökenleri göz önüne alındığında, daha çeşitli kristalleşme koşullarını keşfetmek için 96 kuyucuklu, buhar difüzyonu, seyrek matrisli bir ekran gerçekleştirildi. Endotiyapepsin 70 mg / mL'ye konsantre edildi ve 100 nL proteini 100 nL kuyu çözeltisi ile karıştırarak 20 ° C'de 96 kuyucuklu bir oturma-damla plakasında bir PACT seyrek matris ekranı47 gerçekleştirildi. 36 saat sonra bu deneydeki her koşul kristallere yol açtı. Bununla birlikte, kristal morfolojisinin bir analizi, bazı koşulların mikro-kristalizasyon optimizasyonu için daha iyi olabileceğini göstermiştir.

Şekil 4A , plakanın çoğunda gözlemlenenleri geniş ölçüde temsil eden PACT ekranından bir düşüş göstermektedir. İlk bakışta, bu kristallerin mikro-kristalleşme için daha fazla optimize edilmeye değer olabileceğini düşünmek cazip gelebilir. Kristaller büyüktür ve önemli çekirdeklenme olduğu görülmektedir. Bununla birlikte, genel kristal morfolojisi ideal değildir. İlk olarak, kristaller gözlemlenebilir tekli değildir, çünkü çoklu kristallerin tek çekirdeklenme noktalarından büyüdüğü görülmektedir. İkincisi, kristal boyutu oldukça asimetriktir ve büyüme esas olarak tek bir eksende gerçekleşir. Bu tür kristallerin teorik olarak X-ışını ışınına iletildiğinde tercihen hizalanma olasılığı daha yüksektir. Her iki özellik de seri kristalografik verilerin toplanması ve işlenmesi sırasında sorunlar ortaya çıkarmaktadır.

Bununla birlikte, Şekil 4B, MgCl2 varlığında büyüyen endotiapepsin kristallerini göstermektedir. Bu morfoloji, MgCl 2 içeren tüm koşullarda tutarlıydı ve bu nedenle morfolojilerinin MgCl2'ye bağlı olduğunu öne sürdü. MgCl2 koşulları, nihai seri deneyler için daha iyi bir hedefi temsil eden tek, daha kutu benzeri kristaller üretti.

PACT ekranında MgCl2 içeren dört koşul vardı. Bu koşulların tüm farklı bileşenlerinin endotiyapepsin kristalizasyonu üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için rastgele bir optimizasyon gerçekleştirildi. Bir dizi konsantrasyon ve pH'da tamponların ve çökeltilerin rastgele bir kombinasyonunu içeren bir ekran oluşturuldu. MgCl2 konsantrasyonu da değişikliğe uğradı ve daha sonra ortaya çıkan düşüşler, görsel kristal kalitesi ve yağış seviyesi açısından keyfi olarak 0-5'ten (0 kristal veya yağış yok) derecelendirildi.

Şekil 5A, bir Pearson'un yağış seviyesi ile kristal kalitesi arasındaki korelasyon analizinden elde edilen sonuçların ve ekran değişkenlerinin ısı haritasını göstermektedir (bu deneyden elde edilen düşüşlerin örnekleri Şekil 5B, C ve D'de gösterilmiştir). Sonuçlar, çözeltinin pH'ının yağış seviyesi ile yüksek oranda ilişkili olduğunu ve alkali tamponların daha fazla yağışla sonuçlandığını göstermiştir. MgCl2 konsantrasyonu, pH ve çökeltici konsantrasyonunun kristal kalitesine olduğu gibi, yağış seviyesi ile hafifçe ilişkiliydi.

Bu sonuçlara dayanarak, 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2,% 20 (w / v) PEG 6.000'de yetiştirilen kristallerin protokolün bir sonraki adımına - Partiye geçişe - alınmasına karar verildi. Kristallerin morfolojisi kabul edilebilirdi ve bu kristallerden elde edilen X-ışını kırınımının ve veri kalitesi metriklerinin analizi, Mg2 + varlığının içinde ve dışında büyüyen kristaller arasında anlamlı bir fark olmadığını göstermiştir (Şekil 9).

Toplu işleme geçiş
Birçok seri kristalografi mikro-kristalizasyon optimizasyonu için, Adım 2 başlangıç noktası olacaktır. İlgilenilen protein, kriyo-kristalografi için zaten kristalize edilmiş olacak ve kristalleşme protokolünün şimdi mikro-kristal bulamaçları oluşturmak için dönüştürülmesi gerekecek. Bu protokol, partiye dönüşümü gerçekleştirmek için sadece 96 delikli buhar difüzyon plakaları kullanmıştır, çünkü buhar difüzyonu, PDB girişlerinin% 95'i tarafından kullanılan kristalizasyon yöntemidir26. Protokol, mikrobatch34,35,37'ye geçmekten kaçındı, çünkü bu geçiş hala benzer bir optimizasyona neden olabilir. Bu, bu protokolün sadece buhar difüzyon plakalarında yapılabileceği anlamına gelmez. Sunulan tüm adımlar, orijinal kristalizasyon yöntemi olsaydı, mikropartide de çalışırdı.

Seçilen durumda endotiapepsinin kristalleşmesini değerlendirmek için, bir morfogram - veya kaba bir faz diyagramı - oluşturuldu. Morfogram deneyinin amacı üç yönlüdür. İlk olarak, morfogramın analizi, Adım 3 - Ölçeklendirme'deki ölçeklendirme yollarını değerlendirirken büyük yarar sağlar. İkincisi, morfogram, toplu işlem yoluyla kristallere yol açan buhar difüzyon koşullarını keşfetmeye yardımcı olan bir optimizasyon aracı olarak işlev görür [yani, hızla ortaya çıkan kristaller (< 24 saat)]. Üçüncüsü, eğer kristaller hızlı bir şekilde ortaya çıkmadıysa, tohumlanmış damlaların bir analizi, kristalografa faz diyagramındaki mevcut durumun yaklaşık konumu hakkında bir fikir verebilir. Örneğin, tohumlanmış koşullar kristaller verirse, ancak tohumlanmamış olanlar vermezse, bu koşulların metastabil bölgede olması muhtemeldir.

Endotiyapepsinin morfogram deneyi, 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2,% 20 (w / v) PEG 6.000 durumuna dayanarak gerçekleştirildi. Protein ve PEG konsantrasyonları sırasıyla 100 ila 12.5 mg / mL ve% 5 ila% 40 (w / v) arasında değişmekteydi. Damlalar analiz edildi ve sonuçlar sağlanan çalışma sayfası kullanılarak çizildi (Şekil 6A).

Ayrıca, Optimizasyon kristal morfolojisi aşamasından, bu durumda ve bu protein konsantrasyonlarında endotiapepsin kristal büyümesinin, 24 saatin altında büyüyen kristallere neden olacağı zaten açıktı. Bu, kristalleşmenin buhar difüzyonu güdümlü bir işlemden ziyade bir parti yoluyla gerçekleştiğini gösterdi. Bu nedenle, bu koşullarda yetiştirilen kristal, daha büyük hacimlere ölçeklendirmek için uygundu.

Eğer kristaller 24 saatten sonra tohumlanmamış damlalarda görünür olmasaydı, kristalleşmenin hala bir geçişe bağlı olması (Şekil 1B) ve dolayısıyla toplu işleme bağlı olmaması muhtemel olurdu. Bu durumda, morfogram deneyinden elde edilen sonuçlar hala ilgi çekicidir. Faz diyagramında kristalleşme için olası başlangıç noktasının ve dolayısıyla sonraki optimizasyonun nasıl ilerlemesi gerektiğinin bir göstergesidir. Tohumlanmış damlalara bakın. Tohumlar, çekirdeklenmeden bağımsız olarak metastabil bölgede kristal büyümesine izin verecektir. Örneğin, kristaller tohumlanmış damlalarda 24 saat içinde görünür, ancak tohumlanmamış damlalarda görünmezse, bu, metastabil bölgenin bir kısmının gözlenebileceğini gösterir. Tohumlanmış veya tohumlanmamış damlalarda kristal gözlenmezse, tüm kuyucuklar doymamış kalır.

Ölçekleme
Morfograma bakıldığında (Şekil 6A), bir takım gözlemler yapılabilir. Çekirdeklenme miktarının hem protein hem de çökeltici konsantrasyonlarından etkilendiği görülmüştür. Ayrıca, protein çökelmesine yol açan damlaların çok net bir sınırı vardı, damlalar ya hiçbir şey, kristal ya da çökelti içermiyordu (Şekil 6B). Tohumların eklenmesi (Şekil 6D), tohumsuz damlalara kıyasla Xn'yi de büyük ölçüde arttırmıştır (Şekil 6C). Tüm bu sonuçları bir araya getirerek, hem toplu hem de tohumlu parti protokolünü% 30 (w / v) PEG 6.000 ve 100 mg / mL endotiyapepsin olarak ölçeklendirmeye karar verildi.

İlk test ölçeklendirmesi 24 kuyucuklu asılı damla plakalarında yapıldı. Kristalleşme davranışındaki herhangi bir değişikliğin gözlemlenebilmesi için damla hacimleri kademeli olarak arttırılmıştır (Şekil 7). Görüldüğü gibi, hem tohumlanmamış hem de tohumlanmış damlalarda kristal büyümesi meydana gelmiştir. Tüm tohumlanmamış damlalar bir dizi kristal boyutu yetiştirdi, ancak ağırlıklı olarak büyük kristaller (100-200 μm - en uzun boyut). Bununla birlikte, tohumlanan damlalar daha küçük kristaller üretti (5 - 50 μm - en uzun boyut). Bu ilk testler, tohumların Xs'yi azaltması gerektiğini, ancak aynı zamanda bu durumun daha büyük hacimler için uygun olması gerektiğini öne sürdü.

Hacim 200 μL'de arttırıldığında, kristalleşme hacmi kristal büyümesi sırasında sürekli olarak çalkalandı. Bu ajitasyonun temel nedeni, kristalleşme çözeltisinin homojen kalmasını ve büyüyen kristallerin tüplerin dibine veya yanlarına yerleşmemesini sağlamaktı. Kristallerin yerleşmesi, hem çok büyük hem de küçük kristallere sahip heterojen bir kristal popülasyonuna yol açabilir. Kristalleşme çözeltisinin çalkalanması, çekirdeklenme44,45'i de teşvik edebilir.

Ne yazık ki, tohumlanmamış% 30 (w / v) PEG 6,000 kristal üretmedi, bu nedenle PEG konsantrasyonu% 35'e (w / v) yükseltildi. Bu artış, sırasıyla 3.6 ± 1.2 x 106 kristal · mL-1 ve 42 ± 4.1 μm nihai Xn ve Xs aralığı ile kristalleşmeyi belirgin şekilde iyileştirdi (Şekil 8A ve B - siyah). Önemli bir gelişme ve kabul edilebilir bir kristal konsantrasyonu olmasına rağmen, son kristaller planlanan deney için çok büyüktü, bu nedenle daha fazla optimizasyon yapıldı. Son kristallerin boyutunu azaltmak için iki yol araştırıldı (Şekil 1E): son kristal büyümesini denemek ve sınırlamak için protein konsantrasyonunun azaltılması (Şekil 8A ve B - sıcak pembe) ve çekirdeklenmeyi denemek ve arttırmak için PEG konsantrasyonunun arttırılması (Şekil 8A ve B - yeşil).

Protein konsantrasyonunun azaltılması ne yazıkki, sonuçta daha büyük kristaller üreten Xn'yi de önemli ölçüde azalttı. PEG konsantrasyonunun% 40'a yükseltilmesi, sırasıyla 3.1 ± 0.7 x 106 kristal · mL-1 ve 39 ± 2.3 μm'lik bir nihai Xn ve X s aralığı elde etti. Bunlar% 35'ten önemli ölçüde farklı değildi, ancak nihai kristal boyutu azaltıldığından, bu durum daha sonraki optimizasyonlarla devam etti.

Xn'yi arttırmak için tohumlar eklendi. Bu, Xn'yi (1.1 ± 1.8 x 10 8 kristal · mL-1) önemli ölçüde artırdı ve daha küçük bir Xs'ye (4.2 ± 4.0 μm) yol açtı (Şekil 8A ve B - kesikli mor). Bu kristaller, bazı seri kristalografi deneyleri için çok uygun olmasına rağmen, çok küçük kabul edildi, bu nedenle eklenen tohumların konsantrasyonu değiştirildi.

Bununla birlikte, eklenen tohum stoğunun bu ayarının güvenilir bir şekilde tekrarlanmasının zor olduğu kanıtlandı; Bu nedenle, söndürme girişiminde bulunuldu. Bir tohum stoğunun eklenmesinden sonra, kristal boyutu izlendi ve uygun bir kristal boyutu elde edildiğinde (yaklaşık 10 - 20 μm), parti kristalizasyonu söndürüldü (Şekil 8C ve D). Söndürme, mikro-kristalleşme ile ilgili olarak, Kupitz et al. (2014) 25'te önerilmiştir. Belki de ideal bir yöntem olmasa da, protein çözeltisi nihayetinde boşa harcanacağı için26, kristal büyümesinin kontrol edilmesi zor olduğu için teknik bu durumda çok faydalıydı. Söndürmenin ardındaki fikir, kristalleşme karışımını çözünürlük çizgisinin hemen üzerindeki bir noktaya hızla geri döndürmektir (Şekil 1F). Çözelti çözünürlük hattına geri döndüğünde, çözelti kararlı bir doymuş çözeltiye geri döndü ve daha fazla kristal büyümesi meydana gelmeyecek.

Bir kristalleşme reaksiyonunu söndürmeye çalışmak risksiz değildir. Çok büyük bir söndürme çözeltisi eklenirse, çözeltideki protein, çözünürlük çizgisinin geçileceği kadar seyreltilebilir. Bu durumda, çözelti doymamış hale gelecek ve kristaller çözünmeye başlayacaktır. Bunu önlemek için, morfogram sonuçlarına dayanarak gerekli söndürme çözeltisinin miktarını tahmin etmek mümkündür. Söndürme noktasında, protein çözeltisinin konsantrasyonunu alın. Çözünürlük hattındaki protein konsantrasyonu ile çözeltideki protein konsantrasyonunu karşılaştırarak, gerekli seyreltmenin bir tahmini yapılabilir.

@ (w/v) PEG 6.000, 10 x seyreltilmiş tohum deneyinin söndürülmüş versiyonu, sırasıyla 2.6 ± 3.1 x 106 kristal · mL-1 ve 15 ± 3.9 μm nihai kristal konsantrasyonu ve boyut aralığı verdi.

Tüm süreç boyunca, endotiapepsin kristallerinin test X-ışını veri koleksiyonları, İsviçre Işık Kaynağı PXII ışın hattında, 10 x 30 μm'lik bir odak,% 80 oranında zayıflatılmış 12.4 keV'lik bir enerji kullanılarak ve kriyo-koşullar altında toplandı. Veriler kadranlar kullanılarak işlenmiştir ve Şekil 9'da CC1/2'nin karşılaştırması görülmektedir. Optimizasyon sırasında CC1/2'de dramatik bir değişiklik gözlenmedi.

figure-results-1
Şekil 1: Bir faz diyagramına eşlenen geçiş ve toplu kristalleşme ve ölçeklendirme yöntemlerine genel bakış. Bir. Arketipik protein kristalizasyon faz diyagramının bölgeleri ve sınırları. Çökeltici ve protein konsantrasyonları, sırasıyla x ve y eksenlerinde, orijindeki saf su noktası ile çizilir. Mor çizgi, protein aşırı doygunluk sınırını gösterir ve metastabil, çekirdeklenme ve çökeltme bölgeleri sırasıyla mavi, yeşil ve pembe renkte gösterilir. B. Buhar difüzyonu gibi bir 'geçiş fazı' kristalizasyon yönteminin nükleasyon bölgesi penetrasyon sınırlarına bir örnek. Bu teorik deneyde, damla çökeltici ve protein konsantrasyonları çözünürlük çizgisinin hemen altında başlar - henüz aşırı doymuş değildir. Damla dengelenirken, damla bileşeni konsantrasyonları, damla aşırı doygun hale gelecek şekilde artar ve çekirdeklenme bölgesine hareket etmeye - veya geçmeye - devam eder. Kristal çekirdeklenme üzerine, çözeltideki protein konsantrasyonu düşmeye başlar. Konsantrasyon, kristaller büyüdükçe çözünürlük hattında durana kadar düşmeye devam eder. Mavi noktalı çizgi, çekirdeklenme bölgesine geçişin teorik bir sınırını işaret eder. Çekirdeklenme başlar başlamaz, protein konsantrasyonu düşecek ve daha fazla penetrasyonu önleyecektir. C. Örnek parti ve tohumlu parti kristalleşme yörüngeleri. Toplu olarak, protein ve çökelticinin karıştırılması, çekirdeklenme bölgesi içinde aşırı doymuş bir çözelti oluşturmalıdır, böylece kristal büyümesi meydana gelebilir. Tohumlu partide, mikro tohumların eklenmesi nedeniyle çekirdeklenme bölgesinde olmak kesinlikle gerekli değildir, bu nedenle metastabil bölgedeki yerler de araştırılabilir. D. B'de gösterilen kristalleşme deneyinin buhar difüzyonundan partiye varsayımsal bir optimizasyonu. Orijinal buhar difüzyonu başlangıç noktası, elde edilen optimizasyon vektörü aracılığıyla yeni başlangıç konumuna geçmiştir; çekirdeklenme bölgesinin içinde. Elde edilen vektör iki optimizasyonun ürünüdür: hem protein hem de çökeltici konsantrasyonlarında bir artış. E. Son Xn ve X s'yi uyarlamak için toplu iş koşullarını ölçeklendirirken örnekoptimizasyonlar. F. Kristalleşme deneyinin kristalleşme tamponu ilavesiyle söndürülmesi. Söndürmenin protein konsantrasyonunu metastabil bölgeden ve dolayısıyla protein aşırı doygunluk noktasının altına almaması esastır. Aksi takdirde, kristaller çözelti halinde tekrar çözünmeye başlayacaktır. B. ve C ., yazarların izniyle Beale et al. (2019)26'dan uyarlanmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-2
Şekil 2: Xn'nin arttırılması ve Xs'nin azaltılması. Bir kristalleşme deneyinden üretilen kristallerin sayısı ile ortalama en uzun boyutları arasındaki idealize edilmiş ilişki. Bu grafiği oluşturmak için, varsayımsal bir 10 kDa model proteinin kristalizasyonu kullanılmıştır. Protein 10 mg / mL'lik bir konsantrasyonda kristalleşti ve 49x50x51 şboyutlarında P2 1 2 1 21kristalleri verdi. Her çekirdeklenme olayının bir kristal verdiği varsayılıyordu. Kristal büyümesinin her yüzden homojen olduğu varsayılıyordu. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 3: Küçük hacimli (<500 nL), buhar difüzyon deneyinde yetiştirilen bir kristali büyük hacimli (> 100 μL) bir toplu deneye optimize etme adımlarını gösteren bir akış şeması. Kristal optimizasyonu üç aşamaya ayrılır: (1) Kristal morfolojisini optimize etmek. (2) Toplu işleme geçiş. (3) Ölçeklendirme. Aşama 1'de mikro-kristalizasyon için uygun kristalleri tanımlamak önemlidir. Bazı proteinler, kristalleşme durumundan bağımsız olarak sadece tek bir kristal morfolojisinde bulunur. Bununla birlikte, tek, küp benzeri kristallere yol açan veya bunlara insani olarak mümkün olduğunca yakın olan koşulları aramaya değer. Tek, küp benzeri kristaller, varsayımsal ve anekdotsal olarak, genellikle seri kristalografi deneylerinden daha iyi sonuçlara yol açacaktır. Bir kristal morfolojisi seçildikten ve kırınım onaylandıktan sonra, kristalleşme deneyini buhar difüzyonundan partiye taşımak gerekir (Aşama 2). Burada, kristaller çekirdeklenme sürelerine göre optimize edilmelidir. Amaç, hızla ortaya çıkan kristalleri (> 24 saat) veren koşulları bulmaktır, çünkü bu koşulların çekirdeklenme bölgesine hemen çarpması muhtemeldir ve bu nedenle partidir. Çekirdeklenme bölgesinde bir durum bulunduğunda, bir morfogram oluşturulabilir. Morfogram, çekirdeklenme bölgesinin çoğunluğunun Aşama 3 için tanımlanan haritalanmış ve potansiyel ölçekleme yollarına izin verir. Tanımlanan bir toplu iş koşulunun hacmi daha sonra >100 μL'lik nihai bir hacim elde etmek için kademeli veya hızlı bir şekilde boyutlandırılabilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-4
Şekil 4: Bir PACT seyrek matris ekranından endotiapepsin kristalizasyon koşullarının analizi. A . ve B., PACT ekranından sırasıyla A4 ve C10 kuyularının 24 saatinden sonraki fotoğraflardır . Kristalleşme tamponu bileşenleri şekil üzerinde vurgulanmıştır. SPG tamponu, 2:7:7 molar oranında karıştırılmış süksinik asit, sodyum dihidrojen fosfat ve glisindir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-5
Şekil 5: PACT MgCl2 koşullarından endotiapepsin kristalizasyon optimizasyonunun analizi. Bir. Bir Pearson'un tampon pH, MgCl2 konsantrasyonu ve çökeltici konsantrasyonu ile çökelti seviyesi ve kristal kalitesi arasındaki korelasyon analizinden elde edilen sonuçların bir ısı haritası. Yağış seviyesi ve kristal kalitesi, M.Ö . 24 saatten sonra 0-5 ölçeğinde (0 kristal veya yağış olmadan) keyfi olarak değerlendirildi.ve D . kristalleşme ve çökelme örneklerini üç farklı damla halinde gösterir. Kristalleşme durumu ve yağış seviyesi ve kristal kalitesinin değerlendirmeleri de gösterilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-6
Şekil 6: 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 ve PEG 6.000'de kristalize edildiğinde bir endotiyapepsin morfogramı. Bir. Sağlanan "faz-diyagram-üreteci" elektronik tablosundan oluşturulan bir morfogram. Her damladaki göreceli kristal sayısı, dairelerin büyüklüğü ile gösterilir ve damla 1 (protein ve çökelti) ve damla 2'den (protein, çökeltici ve tohumlar) elde edilen sonuçlar sırasıyla yeşil ve mavi renkte vurgulanır. Sırasıyla x ve y eksenindeki protein ve çökeltici konsantrasyonlarının değerleri, nihai hacimlerden ziyade her birinin önceden karıştırılmış değerlerini gösterir. Sonuçlara dayanarak, sırasıyla çekirdeklenme bölgesinin ve metastabil bölgenin sınırlarını göstermek için siyah çizgiler ve mor bir çizgi çizilmiştir. M.Ö. ve D. denemeden bazı örnek sonuçlar gösterir. A. üzerinde işaretlenmiş kırmızı ve mavi noktalar B. ve C .'nin yerlerini gösterir.ve D., sırasıyla. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-7
Şekil 7: 24 kuyucuklu asılı damla plakalarında endotiapepsinin ilk ölçekleme denemeleri. Tüm yollar için aynı protein ve çökeltici konsantrasyonları kullanıldı: 0.1 M Na Asetat pH 4.6 ve 0.1 M Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 ve% 30 (w / v) PEG 6.000'de 100 mg / mL endotiapepsin. Görüntülenen tüm görüntüler 24 saat sonra çekilmiştir ve son damla hacimleri her görüntüde etiketlenmiştir. Sol panel (A, D ve G) 1: 1 protein ve çökeltici karışımıdır, orta panel (B, E ve H) 1: 2: 3 tohum, çökeltici ve protein karışımıdır ve sağ panel (C, F ve I) orta panelin büyütülmüş görüntüleridir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-8
Şekil 8: 200-300 μL hacimlerde endotiapepsin mikro-kristalizasyonunun analizi. A. ve C., Xn'nin deney süresi boyunca nasıl değiştiğini gösterir. B. ve D. Xs (en uzun boyut) zaman içinde nasıl değiştiğini gösterir. Deneylerin sonuçları netlik için ayrılmıştır. C. ve D. üzerindeki kırmızı noktalı çizgi, söndürmenin yapıldığı noktayı gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-9
Şekil 9: CC1/2 sonuçları ve kırınım kalitesini değerlendirmek için mikro-kristalizasyon işleminin her aşamasında elde edilen kristallerin görüntüleri. Bir. CC1/2, yetiştirilen kristallerden toplanan verilerden elde edilen çözünürlüğe karşı çizilmiştir: Mg ile ve Mg olmadan - Aşama 1 optimizasyonunun bir parçası, 200 nL hacimde, 10 μL hacimde ve son 300 μL hacimde. M.Ö. ve D. sırasıyla 200 nL, 10 μL ve 300 μL hacimdeki kristalleri gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Protein Bilgisi
ProteinEndotiapepsin
Moleküler Ağırlık (kDa)33.8
Uzay GrubuP12 11
a, b, c (Å)45.2, 73.3, 52.7
α, β, ɣ (°)90.0, 109.2, 90.0
Sabit hedef parametreleri
Çip başına yüklenen hacim (μL)150
Çip başına aperatürler25,600
Gerekli kristal konsantrasyonu (kristal/mL)500,000
Örnek Bilgiler
200 μL numune yapmak için kullanılan protein kütlesi (mg)10
Kristal en uzun boyut (μm)15
Kristal konsantrasyonu (kristaller/mL)2,500,000
Deneysel Değişkenler
Gerekli zaman noktası sayısı5
Zaman noktası başına gereken görüntü sayısı50,000
İsabet oranı (entegre desenler/toplanan görüntüler)0.3
Zaman noktası başına gerekli sabit hedefler (yukarı yuvarlanır)7
Örnek gereksinimler
Zaman noktası başına gereken numune hacmi (μL)1,050
Deney için gereken toplam numune hacmi (mL)5.25
Gerekli toplam protein kütlesi (mg)52.5

Tablo 1: Sabit hedefler kullanılarak gerçekleştirilen varsayımsal bir optik pompa-prob deneyi için numune gereksinimlerine bir örnek. Bu teorik deneyde kullanılan protein endotiapepsin idi. Sabit hedef parametreleri, Ebrahim ve ark. (2019)48 ve Davy ve ark. (2019)49'da bildirilen deneylere dayanmaktadır. Örnek bilgiler bu video makalesinde bildirilen protokolden geldi ve deneysel değişkenler yaşanmış deneyimlere dayanan konservatif tahminlerdi. Aşağıdaki örnek gereksinimler daha sonra önceki varsayımlar göz önünde bulundurularak hesaplanmıştır.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sunulan yöntem, seyrek matrisli 96 delikli eleklerde yetiştirilen büyük kristallerden (≥ 100 μm en uzun boyut) endotiyapepsinin, santrifüj tüplerinde (300 μL hacim) yetiştirilen mikro kristallere kadar kristalleşmesinin parti yoluyla nasıl optimize edileceğini göstermektedir. Protokolün arkasındaki fikir, endotiapepsini optimize etmek için atılan adımların diğer proteinler için de kullanılabileceğidir. Sonuçta, XFEL'lerde ve senkrotronlarda seri kristalografi deneyleri için büyük hacimli (>100 μL) mikro kristaller (10-20 μm) oluşturma problemine cevap vermek.

Protokol, büyük hacimli mikro-kristalizasyon görevini üç adıma ayırır: (1) Kristal morfolojisini optimize etmek, (2) Toplu işleme geçiş ve (3) Ölçeklendirme. Adım 1'de, bir proteinin oluşturabileceği kristal formlarının aralığı, buhar difüzyon plakalarında araştırılmalıdır. Gerekli çözünürlüğe kırılan tek, kutu benzeri kristallere yol açan koşullar hedef olmalıdır. Adım 2'de, seçilen koşullar daha sonra buhar difüzyonundan partiye dönüştürülebilir. Burada optimizasyon kriteri kristal büyüme süresi ve 24 saat içinde protein kristallerine yol açan koşulları bulmaktır. Deneyciye çözünürlük çizgisinin yeri ve çekirdeklenme bölgesi sınırları hakkında bir fikir veren bir morfogram da çizilebilir. Bu morfogram, Adım 3, Ölçekleme'de büyük fayda sağlar. Morfogram, çekirdeklenmenin tek başına Xn'yi artırıp artıramayacağının ve Xs'yi aşağı çekip çekemeyeceğinin bir göstergesi olacaktır. Deneyin hacmi arttıkça, Xn ve Xs , ölçekleme başarısının temel kriterleri olarak sürekli olarak değerlendirilebilir.

Endotiyapepsin durumunda, Adım 1, endotiyapepsin için potansiyel olarak daha önce bilinmeyen bir kristal morfolojisinin ne olduğunu ortaya çıkardı. Bu morfoloji, daha önce bildirilenlerle aynı uzay grubuna sahipti, ancak seri kristalografi için daha önemli olan, daha kutu benzeri bir şekle sahipti. Tek kristaller, diğer koşullardan oluşturulan fanların aksine, tek çekirdeklenme noktalarından da büyüyor gibi görünüyordu (Şekil 4). Seçilen koşul için, kristal büyümesi < 24 saatte gerçekleştiği için Adım 2 zaten kısmen tatmin olmuştu. Morfogram, Adım 3'te ölçeklendirme yaparken hem düz hem de tohumlu toplu iş protokolünün başarılı olabileceğini gösterdi. Düz partideki ilk ölçekleme, sırasıyla 3.6 ± 1.2 x 106 kristal · mL-1 ve 42 ± 4.1 μm Xn ve Xs aralığına sahip kristaller üreten bir koşul yarattı. Bu kristaller, bazı seri kristalografi deneyleri için kabul edilebilir olmasına rağmen, çok büyük kabul edildi. Böylece ek optimizasyonlar yapıldı. Son protokol, sırasıyla 3.1 x 106 kristal · mL-1 ve 15 ± 3.9 μm konsantrasyon ve boyut aralığına sahip kristaller üretti. Bu, planlanan deneyler için ideal olandan daha fazlasıydı.

Yöntem, buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen 'çözünür' protein kristallerinin partiye dönüştürülmesine odaklanmaktadır. Bu odaklanmanın nedeni, çözünür protein kristallerinin büyük çoğunluğunun buhar difüzyonu 26 yoluyla yetiştirilmesidir. Bununla birlikte, sunulan kavramlar, mikro-batch gibi diğer yöntemler kullanılarak yetiştirilen çözünür protein kristallerine de uygulanabilir. Kavramlar, LCP'de yetiştirilen membran protein kristallerine de uygulanabilir; çünkü bu da bir toplu kristalizasyon işlemidir.

Protokolün önemli bir yönü, buhar difüzyon plakalarında yetiştirilen kristallerin koşullarını, toplu olarak yetiştirilebilecek şekilde dönüştürme işlemidir. Bu dönüşüm için yöntem, Beale et al. (2019)26 tarafından önerilen kriteri kullanır. Bir parti işlemi ile yetiştirilen kristaller, buhar difüzyon plakalarında bile, hızla oluşacaktır (< 24 saat). Bu kriter, buhar difüzyon damlası dengesinin hızına dayanan bir yaklaşımdır ve PEG bazlı çökeltici koşulları için en doğru olanıdır. Bununla birlikte, kristalleşme koşulları, dengelenme süresini etkileyecek çok çeşitli bileşikler içerecektir. Tuz bazlı kristalleşme koşullarının, örneğin yüksek konsantrasyonlu amonyum klorürün dengelenmesi, 1-2 gün içinde gerçekleşebilir. Bu nedenle, 24 saat kriteri tuz bazlı koşullar için doğru olmayabilir. Tuz bazlı koşullar ayrıca bu protokolde sunulan arketipe uymayabilecek daha karmaşık faz diyagramları 26,30'a sahip olabilir. Tuz bazlı koşullar için zaman kriterinin 12 veya 6 saate düşürülmesi, daha büyük hacimlere ölçeklendirmenin imkansız olduğu kanıtlanırsa gerekli olabilir.

Bu yöntemin bir başka sınırlaması da belirgin karmaşıklığıdır. Endotiapepsinin mikro-kristalizasyonunu optimize etmek için izlenen protokol aslında orijinal durumu seyrek matris ekranından nispeten az değiştirdi. PACT ekranında gözlenen ilk vuruş 0.1 HEPES pH 7.0, 0.2 M MgCl2 ve% 20 (w / v) PEG 6.000 idi. Son ölçekli kristalizasyon tamponu 0.1 Tris-HCl pH 7.0, 0.15 M MgCl2 ve% 40 (w / v) PEG 6.000 idi. Tampondaki HEPES'ten Tris-HCl'ye ve MgCl2 konsantrasyonuna olan değişimin prosesin başarısına çok az katkıda bulunması da çok olasıdır. PEG 6.000 konsantrasyonundaki artışı tek optimizasyon olarak bırakmak ve oldukça basit bir şekilde elde edilebilecek bir optimizasyon.

Bununla birlikte, bu değerlendirme de çok basittir. Sadece ölçeklendirme sırasında karşılaşılan sorunları (yani, tohum kullanımı ve söndürme) değil, aynı zamanda bu proteinin basit olduğu kanıtlandığı için, bir sonrakinin de kanıtlayacağının garantisi olmadığı gerçeğini de göz ardı eder. Protokolde önerilen adımlar, protein kristalleşme hacimlerinin ölçeklendirilmesini optimize etmek çok protein pahalı olabileceğinden tasarlanmıştır. Gösterilen yedi endotiyapepsin ölçekleme denemesi boyunca, 100 mg protein tüketildi. Kuşkusuz bu adımların bazıları, bu protokol ışığında sonuçlarını göstermek için gerçekleştirilmiştir. Buna rağmen, 100 mg bir protein, artı bir deney sırasında tüketilen protein için potansiyel olarak 50 mg daha fazla (Tablo 1), zaman veya para için önemli bir yatırım olabilir.

Neyse ki, gerekli numunenin bu kütlesinin tüm proteinlerde her yerde bulunduğu açık değildir. Endotiapepsin yüksek oranda çözünürdü ve bu nedenle aşırı doygunluğa ulaşmak için büyük bir protein konsantrasyonu gerektiriyordu. Diğerlerinde (şu anda optimizasyon altında), aşırı doygunluğa 10 veya hatta 5 mg / mL'de ulaşılabilir. Bu tür değişkenler proteine özgüdür ve ortaya çıktıklarında kucaklanmaları gerekir.

Yöntemin diğer sınırlamaları arasında, ekran ve plaka oluşturma için sıvı taşıma robotları ve gerektiğinde plakaları otomatik olarak görüntülemek için görüntüleyiciler gibi karmaşık ekipmanlara güvenmesi yer almaktadır. Bu ekipmanların bazılarının ihtiyacını sınırlamak için alternatif rutinler önerilmiştir, ancak protokolün onlarsız takip edilmesi daha fazla zaman alacaktır. Protokol ayrıca optimize edilmiş kristallerin kırınımını test etmeyi önerir. Bir senkrotrona düzenli erişimi olmayan kristalograflar için, bu testler zor olabilir. Her adımdaki kontroller gerekli olmayabilir, ancak bu testler bir isabet belirlendikten sonra ve ölçeklendirme öncesi ve sonrası şiddetle tavsiye edilir. Bir XFEL'deki kırınım yapmayan kristaller, ne yazık ki, nadir görülen bir olay değildir. Bu göz önüne alındığında, kristal kırınım hakkındaki varsayımlarla ilgili olarak dikkatli olmak daha iyidir.

Nihayetinde, burada sunulan bu protokol ve sonuçlar, seri kristalografi deneyleri için numune üretmekle mücadele edenlere bir rehber, fikirler ve bir örnek sunacaktır. Umarım, seri kristalografi daha da geliştirildikçe, tekniğin numune talepleri azalır, böylece bunun gibi protokollere olan ihtiyaç azalır. Bununla birlikte, bu olayda bile, burada sunulan stratejiler, proteinlerinin kristalleşme alanını keşfetmek isteyenler için hala yararlı olacaktır.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu proje, Marie Skłodowska-Curie hibe anlaşması No 701647 kapsamında Avrupa Birliği'nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından finansman almıştır. İsviçre Işık Kaynağı ışın hattı X10SA-PXII'deki ışın çizgisi bilim adamlarının yardımı ve desteği için çok teşekkürler.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Swissci 96 kuyulu 2 damlalıMoleküler BoyutlarMD11-00296 kuyulu 2 damla kristalizasyon plakası
Swissci 96 kuyulu 3 damlalı plakalarMoleküler BoyutlarMD11-00396 kuyulu 3 damla kristalizasyon plakası
sivrisinek LCP sıvı işleme robotusptlabtechsivrisinek LCPKristalizasyon robotu
ClearVue LevhalarMoleküler BoyutlarMD6-01596 kuyulu kristalizasyon plakası contaları
Safe-Tube 1.5 mLEppendorf301200861.5 mL santrifüj tüpleri
ScapleSwan ve MortonNo. 3 neşter ve No. 3 tutamakAçık plaka contalarını kesmek için Scalple
MS 3 VorteksIKA3319000Çözeltiyi karıştırmak ve tohum stokları yapmak için vorteks
24 kuyulu XRL PlakaMoleküler BoyutlarMD3-1124 kuyulu asılı damla plakaları
Tüp tabanca/döndürücüThermo Fischer Scientific88881001Ölçekleme sırasında çözelti karıştırmak için tüp tabanca
Eppendorf Research plus pipetlerEppendorfManuel pipet serisi, 0,5-10, 1-20, 10-100, 100-1000 ve mikro; L
Eppendorf pipet uçlarıEppendorfManuel pipetler için uç boyutları aralığı
Suparen 600Prochem AGSuparen 600Endotiapepsin çözeltisi
Sodyum AsetatSigma-Aldrich241245-1KGSodyum Asetat
TrisMerck8382T014Tris
Magnezyum KlorürSigma-AldrichM2670-1kgMagnezyum Klorür
PEG 6.000Sigma-Aldrich81255-1kgPEG 6.000
Eterilen glikolSigma-Aldrich324558-1LKristalleri cyro-protect için etelilen glikol
PACT Premier HT ekranMoleküler BoyutlarMD1-36PACT Premier 96 kuyulu kristal ekran
DOW CORNING yüksek vakumlu gresMoleküler BoyutlarMD6-02Gres 24 oyuklu plakaların sızdırmazlığı için
Hirschmann 22 x 22 mm glaser kapak kızaklarıHirschmann800010424 kuyulu oturma damla plakalarının sızdırmazlığı için kapak kızakları
Kristal pimlerPSIŞirket içinde üretilmiştirMikro kristaller için ince film destekleri.
1-1.3 mm SiLibeads Type SFaust6239547Miko-tohum stokları yapmak için cam boncuklar
Macbook ProAppleMacbook ProVeri analizi yapmak için bilgisayar
CCP4 yazılım paketiCCP4Kırınım modeli veri işleme yazılımı
ExcelMicrosoftMicrosoft OfficeFaz diyagramı
için çizim aracıHausser Scientific Bright-Line sayma odasıThermo Fischer Scientific02-671-51BKristal konsantrasyonunu hesaplamak için araç
PACT PremierMoleküler BoyutlarMD1-29-ECOSeyrek matris kristalizasyon ekranı
Kaya GörüntüleyiciFormulatrixKaya GörüntüleyiciSıcaklık kontrollü kristal plaka depolama ve görüntüleyici
Rock MakerWebFormulatrixRock MakerWebKristal plaka oluşturma ve görüntü depolama stoftware
FormulatorFormulatrixFormulator96 kuyulu kristal ekran oluşturma sıvı işleme robotu
Leica MZ16 MikroskopLeicaLeica MZ16Işık mikroskobu
LAS V4.6LeicaLAS V4.6Leica mikroskopları için yazılım
Spectra/Por 3.5 kDa diyaliz tüpüSpectrumlabsSpectra/Por 3 Diyaliz Membranı3.5 kDa diyaliz membranı
Diyaliz tüpü kapaklarıSpectrumlabsSpectra/Por 3 Duniversal KapaklarDiyaliz tüpü uçlarını kapatmak için klipsler
Amicon 10 kDa santrifüj yoğunlaştırıcıMerck-MilliporeAmicon Ultra-15 10 kDa santrifüj yoğunlaştırıcı10 kDa santrifüj filtre
5810 R döner kovalı santrifüjEppendorf5810 R SantrifüjSalıncak kova santrifüjü
plakalar

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DePonte, D. P., et al. Gas dynamic virtual nozzle for generation of microscopic droplet streams. Journal of Physics D: Applied Physics. 41 (19), 195505(2008).
  2. Hunter, M. S., et al. Fixed-target protein serial microcrystallography with an x-ray free electron laser. Scientific Reports. 4 (1), 6026(2014).
  3. Weierstall, U., et al. Lipidic cubic phase injector facilitates membrane protein serial femtosecond crystallography. Nature Communications. 5 (1), 1-6 (2014).
  4. Roessler, C. G. G., et al. Acoustic Injectors for Drop-On-Demand Serial Femtosecond Crystallography. Structure. 24 (4), 631-640 (2016).
  5. Sherrell, D. A., et al. A modular and compact portable mini-endstation for high-precision, high-speed fixed target serial crystallography at FEL and synchrotron sources. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1372-1378 (2015).
  6. Roedig, P., et al. A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering. Scientific Reports. 5 (1), 1-11 (2015).
  7. Botha, S., et al. Room-temperature serial crystallography at synchrotron X-ray sources using slowly flowing free-standing high-viscosity microstreams. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 71 (2), 387-397 (2015).
  8. Weinert, T., et al. Serial millisecond crystallography for routine room-temperature structure determination at synchrotrons. Nature Communications. 8 (1), 542(2017).
  9. Tenboer, J., et al. Time-resolved serial crystallography captures high-resolution intermediates of photoactive yellow protein. Science. 346 (6214), 1242-1246 (2014).
  10. Nango, E., et al. A three-dimensionalmovie of structural changes in bacteriorhodopsin. Science. 354 (6319), 1552-1557 (2016).
  11. Suga, M., et al. Light-induced structural changes and the site of O=O bond formation in PSII caught by XFEL. Nature. 543 (7643), 131-135 (2017).
  12. Mehrabi, P., et al. Liquid application method for time-resolved analyses by serial synchrotron crystallography. Nature Methods. 16 (10), 979-982 (2019).
  13. Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
  14. Fraser, J. S., et al. Hidden alternative structures of proline isomerase essential for catalysis. Nature. 462 (7273), 669-673 (2009).
  15. Fenwick, R. B., van den Bedem, H., Fraser, J. S., Wright, P. E. Integrated description of protein dynamics from room-temperature X-ray crystallography and NMR. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (4), 445-454 (2014).
  16. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. Elife. 4, (2015).
  17. Thomaston, J. L., et al. XFEL structures of the influenza M2 proton channel: Room temperature water networks and insights into proton conduction. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (51), 13357-13362 (2017).
  18. Haas, D. J., Rossmann, M. G. Crystallographic studies on lactate dehydrogenase at -75 °C. Acta Crystallographica Section B Structural Crystallography and Crystal Chemistry. 26 (7), 998-1004 (1970).
  19. Hope, H. Cryocrystallography of biological macromolecules: a generally applicable method. Acta Crystallographica Section B Structural Science. 44 (1), 22-26 (1988).
  20. Wu, W., et al. Batch crystallization of rhodopsin for structural dynamics using an X-ray free-electron laser. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 71 (7), 856-860 (2015).
  21. Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. Preparation and delivery of protein microcrystals in lipidic cubic phase for serial femtosecond crystallography. Journal of Visualized Experiments. (115), e54463(2016).
  22. Andersson, R., et al. Well-based crystallization of lipidic cubic phase microcrystals for serial X-ray crystallography experiments. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 75 (10), 937-946 (2019).
  23. Luft, J. R., et al. The detection and subsequent volume optimization of biological nanocrystals. Structural Dynamics. 2 (4), 041710(2015).
  24. Lee, D. B., et al. Supersaturation-controlled microcrystallization and visualization analysis for serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 8 (1), 1-10 (2018).
  25. Kupitz, C., et al. Microcrystallization techniques for serial femtosecond crystallography using photosystem II from Thermosynechococcus elongatus as a model system. Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 369 (1647), 20130316(2014).
  26. Beale, J. H., et al. Successful sample preparation for serial crystallography experiments. Journal of Applied Crystallography. 52, Pt 6 1385-1396 (2019).
  27. Rayment, I. Small-scale batch crystallization of proteins revisited: An underutilized way to grow large protein crystals. Structure. 10 (2), 147-151 (2002).
  28. García-Ruiz, J. M. Nucleation of protein crystals. Journal of Structural Biology. 142 (1), 22-31 (2003).
  29. McPherson, A., Kuznetsov, Y. G. Mechanisms, kinetics, impurities and defects: Consequences in macromolecular crystallization. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 70 (4), 384-403 (2014).
  30. Rupp, B. Origin and use of crystallization phase diagrams. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 71, Pt 3 247-260 (2015).
  31. Luft, J. R., DeTitta, G. T. A method to produce microseed stock for use in the crystallization of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 55 (5), 988-993 (1999).
  32. Ireton, G. C., Stoddard, B. L. Microseed matrix screening to improve crystals of yeast cytosine deaminase. Acta crystallographica. Section D, Biological crystallography. 60 (3), 601-605 (2004).
  33. Forsythe, E. L., Maxwell, D. L., Pusey, M. Vapor diffusion, nucleation rates and the reservoir to crystallization volume ratio. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (10), 1601-1605 (2002).
  34. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Maeder, D. L., Blow, D. M. IUCr An automated system for micro-batch protein crystallization and screening. Journal of Applied Crystallography. 23 (4), 297-302 (1990).
  35. Chayen, N. E., Shaw Stewart, P. D., Blow, D. M. Microbatch crystallization under oil - a new technique allowing many small-volume crystallization trials. Journal of Crystal Growth. 122 (1-4), 176-180 (1992).
  36. Chayen, N. E. Comparative studies of protein crystallization by vapour-diffusion and microbatch techniques. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (1), 8-15 (1998).
  37. D'Arcy, A., Mac Sweeney, A., Stihle, M., Haber, A. The advantages of using a modified microbatch method for rapid screening of protein crystallization conditions. Acta Crystallographica - Section D Biological Crystallography. 59 (2), 396-399 (2003).
  38. Darmanin, C., et al. Protein crystal screening and characterization for serial femtosecond nanocrystallography. Scientific Reports. 6, 25345(2016).
  39. Gati, C., et al. Atomic structure of granulin determined from native nanocrystalline granulovirus using an X-ray free-electron laser. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2247-2252 (2017).
  40. Cheng, R. K. Y. Towards an optimal sample delivery method for serial crystallography at XFEL. Crystals. 10 (3), 215(2020).
  41. Schmidt, M. Mix and Inject: Reaction Initiation by Diffusion for Time-Resolved Macromolecular Crystallography. Advances in Condensed Matter Physics. 2013, 1-10 (2013).
  42. Oberthuer, D., et al. Double-flow focused liquid injector for efficient serial femtosecond crystallography. Scientific Reports. 7 (1), 44628(2017).
  43. McPherson, A., Gavira, J. A. Introduction to protein crystallization. Acta crystallographica. Section F, Structural biology communications. 70, Pt 1 2-20 (2014).
  44. Yaoi, M., et al. Effect of stirring method on protein crystallization. Japanese Journal of Applied Physics, Part 2: Letters. 43 (10), 1318(2004).
  45. Castro, F., Ferreira, A., Teixeira, J. J., Rocha, F. Influence of Mixing Intensity on Lysozyme Crystallization in a Meso Oscillatory Flow Reactor. Crystal Growth & Design. 18 (10), 5940-5946 (2018).
  46. Moews, P. C., Bunn, C. W. An X-ray crystallographic study of the rennin-like enzyme of Endothia parasitica. Journal of Molecular Biology. 54 (2), 395-397 (1970).
  47. Newman, J., et al. Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy. Acta crystallographica. Section D, Biological. 61, Pt 10 1426-1431 (2005).
  48. Ebrahim, A., et al. Resolving polymorphs and radiation-driven effects in microcrystals using fixed-target serial synchrotron crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 75, Pt 2 151-159 (2019).
  49. Davy, B., et al. Reducing sample consumption for serial crystallography using acoustic drop ejection. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (5), (2019).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kristal MorfolojisiBuhar Dif zyonuKesikli Kristalle tirmeMorfogram AnaliziPEG 6000Kristal TohumlamaHemositometre Say mX n K r n m

İlgili makaleler