Burada sunulan, protein ve mikro-RNA ekspresyonunun modüle etmek için küçük müdahaleci RNA (siRNA), mikro-RNA mimikleri (miRs) veya anti-mikro-RNA (anti-miR) gibi oligonükleotidleri olgun adipositlere ulaştırmak için bir protokoldür.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Protein ve Mikro-RNA Modülasyonunun Adipozit İşlevi Üzerindeki Etkisini Incelemek için Bir Adiposit Hücre Kültürü Modeli
Bu makalede
Özet
Özet
Adiposit fonksiyonunun değiştirilmesi Tip 2 diyabet ve insülin direnci de dahil olmak üzere metabolik hastalıkların patogenezine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksiyonunda yer alan moleküler mekanizmayı daha iyi anlama ihtiyacını vurgulamaktadır. Adipositlerde proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunun modülei son derece zorlu olmaya devam etmektedir. Bu makalede, murine fibroblastları olgun adipositlere ayırt etmek ve küçük müdahaleci RNA (siRNA) ve mikro RNA taklit (miR mimik) oligonükleotidler kullanarak ters transfeksiyon yoluyla olgun adipositlerdeki proteinlerin ve mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için bir protokol açıklanmaktadır. Bu ters transfeksiyon protokolü, olgun adipositlerin eklenme hücre kültürü plakasında bir kompleks oluşturmak için transfeksiyon reaktifinin ve oligonükleotidlerin inkübasyonunu içerir. Adipozitlerin daha sonra oligonükleotidler/ transfeksiyon reaktif kompleksinin varlığında yapışan plaka yüzeyine yeniden dikilmesine izin verilir. Protein veya mikro-RNA manipülasyonunun adiposit fonksiyonu üzerindeki etkisini incelemek için transfected 3T3-L1 olgun adipositler üzerinde insülin sinyali, glikoz alımı, lipogenez ve lipoliz çalışması gibi fonksiyonel analizler yapılabilir.
Giriş
Obezite, insülin direnci (IR), Tip 2 Diyabet (T2D) ve kardiyovasküler hastalıklar1dahil olmak üzere çok sayıda metabolik hastalık için önemli bir risk faktörü olarak kabul edilir. Mevcut tedaviler bu hastalıkların sürekli yükselen yaygınlığını durduramadı ve obez ve diyabetik hastaların IR'lerinin yönetimi önemli bir klinik konu olmaya devam ediyor. Yağ dokusu enerji homeostazının kontrolünde çok önemli bir rol oynar ve obezite sırasında patolojik genişlemesi IR ve T2D2,3gelişimine katkıda bulunur. Bu, obeziteye bağlı hastalıklara karşı yeni tedaviler geliştirmek için adiposit disfonksi....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
NOT: Protokolün tüm adımlarını laminer akış hücresi kültür başlığında gerçekleştirmek için steril teknikler kullanın. Tüm reaktifler ve ekipmanlar hakkında ayrıntılı bilgi için Malzeme Tablosu'nu görün.
1. Murine 3T3-L1 fibroblastlarının adipositlere farklılaştırılması
- 3T3-L1 fibroblastlarını kültür orta-DMEM'de 100 mm'lik yemeklerde piruvatsız, 25 mM glikoz, %10 yenidoğan baldır serumu ve %1 penisilin ve streptomisinin yetiştirin (Şekil 1A). Bulaşıkları bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin (%7 CO2 ve 37 °C).
- Birleşmesinden iki gün sonra, kültür ortamını deği....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
3T3-L1 adipositlerdeki proteinlerin veya mikro RNA'ların ekspresyonunu modüle etmek için burada açıklanan ters transfeksiyon prosedürünü kullanarak, adipositlerin transfeksiyondan sonra morfolojilerini korudukları gösterilmiştir (Şekil 1B,C). Gerçekten de, transfeksiyondan 2 gün sonra, adipositler iyi yayılmış ve plakaya tutturulmuş ve olgun 3T3-L1 adipositlerin bir özelliği olan çok damarlı lipit damlacıkları sunulmuştur. Lipid içeriği trans.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu makale olgun adipositlerin farklılaşması ve transfeksiyon için ayrıntılı bir protokol sunun. Bu ters transfeksiyon yöntemi, siRNA'lar, mikro RNA mimikleri ve anti-mikro-RNA'lar gibi oligonükleotidleri transfect etmek için basit, ekonomik ve son derece verimli bir yöntemdir. Bu yöntemin dikkate alınması gereken bazı sınırlamaları vardır. Bu protokol plazmid DNA ile transfeksiyon için verimli değildir, bu da fonksiyon kazancı çalışmaları için bu tekniğin yararını sınırlar. 3T3-L1 hücre hattı da dahil olmak üzere murin h.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma INSERM, Université Côte d'Azur ve Fransız Ulusal Araştırma Ajansı (ANR) tarafından gelecekteki Mükemmellik Laboratuvarı yatırımları (Labex SIGNALIFE-ANR-11-LABX-0028-01) ve Mükemmellik Girişimi (Idex UCAJEDI ANR-15-IDEX-0001) programı aracılığıyla desteklenmiştir. J.J., Société Francophone du Diabète (SFD), Association Française d'Etude et de Recherche sur l'Obésité (AFERO), Institut Thématique Multi-Organismes Technologies pour la Santé (ITMO) ve Fondation Benjamin-Delessert'in bağışlarıyla desteklenmektedir. J.G. ANR-18-CE14-0035-01 tarafından desteklenir. J-F.T., ANR hibesi ADIPOPIEZO-19-CE14-0029-01 ve Fondation pour la Recherche Médicale (Equipe FRM, D....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 12 kuyulu Doku Kültürü Plakası | Dutscher | 353043 | |
| %2.5 Tripsin (10x) | Gibco | 15090-046 | |
| 3-İzobutil-1-metilksantin | Sigma-Aldrich | D5879 | |
| Accell Hedeflemeyen Havuz | Horizon Keşfi | D-001910-10-05 | |
| Sığır Serumu Albümini (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Baldır derisinden kollajen tip I | Sigma-Aldrich | C8919 | |
| Deksametazon | Sigma-Aldrich | D1756 | |
| D-PBS | Gibco | 14190144 | |
| Dulbecco's Modifiye Eagles'ın Orta (DMEM) | Gibco | 41965062 | 4.5 g/L D-Glikoz; L-Glutamin; Piruvat |
| Etanol | Sigma | 51976 | |
| FAM etiketli Negatif Kontrol si-RNA | Invitrogen | AM4620 | |
| Fetal Sığır Serumu | Gibco | 10270-106 | |
| Serbest Gliserol Reaktifi | Sigma-Aldrich | F6428 | |
| Gliserol Standart | Çözelti Sigma-Aldrich | G7793 | |
| HSP90 antikoru | Santa Cruz | sc-131119 | Seyreltme: 0.5 & mikro; g/mL |
| Geliştirilmiş Minimal Esansiyel Orta (Opti-MEM) | Gibco | 31985-047 | |
| İnsülin, İnsan Rekombinant | Gibco | 12585-014 | |
| miRIDIAN mikro-RNA, | Horizon Discovery'yi | ||
| miRNeasy Mini Kit, | Qiagen | 217004 | |
| miScript II, RT Kiti | Qiagen | 218161 | |
| miScript Primer Tahliller Hs_RNU6-2_11 | Qiagen | MS00033740 | |
| miScript Primer Tahliller Mm_miR-34a_1 | Qiagen | MS00001428 | |
| miScript SYBR Yeşil PCR Kiti | Qiagen | 219073 | |
| Yenidoğan Buzağı Serumu | Gibco | 16010-159 | |
| Yağ Kırmızısı O | Sigma | O0625 | |
| ON-TARGETplus Fare Plin1 si-RNA SMARTpool | Horizon Keşif | L-056623-01-0005 | |
| Penisilin ve Streptomisin | Gibco | 15140-122 | |
| Perilipin-1 antikor | Hücre Sinyali | 3470 | Seyreltme : 1/1000 |
| Petri kabı 100 mm x 20 mm | Dutscher | 353003 | |
| PKB antikoru | Hücre Sinyali | 9272 | Seyreltme : 1/1000 |
| PKB Fosfo Thr308 antikor | Hücresi Sinyalizasyon | 9275 | Seyreltme: 1/1000 |
| Rosiglitazon | Sigma-Aldrich | R2408 | |
| Transfeksiyon reaktifi (INTERFERin) | Polyplus | 409-10 | |
| &alfa;-tubulin antikoru | Sigma aldrich | T6199 | Seyreltme: 0.5 &mikro; g/mL |
| Vamp2 antikoru | R& D Sistemleri | MAB5136 | Seyreltme : 0.1 & mikro; g/mL |
Kaynaklar
- Klöting, N., et al. Insulin-sensitive obesity. American Journal of Physiology, Endocrinology and Metabolism. 299 (3), 506-515 (2010).
- Weyer, C., Foley, J. E., Bogardus, C., Tataranni, P. A., Pratley, R. E.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
