Method Article

Fare Beyninin İşlevsel ve Anatomik Olarak Farklı Bölgelere Mikrodiseksiyonu

DOI:

10.3791/61941

⸱

February 15th, 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1The Geneva Foundation, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 2Walter Reed Army Institute of Research, Medical Readiness Systems Biology, Center for Military Psychiatry and Neuroscience, 3ORISE Fellow, Medical Readiness Systems Biology, Walter Reed Army Institute of Research, 4Headquarter, Walter Reed Army Institute of Research

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fare beyninin çıkarılması ve taze beyin dokusundan ayrı bölgelerin diseksiyonu için uygulamalı, adım adım, hızlı bir protokol sunuyoruz. Moleküler analiz için beyin bölgelerinin elde edilmesi birçok sinirbilim laboratuvarında rutin hale gelmiştir. Bu beyin bölgeleri, sistem seviyesi analizi için yüksek kaliteli transkriptomik veriler elde etmek için hemen dondurulur.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin, memeli sinir sisteminin komuta merkezi ve muazzam yapısal karmaşıklığa sahip bir organdır. Kafatasının içinde korunan beyin, serebral korteks olarak bilinen yarımküreler üzerindeki gri cevherin dış kaplamasından oluşur. Bu katmanın altında, varoluş için önemli olan çoklu fenomenler için gerekli olan birçok başka özel yapı bulunur. Belirli brüt beyin bölgelerinin örneklerini elde etmek, hızlı ve hassas diseksiyon adımları gerektirir. Mikroskobik düzeyde, birçok alt bölgenin var olduğu ve muhtemelen bu diseksiyonun amacı için dayattığımız keyfi bölgesel sınırları aştığı anlaşılmaktadır.

Fare modelleri, insan beyninin fonksiyonlarını ve hastalıklarını incelemek için rutin olarak kullanılır. Gen ekspresyon modellerindeki değişiklikler, hastalıklı duruma bağlı olarak belirli bir fenotipi hedef alan belirli beyin bölgeleriyle sınırlı olabilir. Bu nedenle, transkripsiyonun düzenlenmesini iyi tanımlanmış yapısal organizasyonu açısından incelemek büyük önem taşımaktadır. Beynin tam olarak anlaşılması, farklı beyin bölgelerini incelemeyi, bağlantıları tanımlamayı ve bu beyin bölgelerinin her birinin faaliyetlerindeki temel farklılıkları tanımlamayı gerektirir. Bu farklı bölgelerin her birinin daha kapsamlı bir şekilde anlaşılması, sinirbilim alanında yeni ve geliştirilmiş tedavilerin yolunu açabilir. Burada, fare beynini on altı farklı bölgeye ayırmak için adım adım bir metodolojiyi tartışıyoruz. Bu prosedürde, erkek fare C57Bl / 6J (6-8 haftalık) beyin çıkarılmasına ve nöroanatomik işaretleri kullanarak birden fazla bölgeye diseksiyonuna odaklandık. Bu çalışma, sinirbilim alanında güçlü bir temel oluşturmaya yardımcı olacak ve beyin fonksiyonunun daha derin anlaşılmasında daha odaklı yaklaşımlara yol açacaktır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin, omurilik ve retina ile birlikte, tüm vücutta uzmanlaşmış, hassas bir şekilde konumlandırılmış ve etkileşime giren hücre tipleri tarafından kontrol edilen karmaşık davranışları yürüten merkezi sinir sistemini içerir1. Beyin, milyarlarca birbirine bağlı nöron ve glia'nın sayısız işlevi yerine getiren hassas devrelere sahip karmaşık bir organdır. İki ayrı lob ve çeşitli hücresel bileşenlere sahip iki taraflı bir yapıdır2. Omurilik beyni dış dünyaya bağlar ve kemik, meninksler ve beyin omurilik sıvısı tarafından korunur ve mesajları beyne yönlendirir 2,3,4. Beynin yüzeyi, serebral korteks, düzensizdir ve gyri adı verilen farklı kıvrımlara ve beyni fonksiyonel merkezlere ayıran sulci adı verilen oluklara sahiptir5. Korteks, küçük bir beyne sahip memelilerde pürüzsüzdür 6,7. Farklı beyin bölgeleriyle ilgili bozuklukları ve fonksiyonel devrelerini anlamak için insan beyninin mimarisini karakterize etmek ve incelemek önemlidir. Sinirbilim araştırmaları son yıllarda genişlemiştir ve beynin yapısını ve işlevini incelemek için çeşitli deneysel yöntemler kullanılmaktadır. Moleküler ve sistem düzeyinde biyoloji alanlarındaki gelişmeler, beyin yapıları ile moleküllerin işleyişi arasındaki karmaşık ilişkiyi araştırmak için yeni bir çağ başlatmıştır. Ek olarak, moleküler biyoloji, genetik ve epigenetik hızla genişlemekte ve sistemlerin nasıl işlediğine dahil olan temel mekanizmalar hakkındaki bilgimizi geliştirmemizi sağlamaktadır. Bu analizler, daha etkili tedavilerin araştırılmasını ve geliştirilmesini hedeflemeye yardımcı olmak için çok daha lokalize bir temelde gerçekleştirilebilir.

Memeli beyni yapısal olarak açıkça tanımlanabilir ayrı bölgelere tanımlanır; Bununla birlikte, bu ayrık yapıların fonksiyonel ve moleküler karmaşıklıkları henüz net olarak anlaşılamamıştır. Beyin dokusunun çok boyutlu ve çok katmanlı doğası, bu manzaranın işlevsel düzeyde incelenmesini zorlaştırmaktadır. Ek olarak, birden fazla fonksiyonun aynı yapı tarafından yerine getirilmesi ve bunun tersi de beynin anlaşılmasını daha da zorlaştırmaktadır8. Beyin bölgelerinin yapısal ve fonksiyonel karakterizasyonu için yürütülen deneysel yaklaşımın, nöroanatomik mimariyi fonksiyonla ilişkilendirmek için örneklemede tutarlılık sağlamak için hassas araştırma metodolojileri kullanması hayati önem taşımaktadır. Beynin karmaşıklığı son zamanlarda, 75 farklıhücre tipinden oluşan insan beyninin temporal girusu gibi 9,10 tek hücreli dizileme kullanılarak açıklanmıştır. Bu verileri fare beyninin benzer bir bölgesinden gelenlerle karşılaştırarak, çalışma sadece mimarilerinde ve hücre tiplerinde benzerlikler ortaya koymakla kalmıyor, aynı zamanda farklılıkları da sunuyor. Bu nedenle, karmaşık mekanizmaları çözmek için, beynin çeşitli bölgelerini tam hassasiyetle incelemek önemlidir. Bir insan ve fare beyni arasındaki korunmuş yapılar ve işlevler, bir farenin insan beyninin işlevini ve davranışsal sonuçlarını aydınlatmak için bir ön vekil olarak kullanılmasını sağlar.

Sistem biyolojisi yaklaşımlarının ilerlemesiyle birlikte, kemirgenlerde ayrık beyin bölgelerinden bilgi elde etmek, sinirbilim araştırmalarında kilit bir prosedür haline gelmiştir. Lazer yakalama mikrodiseksiyonu12 gibi bazı protokoller pahalı olsa da, mekanik protokoller ucuzdur ve yaygın olarak bulunan araçlar kullanılarak gerçekleştirilir13,14. Transkriptomik tahliller için birden fazla beyin bölgesi kullandık15 ve fare beyninin ilgilendiği bölgeleri kısa sürede adım adım incelemek için uygulamalı ve hızlı bir prosedür geliştirdik. Disseke edildikten sonra, bu dokulardaki nükleik asitleri ve proteinleri korumak için bu numuneler hemen soğuk koşullarda saklanabilir. Yaklaşımımız daha hızlı gerçekleştirilebilir, bu da yüksek verimliliğe yol açar ve doku bozulması için daha az şans sağlar. Bu sonuçta, beyin dokularını kullanarak yüksek kaliteli, tekrarlanabilir deneyler üretme şansını arttırır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvan elleçleme ve deneysel prosedürler, hayvan bakımı için Avrupa, ulusal ve kurumsal kılavuzlara uygun olarak yürütülmüştür. Tüm hayvan deneyleri, ABD Ordusu Çevre Sağlığı Araştırma Merkezi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı ve şimdi Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü (WRAIR) tarafından onaylandı ve Uluslararası Laboratuvar Hayvan Bakımı Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) tarafından akredite edilmiş bir tesiste gerçekleştirildi.
NOT: Prosedür, servikal çıkık16 ile ötenazi yapılan C57BL / 6j suşunun altı ila sekiz haftalık erkek fareleri üzerinde gerçekleştirilecektir. Laboratuvarımızda perfüzyon yapılmamaktadır, ancak bu protokol vaskülatürden kanı temizlemek için perfüzyonların yapılabileceği şekilde modifiye edilebilir. Diseksiyon için gerekli tüm malzemeler Malzeme Tablosunda listelenmiştir. Diseksiyon, beynin çıkarılması, hipofiz bezinin çıkarılması ve beyin diseksiyonu dahil olmak üzere üç bileşene ayrılır. Beyin dokusu toplamanın amacı, RNA ekstraksiyonlarını takiben transkriptomik testler için bunları işlemektir. Beyin bölgesi diseke edilir edilmez, beyin bölgelerinin her birini derhal önceden etiketlenmiş bir dondurucu şişesine aktarırız ve daha sonra şişeyi sıvı azot veya -80 ° C'de depolarız.
NOT: Bu prosedürü gerçekleştirmek için nöroanatomi hakkında kapsamlı bilgi gereklidir. Yatay ve uzunlamasına bölümlerin yanı sıra normal enine kesitler de incelenmeli ve öğrenilmelidir. Beyin dokusu çok hızlı bir şekilde bozunduğundan, bu prosedürü uygularken bir atlasa danışmak için zaman yoktur.

1. Fare Beyninin Çıkarılması

  1. Kafası kesilmiş başın maksillasını bir hemostatla kelepçeleyin (Şekil 2i) ve kafa derisini rostral olarak yansıtmak için bir gazlı bez pedi kullanın ve kafatasının dorsumunda kuru bir alan oluşturun (Şekil 2ii).
  2. İnce kavisli makasları, yapışan meninksleri ayırmak için foramen magnumuna yerleştirin. Burada, makası kafatasının tabanındaki açıklığa yerleştirin, omuriliğin dikey olarak (saat 12 pozisyonunda) bıçakla geçtiği, ancak bazal plaka kemiğinin iç yüzeyine (yani oksipital squama) paralel ve bastırdığı ve bıçağı kırk beş ° sol tarafa ve daha sonra sağ tarafa döndürdüğü foramen magnumdur.
  3. Oksipital kemiğe devam eden kalan kemiğin ortasını kesecek bazal plaka kemiğini ve kemikleri çıkarılana kadar sola ve sağa meraklı intraparietal kemikleri kesmek için bileği döndürmeye devam edin. Benzer şekilde, beyinciği açığa çıkarmak için oksipital kemiği ve intraparietal kemiği çıkarın.
    NOT: Bu noktada, kafatasının orta ve iç kulağın kısımlarını çevreleyen ventral posterior kısmında, timpanik bullae adı verilen içi boş kemikli yapı, hipofizlerin arka ve ön lobları diseke edilmediği sürece çıkarılabilir (Şekil 2iii).
  4. Kavisli keskin bir makas bıçağı kullanarak zamansal sırttaki kas ataşmanlarını çıkarın. Kavisli keskin makasın bir uzvunu enine ve sagital sinüslerin birleşme noktasına nüfuz eden lambdoid sütür altına yerleştirin (Şekil 2iv).
  5. Makası midsagital sütür boyunca rostral olarak bregmaya kadar ilerletin ve serebral kortekslerin yırtılmasını önlemek için dikkatlice yukarı doğru kaldırırken çok nazikçe kesin. Bu, prosedürde kritik bir adımdır (Şekil 2v).
  6. Bu adımda, parietal kemikler kaldırılır ve döndürülür, böylece kalan meningeal ataşmanları tanımlamak ve kesmek için kemiğin iç yüzeyi kazınır. Temporal kemiği dışa doğru meraklı bir şekilde, beyinden uzakta kavrayın. Ön kemiği her iki taraftan kavisli makas veya bir rongeur kullanarak yörüngeye çıkarın ve yörünge sırtına dik açıyla koronal olarak kesin, ancak orta çizgiden daha fazla değil (Şekil 2vii).
  7. Sagital düzlemde paralel ve yaklaşık 4 mm aralıklarla iki kesim yapın (Şekil 2viii).
    NOT: Her iki tarafı da tek bir vuruşla kesmeyin.
  8. Beyin yüzeyinin yırtılmasından kaçınarak frontal kemiğin parçalarını çıkarın (Şekil 2ix). Bu noktada, koku alma ampulleri arasında erişilebilir olması gereken dura mater'i kesmek için ince bir makas kullanın.
  9. Yerçekiminin beynin çıkarılmasına yardımcı olmasına izin vermek için kafatasını yavaşça ters çevirin, kalan meningeal ekleri ve kraniyal sinirleri tanımlamaya ve kesmeye devam edin. Beyin, beyne bağlı en büyük trigeminal sinir kesilerek serbest bırakılır ve kalvaryum tabanından uzanan açıkça görülebilir (Şekil 2x).
    NOT: Daha fazla diseksiyon için beyni soğuk bir salin çözeltisine (buz gibi soğuk RNaz içermeyen sodyum sitrat (% 0.9) veya fizyolojik (% 0.9) salin) aktarın.

2. Ön ve Arka Hipofizlerin Diseksiyonu

NOT: Hipofiz bezleri, sol ve sağ trigeminal sinirler arasında yanal olarak uzanan bir sırt ile çok sert bir çadır benzeri zarla kaplıdır. Bu yapılar son derece yumuşak ve hassastır ve bu nedenle, hipofiz bezlerinin arka ve ön loblarının doğrudan kafatasından ayrı aşamalarda, in situ olarak diseke edilmesi önerilir. Diseksiyondan hemen sonra, ilgili hipofiz bezini önceden etiketlenmiş bir şişeye aktarın ve şişeyi tercihen -80 ° C'de sıvı azotta saklayın. Hipofiz bezi tam olarak oksipital ve bazfenoid kemiklerin birleşme noktasına dayanır; eğer esnerlerse, hipofiz mimarisi bozulur.

  1. Hipofiz anatomisinin sağlam ve kolayca tanımlanabildiğinden emin olmak için işitsel bülleri sağlam tutun (Şekil 2ix).
  2. Hipofizin arka lobunu ve ardından hipofizin ön lobunu kafatasının geri kalanından diseke edin.
  3. Membranöz çadırın sırtında her iki tarafta son derece küçük bir parasagital kesim yapın ve ön hipofiz dokusunu bozmamaya özen göstererek hipofizin arka lobunu ultra ince forseps ile kaldırın (Şekil 2x).
  4. Hipofiz ön lobunun lateral kenarları ile en yakın trigeminal sinir arasında sagital bir kesim yapın ve bundan sonra hipofizin ön lobunu kaldırın (Şekil 2x).

3. Fare Beyin Diseksiyonu

NOT: Beyin ve hipofiz çıkarılmasından hemen sonra, önceden soğutulmuş paslanmaz çelik bir blok üzerinde daha fazla diseksiyon yapılır (Şekil 3). Diseksiyon sonrası, beyin bölgelerini önceden etiketlenmiş şişelere aktarın ve şişeleri tercihen sıvı nitrojene aktarın, aksi takdirde -80 ° C. Yukarıdan aşağıya yöntemle (kronolojik sırayla) üretilen yapılar potansiyel olarak şunları içerir: beyincik (CB), beyin sapı / arka beyin (pons ve medulla oblongata) (HB), aksesuar koku alma ampulleri olarak koku alma ampulleri (OB), medial prefrontal korteks (MPFC), lateral prefrontal korteks (FCX), anterior ve posterior korpus triatum (ST), çekirdek akümülatörlerinden (NAC) ve koku tüberkülünden (OT) oluşan ventral striatum (VS), septum (SE), preoptik alan, piriform korteks (PFM), hipotalamus (HY), amigdala (AY), hipokampus (HC), posterior singulat korteks (CNG), entorinal korteks (ERC), talamuslu orta beyin (MB) ve serebral korteksin geri kalanı (ROC) (Tablo 1). Belirli bölgeler, tek bir yarımküre ile çalışan izolasyon sırasına göre tartışılacaktır.

  1. Beyni kalvaryumdan çıkarmaya büyük özen gösterin, çünkü herhangi bir yırtılma olması durumunda yer işaretleri tahrip olabilir. Bu adımda, yüz koruma, özellikle de 7x kuyumcu vizörü kullanarak tüm diseksiyonları gerçekleştirin ve aydınlatma, dissektörün omuzlarının her birinin üzerine yerleştirilmiş cerrahi lambalarla sağlanacaktır. Diseksiyonun çoğu künt modlu küçük kavisli forseps (yani Graefe forseps) kullanılarak gerçekleştirilecektir.
  2. Beyni paslanmaz çelik bir blok üzerine yerleştirin (Şekil 4i ve Şekil 4ii). Bloğu buz ve buz gibi soğuk bir tuzlu su çözeltisi ile çevreleyerek soğuk tutun. Yapıları korumak için dokuyu periyodik olarak buz gibi soğuk tuzlu su çözeltisi ile nemlendirin.
  3. Beyni, serebral korteksler yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Küçük kavisli forseps kullanarak, üst, orta ve alt serebellar pedinkülleri açığa çıkararak CB'yi nazikçe yansıtın ve CB'yi çıkarın (Şekil 4iii ve Şekil 4iv).
  4. Dorsumdan başlayarak ve OB ile serebral hemisferler arasında (Şekil 4v) orta sagital bir kesim yapın ve anterior komissürden daha uzağa uzanmadığınızdan emin olun. Bu noktada, vermis lateral kısımlardan kolayca ayrılabilir ve HB , ponsun ön kenarındaki koronal bir kesim ile elde edilir.
  5. Medullayı, ponsun arka kenarındaki koronal bir kesimle ayırın.
    NOT: Bu noktada, epitalamus, talamus, hipotalamus ve ventral talamus ile üçüncü ventrikülü içeren ön beynin arka kısmı olan diensefalon, ventral tarafı yukarı doğru çevirecek ve optik kiazmdan rostral olarak orta sagital bir kesim yapılacaktır. Serebral hemisferlerin diseksiyonu ve ardından OB'nin yarımkürelerden birinden çıkarılması bu aşamada olacaktır (Şekil 4v ve Şekil 4vi).
  6. Diensefalonu daha fazla diseke etmeden önce serebral hemisferleri ayırın (Şekil 4v). Dorsal yaklaşım, kritik olarak göze çarpan orta hat yer işaretlerini korumak için dikkatli künt diseksiyon ile kullanılacaktır. Her hemisferik bağlantıyı kesmeden önce görselleştirin, çünkü bu orta hattan sapma olasılığını en aza indirecektir.
    NOT: Bu adımda serebral yarımküreden biri (Hemibrain) korunabilir ve ikinci yarımküre daha ileri diseksiyon için kullanılabilir.
  7. Korpus kallozumun altındaki küçük, kavisli forsepslerin kapalı bıçaklarını kaydırın ve neokorteksi iki taraflı olarak geri çekmek için yavaşça yayın. Korpus kallozum, iki yarımküreyi birleştiren, forsepslerle kıstırılarak altta yatan orta hat yapılarını bozmadan açıkça diseke edilecek geniş bir sinir lifi bandıdır.
    NOT: Yarımkürelerin mesial yüzleri, korpus kallozumun cinsi, fornices ve anterior komissür gibi miyelinli yapılar gibi görülebilen birden fazla işarete sahip olacaktır. Ayrıca, orta hatta birkaç milimetre yanal olmasına rağmen, mammillothalamik sistem ve fasciculus retroflexus da görülebilir.
  8. Orta çizgiyi geçen çoklu yapıları ikiye bölün. Buna korpus kallozum, anterior komissür, ventral forniks komissure, posterior komissür, dorsal fornix komissure, supra mammillary decussation, superior colliculus commissure, ventral fornix komissure, ve periventriküler talamiks lifleri dahil olacaktır.
  9. Dorsal yaklaşım yöntemiyle kısmen tehlikeye girebilecek orta hattın içinde veya yakınında bu adımda özel dikkat gösterin. Tüm takip yapıları dikkatli yapılmadığı takdirde risk altındadır.
  10. OB (kama şeklinde ve daha açık renkte) ve aksesuar koku alma ampullerini çıkarın, ardından MPFC (singulat korteks alanı 1, prelimbik, infralimbik, medial orbital ve sekonder motor korteksler [M2]) ve FCX'in toplanması, korpus kallozumun cinsine 1 mm ön tarafta yapılan bir koronal kesimle (Şekil 4vii). Elde edilen bölümü, medialden lateral yüzeye olan mesafenin 1 / 3'ünü parasagital bir kesimle bölün, medial olarak MPFC ve yanal olarak FCX'in geri kalanını verin. Singulat korteks, MPFC'nin fare analoğudur.
    NOT: Bu doku dilimi ayrıca az miktarda M2 (ikincil motor korteks) 17 içerecektir ve kaçınılmazdır.
  11. Ortaya çıkan koronal bölümün rostral yüzündeki enine kesitte anterior komissürün pars anterior ekstremitesinin görünürlüğüne yol açan anterior komissür seviyesinde koronal bir kesim yapın, oysa enine kısım bölümün kaudal yüzünde ortaya çıkacaktır Bu NAC18 için doğrulayıcı bir dönüm noktasıdır. VS , NAC ve OT'den oluşur.
    NOT: Anterior komissürde transvers segmente ek olarak bir anterior ekstremite vardır ve buna anterior komissür, pars anterior denir.
  12. Septal çekirdeği dorsal ve VS ventralli serbest bırakmak için lateral ventrikülün ön boynuzunun altındaki orta hattan anterior komissürün enine kısmından yatay olarak kısmen kesin. Korteksin az miktarını , NAC ve OT'nin çıkarılacağı lateral yüzeyden çıkarın.
  13. ST'nin rostral kısmını, kortikal numuneye striatal doku dahil etmemeye dikkat ederek, dış kapsülün hemen dışında kesilmiş kavisli neşter yoluyla üstteki korteksten ayırın. Bu noktada septal çekirdek/SE görünür olacak ve bu dilimden kolayca alınabilecektir (Şekil 4viii).
    NOT: PFM'nin anterior ve posterior sınırları, sırasıyla anterior komissür ve mammillary cisimlerle uyumlu hayali koronal düzlemler ile tanımlanır. Medial sınır, eksternal kapsül18 tarafından tanımlanır.
  14. Diensefalonun kalan hemi bölümünün lateral yüzeyinde, kaudal olarak uzanan rinal sulkus boyunca kısmi yatay bir kesim yapın, ancak sadece mammillary cisimlerle hayali koronal düzlem seviyesine kadar. HY'nin memeli cisimlerinin düzleminde lateral kortikal yüzeyden medial olarak 1 mm uzanan kısmi bir koronal kesim yapın. Burada, klostrum düzlemindeki para-sagital insizyon PFM'yi serbest bırakacaktır (Şekil 4ix ve Şekil 4x).
    NOT: Diensefalonun kalan hemi bölümünün medial yüzeyinde, mammillary cisimler, fasciculus retroflexus ve stria medullaris dahil olmak üzere çok sayıda anatomik özellik görülecektir. Talamus ve HY arasındaki boşluğu gösteren yarım daire biçimli bir desen (dorsal içbükey taraf) görünecektir. HY, optik kiazm başına midsagital kesit görünümünde, anteroodoral olarak anteroodoral olarak ve anterikülus retrofleksusla birlikte mammillary cisimlerde posterioral olarak kolayca tanımlanacaktır. İkinci işaretler atlas17'de ve albino fare ön beyin bağlamı19'da iyi bir şekilde gösterilmiştir.
  15. Memeli cisimlerin posteriorunda kısmi bir koronal kesim yapın, sadece hipotalamik sulkus kadar lateral olarak uzanır. Bu noktada, hipotalamik sulkusun uzunluğu boyunca bir parasagital kesim şimdi HY'yi serbest bırakır.
  16. Ek limbik içi bağlantıları ve kalan limbik sistem bileşenlerini ortaya çıkarmak için lateral ventrikülün eversiyonunu gerektirir. Diensefalonun kalan hemi bölümünün medial yüzünü görüntüleyerek, kavisli forsepsler, teknisyenin forniksi kesmek için kullanılan çevredeki diğer hassas bölümlerin etrafında manipüle etmesine izin verdiği ve lateral ventriküle yerleştirildiği ve nazikçe genişlediği, ventrikülü açmak ve HC'yi döndürmek için künt diseksiyon kullanılarak en iyi seçenek olacaktır. Dikeyden yatay düzleme 90°. Koroidal arter / koroid pleksusunu kesmek için #11 bıçağının kullanılması gerekebilir, çünkü sivri uçlu uç hassas kesimlere yardımcı olabilir.
  17. CNG'yi yatay düzlemde olacak şekilde 90° döndürün (ancak HC'den ters yönde). Forseps kullanarak, HC'yi yavaşça 180 ° dışa ve yanal olarak döndürün, bu da ERC'nin iç yüzeyini görünür ve yukarı bakacak hale getirecektir.
  18. ERC'den kaynaklanan miyelinli liflerin fan benzeri bir radyasyonu , perforan yol ve HC'ye bağlanması da dahil olmak üzere açısal demetleri oluşturmak için yakınsama görecektir. Talamus ve MB 180°'yi dorsal olarak döndürerek AY'yi ventralal olarak ortaya çıkarın.
  19. Gerekirse, talamusun ventriküler yüzeyinin lateral kenarı boyunca AY'ye uzanan lif bantları içereceğinden stria terminalisin bağlantısını ortaya çıkarmak için optik yolu kaldırın ve AY'nin ana hatlarını netleştirecektir.
    NOT: HC ve forniks, lateral ventriküle yuvalanmış ve kolayca kaldırılabilen, bütünüyle açıkça görülebilecektir. Lateral ventrikül pia mater ile kaplanacak ve ERC'nin çok şeffaf subpial yönü boyunca perforant yolun fan benzeri kökenleri görünür olacaktır20.
  20. Medial ERC'nin dış yüzeyi , büyük piramidal hücrelerin görünür belirgin bir tabakasına sahip olacaktır. Ek olarak, Golgi boyama liflerinin yoğun bir yakınsaması, medial ERC'de göze çarpan bir özellik olacaktır. Bu diseksiyon prosedüründe, lateral ventrikül kesildikten sonra, bu lifler, ventriküllerin iç yüzeylerini kaplayan ve çok belirgin bir fan benzeri yapı oluşturan pia mater yoluyla medial yüzeyde kolayca görülebilecektir.
  21. Liflerin subpial olarak toplandığına, ventral ERC'ye inip ayrıldığına, posteriora uzandığına ve daha sonra HC'yi delmek için dikey olarak yükseldiğine dikkat edin. ERC'deki bu fan benzeri yapı , diseksiyon amacıyla kenar boşluklarını tanımlamak için kullanılacaktır. AY, ERC, CNG ve HC yapılarının sırasına göre tanımlayın ve kaldırın.
    NOT: AY diseksiyonu için iyi bir dönüm noktası tanımlamak, bir sonraki adım için bir anahtar olacaktır ve stria terminalinin AY ile buluştuğu arka kenardaki kavşak iyi bir nokta olacaktır.
  22. Bu noktada, kalan yapılar talamus ve MB'yi içerir. Orta hat rostrokaudal düzlemde uzanan dorsal yüzeyinde stria medullarisin görselleştirilmesiyle talamusun tanımlandığını doğrulayın. Talamus'u orta beyinden tamamen bir koronal kesim kaudal ile habenula'ya ve rostral'dan superior kolliküllere ayırın. ROC bu adımda kaydedilir.
  23. Bu noktada, tüm beyin bölgelerinin tam olarak toplanması ve derhal (her biri elde edildiğinden) numunelerin daha sonraki işlemlere kadar dondurulmuş olarak saklanması.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Karmaşık beyin yapısı ve işlevi hakkındaki anlayışımız hızla gelişiyor ve gelişiyor. Beyin birden fazla farklı bölge içerir ve moleküler bir harita oluşturmak, beynin nasıl çalıştığını daha iyi anlamamıza yardımcı olabilir. Bu yöntem yazısında, fare beyninin birden fazla farklı bölgeye diseksiyonunu tartıştık (Tablo 1). Bu protokolde, yapılar kritik noktalara göre tanımlanır ve derhal diseksiyon için sağlamlığını koruyarak dokunun tuzlu su çözeltisi ile nemli tutulmasıyla elde edilir. Yöntem, diğer rapor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Memeli beyni, çeşitli moleküler imzalara ve uzmanlaşmış ve ayrık işlevleri yerine getiren çoklu bölgelere sahip bir dizi morfolojik olarak farklı ve işlevsel olarak benzersiz hücrelerden oluşan karmaşık bir organdır. Burada bildirilen diseksiyon prosedürü, laboratuvarın gereksinimlerine bağlı olarak birden fazla hedefe sahip olabilir. Laboratuvarımızda stres gibi TSSB'ye maruz kalan farelerden toplanan çoklu beyin bölgelerinde transkripsiyonu değerlendirdik16 . Suş genetik arka planı

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneysel yardımları için Bayan Seshmalini Srinivasan, Bay Stephen Butler ve Bayan Pamela Spellman'a ve el yazmasını düzenledikleri için Bayan Dana Youssef'e teşekkür ederiz. USAMRDC'nin finansman desteği minnetle kabul edilmektedir. Cenevre Vakfı bu çalışmaya katkıda bulundu ve ABD Ordusu Araştırma Ofisi aracılığıyla Askeri ve Operasyonel Tıp Araştırma Alanı Müdürlüğü III'ten gelen fonlarla desteklendi.

Feragatname:

Materyaller Walter Reed Ordu Araştırma Enstitüsü tarafından gözden geçirilmiştir. Sunumuna ve/veya yayınlanmasına itiraz yoktur. Burada yer alan görüşler veya iddialar yazarın özel görüşleridir ve resmi olarak veya Ordu Bakanlığı veya Savunma Bakanlığı'nın gerçek görüşlerini yansıttığı şeklinde yorumlanmamalıdır. Araştırma, Hayvan Refahı Yasası ve hayvanları içeren hayvanlar ve deneylerle ilgili diğer federal tüzük ve yönetmeliklere uygun olarak AAALAC onaylı bir tesiste onaylanmış bir hayvan kullanım protokolü kapsamında yürütülmüştür ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu, NRC Yayını, 2011 baskısında belirtilen ilkelere uygundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Beyin Kaldırma
Deaver makasıRoboz Cerrahi MağazasıRS-67625.5" düz keskin/keskin
Deaver makasıRoboz Cerrahi MağazasıRS-67635.5" kavisli keskin/keskin
Hassas ameliyat makasıRoboz Cerrahi MağazasıRS-67034.75" kavisli keskin/keskin
Hassas ameliyat makasıRoboz Cerrahi MağazaRS-67024.75" düz keskin/keskin
Hafif ameliyat makasıRoboz Cerrahi MağazaRS-67535" kavisli Keskin/Keskin
Mikro spatula, yarıçap ve konik düz uçlarpaslanmaz çelik ayna kaplaması
Ameliyat makası 6.5"Roboz Cerrahi MağazaRS-6846kavisli keskin/keskin
Doku forsepsRoboz Cerrahi MağazaRS-81604.5 "1X2 diş 2mm uç genişliği
Rongeur (isteğe bağlı)Roboz Cerrahi MağazaRS-8321 seçmek için birçok stilLempert Rongeur 6.5 "2X8mm
Hipofiz Diseksiyonu< / güçlü>
Neşter sapıRoboz Cerrahi MağazaRS-9843Neşter Sapı #3 Katı 4"
ve bıçaklarRoboz Cerrahi MağazaRS-9801-11Steril Neşter Bıçakları: # 11 Kutu 100 40mm
Süper ince forseps InoxRoboz Cerrahi MağazaRS-4955uç boyutu 0.025 X 0.005 mm
< güçlü > Beyin Diseksiyonu < / güçlü >
A büyütme vizörüPenn Tool Col40-178-62.2x Dış ve 3.3x İç Lens Büyütme, Dikdörtgen Büyüteç
Diseksiyon soğuk plakaCellpath.comJRI-0100-00ABuzdağı soğuk plaka ve taban
Graefe forseps, tam eğri ekstra hassasRoboz Cerrahi MağazaRS-51380.5 mm Tip 4 " (10 cm) uzunluğunda
Hafif ameliyat makasıRoboz Cerrahi MağazaRS-67535" kavisli keskin/keskin
Neşter sapıRoboz Cerrahi MağazaRS-9843 (yukarıda tekrarlandı)Neşter Sapı #3 Katı 4"
ve bıçaklar (özellikle #11)Roboz Cerrahi MağazaRS-9801-11 (yukarıda tekrarlandı)Steril Neşter Bıçakları:#11 Kutu 100 40mm
SpatulaAmazonMS-SQRD9-4Çift Uçlu Spatula Kare VE Yuvarlak Uçlu
Doku forsepsRoboz Cerrahi MağazasıRS-8160 (yukarıda tekrarlandı)4.5" 1X2 dişler

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zeisel, A., et al. Molecular Architecture of the Mouse Nervous System. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
  2. Ackerman, S. Major Structures and Functions of the Brain. 2, National Academies Press. US. (1992).
  3. P, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
  4. Paramvir, T. L. S. StatPearls. , StatPearls Publishing. (2019).
  5. Javed, K., Reddy, V., et al. Neuroanatomy, Cerebral Cortex. , Treasure Island. (2020).
  6. Rakic, P. Evolution of the neocortex: a perspective from developmental biology. Nature Reviews Neuroscience. 10 (10), 724-735 (2009).
  7. Fernández, V., Llinares-Benadero, C., Borrell, V. Cerebral cortex expansion and folding: what have we learned. The EMBO Journal. 35 (10), 1021-1044 (2016).
  8. Pessoa, L. Understanding brain networks and brain organization. Physics of Life Reviews. 11 (3), 400-435 (2014).
  9. Mu, Q., Chen, Y., Wang, J. Deciphering Brain Complexity Using Single-cell Sequencing. Genomics, Proteomics & Bioinformatics. 17 (4), 344-366 (2019).
  10. Darmanis, S., et al. A survey of human brain transcriptome diversity at the single cell level. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (23), 7285-7290 (2015).
  11. Hodge, R. D., et al. Conserved cell types with divergent features in human versus mouse cortex. Nature. 573 (7772), 61-68 (2019).
  12. Winrow, C. J., et al. Refined anatomical isolation of functional sleep circuits exhibits distinctive regional and circadian gene transcriptional profiles. Brain Research. 1271, 1-17 (2009).
  13. Atkins, N., Miller, C. M., Owens, J. R., Turek, F. W. Non-Laser Capture Microscopy Approach for the Microdissection of Discrete Mouse Brain Regions for Total RNA Isolation and Downstream Next-Generation Sequencing and Gene Expression Profiling. Journal of Visualized Experiments. (57), e3125(2011).
  14. Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).
  15. Muhie, S., et al. Brain transcriptome profiles in mouse model simulating features of post-traumatic stress disorder. Molecular Brain. 8, 14(2015).
  16. Hammamieh, R., et al. Murine model of repeated exposures to conspecific trained aggressors simulates features of post-traumatic stress disorder. Behavioural Brain Research. 235 (1), 55-66 (2012).
  17. Paxinos, G., Franklin, K. B. J. The mouse brain in stereotaxic coordinates. Compact 3rd edn. , Elsevier Academic Press. (2008).
  18. Franklin, K., Paxinos, G. The Coronal Plates and Diagrams. , Academic Press. (2019).
  19. Slotnick, B. M., Leonard, C. M. Stereotaxic atlas of the albino mouse forebrain. Rockville, MD, Alcohol, Drug Abuse and Mental Health Administration, 1975. Annals of Neurology. 10 (4), 403-403 (1981).
  20. Cajal, S. R., Swanson, N., Swanson, L. W. Histologie Du Système Nerveux de L'homme Et Des Vertébrés. Anglais. , Oxford University Press. (1995).
  21. Spijker, S. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuromethods. 57, 13-26 (2011).
  22. Wager-Miller, J., Murphy Green, M., Shafique, H., Mackie, K. Collection of Frozen Rodent Brain Regions for Downstream Analyses. Journal of Visualized Experiments. (158), e60474(2020).
  23. Sultan, F. A. Dissection of Different Areas from Mouse Hippocampus. Bio Protocols. 3 (21), (2013).
  24. Chakraborty, N., et al. Gene and stress history interplay in emergence of PTSD-like features. Behavioural Brain Research. 292, 266-277 (2015).
  25. Chiu, K., Lau, W. M., Lau, H. T., So, K. -F., Chang, R. C. -C. Micro-dissection of rat brain for RNA or protein extraction from specific brain region. Journal of Visualized Experiments. (7), (2007).
  26. Rajmohan, V., Mohandas, E. The limbic system. Indian Journal of Psychiatry. 49 (2), 132-139 (2007).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Mouse Brain DissectionBrain Region IsolationNeuroanatomical LandmarksCerebral Cortex RemovalCerebellum DissectionHypothalamus SeparationThalamus IsolationAmygdala ExtractionHippocampus DissectionSeptal Nuclei Identification

Related Articles