Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

İşitme kaybı doğuştan ortaya çıkabilir veya yaşlanma, ilaçlar ve gürültü de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden giderek kaynaklanabilir. İşitme kaybı genellikle tedavi etmek zordur, çünkü işitmeden sorumlu saç hücreleri hasar gördükten sonra bozulmuş işlevi geri yüklemek çok zordur¹

ICR farelerini içeren tüm araştırma protokolleri Wonju Tıp Fakültesi'ndeki Yonsei Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları'na göre gerçekleştirildi. Bu protokolde, hamile ICR fareleri yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık bir döngüde tutuldu.

1. Koklea diseksiyonu

1. Ultraviyole ışığını ~30 dakika açarak laminer akış dokusu kültür davlumbazını sterilize edin ve kullanmadan önce tüm yüzeyleri% 70 etanol ile püskürtün. Yüzeylerin kurumasını bekleyin.
2. Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca% 70 etanol içine yerleştirin ve kullanmadan önce kurutun.
3. Doğum sonrası 3-4 günlük farelerin kafasını kesmek için bir çalışma bıçağı kullanın (Şekil 2A).
4. Kafatasını laminer akış başlığına bir stereomikroskopun altına yerleştirin ve dokuyu% 70 etanol içine batırın.
5. Etanol çıkarmak için dokuyu doku diseksiyon çözeltisine (1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1 mM HEPES) hızlı bir şekilde batırın.
6. Kafatasının orta çizgisini cerrahi bir bıçakla kesin (Şekil 2B,C).
7. Cildi ön olarak aşağı çekerek ve kulağın dış işitsel kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın (Şekil 2D).
8. Ön kısımdan kafatasının arka kısmına göz çizgisi boyunca kesin (Şekil 2E).
9. Kafatasını açın ve künt forps ile beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın (Şekil 2F,G).
10. Mikro kümes uçlarını kullanarak kokleayı temporal kemikten ayırın (Şekil 2H).
11. Kokleayı doku diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
12. Koklear otik kapsülün tümünü dikkatlice parçalara ayırın, sadece iç koklear yumuşak doku bırakın(Şekil 2I,J).
13. Kokleanın modiolularını başka bir çift asa ile kümes ve koklear kanal ile tutun ve iki dokuyu yavaşça ayırın (Şekil 2K).
14. Stria vascularis ve tectorial membranları nazikçe soyup çıkararak çıkarın (Şekil 2L,M).
15. Sterilize edilmiş bir plastik kapak kapağını yeni doku diseksiyon çözeltisine yerleştirin ve ardından Basilar zarının aşağı doğru yüzleştiğinden emin olarak Corti organını 9 mm çapında bir kapak kapağına yerleştirin (Şekil 2N-P).
16. Reissner'ın zarını ve kalan modiolus dokusunups ile kapak kılıfına bastırarak dokuyu hareketsiz hale verin (Şekil 2N-P).
17. Gömülü doku ile kapak sapını 35 mm çapındaki bir konfokal kabın ortasına aktarın.
18. Cam klonlama silindirini, koklear eksplant ile çanağın ortasına yerleştirin ve silindirin içine 100 μL eksizyon kültürü ortamı (DMEM / F12,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 N2 takviyesi, ampisilin (10 μg / mL))¹⁰ ekleyin (Şekil 2Q).
19. Plaka 5 ×^{10 3} hücre fare kemiği iliği türevi yeşil floresan protein (GFP)-etiketli MSC'ler 2 mL kültür ortamında (E DMEM + E DMEM/F12, FBS, %1 N2 takviyesi, 10 μg/mL ampisilin) cam silindirin dışında (Şekil 2R).
    1. MSC'ler % 80-90 birleştiğinde, tripin-etilenediamin tetraasetik asit ile ayırarak bunları geçiştirin.
20. Konfokal kabı dikkatlice nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın ve % 5 CO₂ atmosferinde 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
21. Silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamı aspire edin ve ardından cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.
22. Konfokal yemeğe 2 mL taze kültür ortamı ekleyin ve doku kültürü çanağini analize hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.

Şekil 2. Bir fare kokleasının diseksiyonu ve Corti ve MSC organlarının kokültürü. (A) Farenin kafasının kesilmesi, (B) ve (C) başın orta çizgi sagittal diseksiyonu, (D) ve (E) beynin koronal diseksiyonu, (F) ve (G) beyin ve temporal kemiğin çıkarılması, (H) koklea, (I) kemik koklear duvarının çıkarılması, (J) koklear kanalın modiolustan ayrılması, (L) stria vascularis (SV) ve spiral ligamentin (SL) Corti'nin organından ayrılması, (M) tectorial membranının çıkarılması, (N-P) kokleanın plastik bir kapak kaymasına sabitlenmesi, (Q) konfokal çanaktaki kapak ve cam silindirin yeri, (R) MSC'lerin aşılanması. Beyaz ölçek çubuğu (A-E) = 1 cm; turuncu (F, G, P) ve sarı ölçek çubuğu (H,I) = 1 mm; yeşil ölçek çubuğu (J-O) = 0,5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Zaman atlamalı görüntüleme

1. Burada sunulan deneyler için, sahne üstü inkübatör sistemine sahip bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.
2. Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın.
3. Konfokal mikroskop sahnesine yerleştirilen sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 °C ve %5 CO₂ atmosfere ayarlayın.
4. Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, bulaşık sabitleme kapağıyla örtün ve odayı üst ısıtıcı kapağıyla kapatın.
5. Corti ve MSC'lerin organını görüş alanında yerelleştirmek için yakınlaştırmayı ve odağı ayarlayın.
6. Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20x Plan-Apochromat hedefi (sayısal diyafram 0,8) ve 0,5x kırpma alanıseçin.
7. Edinmealtında, akıllı kuruluma tıklayın ve EGFP'yi seçin.
8. Satın Almaaltındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü% 0.2, iğne deliğini 44 μm, ana kazancı 750 Vve dijital kazancı 1.0olarak ayarlayın.
9. Görüntüleme kurulumualtında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını 4'e ve dijital kazancı 7,5olarak ayarlayın.
10. 210 fayans üretmek için Fayans ve kazık tıklayın.
11. Odak stratejisini açın ve odak modunuseçin.
12. Zaman serisialtında, süreyi 24 saat ve aralığı 10 dk olarak ayarlayın.
13. Edinmealtında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını 8, yönü çift yönlü, ortalamayı 4xve piksel başına bitleri 16olarak ayarlayın.
14. Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın.

3. Görüntü dosyası değişikliği

1. İşlemealtında, dikişetıklayın ve minimum kaplamayı% 5'e ve maksimum kaymayı% 10'aayarlayın.
2. Film dışa aktarma, sıkıştırılmamışolarak ayarlayın ve hızı 7,5olarak ayarlayın.

4. İmmünasyon

1. Ortamı dikkatlice emiş edin ve numuneyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
2. Örneği PBS'de %4 formalin ile 15 dakika sabitlayın ve numuneyi PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
3. Numuneyi PBS'de %0,1 Triton X-100'de 10 dakika permeabilize edin ve 5 dakika pbs ile 3 kez yıkayın.
4. 250 μL phalloidin-iFluor 647 reaktifi (PBS'de 1:1000 seyreltme) ekleyin ve numuneyi çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
5. Numuneyi PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
6. Kapak kapağını cam slayda aktarın ve 2 damla montaj çözeltisi ekleyin.
7. Slayda hafifçe bir kapak kılıfı yerleştirin.
8. Kapak kapağını berrak oje ile kapatın ve hücreler gözlemlenene kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
9. Slaydı, phalloidin için 650/665 nm ve EGFP için Ex/Em=488/507 nm'de uygun bir filtreye sahip bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.

MSC'lerin üç boyutlu modda in vitro geçişi, iki boyutlu (2D) mod11'degeçişi gözlemlemek için bir Transwell sistemi veya geleneksel yara iyileştirme yöntemi ile değerlendirilmiştir. Corti'nin organı Boettcher hücreleri, Claudius hücreleri, Deiters hücreleri, sütun hücreleri, Hensen hücreleri, dış saç hücreleri, iç saç hücreleri, sinir lifleri, basilar membran ve retiküler lamina12gibi çeşitli hücrelerden oluşan karmaşık bir yapıdır. MSC'ler bu tür karmaşık hücrelerden oluşan dokuya nakledildiğinde, hücrelerin nerede işe alınıp stabilize edildiğini belirlemek için teknoloji kullanımı, MSC'ler kullanılarak hücre tedavisi ve yenilenme mekanizmasını anlamak için çok önemlidir. Ek olarak, MSC'lerin hasarın varlığında veya yokluğunda nasıl lokalize olduğunu belirlemek için, yara iyileştirme yöntemi gibi bir 2D yöntem, hücrelerin bir yönde rastgele aşağı doğru hareket ettiği bir Transwell sisteminden daha uygundur.

Bu çalışmada, MSC'lerin iki boyutlu yolu, MSC'ler ile Corti'nin organı arasında bariyer olarak bir cam silindir kullanılarak ve MSC'ler takıldıktan sonra silindiri çıkararak yara iyileştirme yönteminde izlendi. Corti'nin organı kültürlendiğinde, fibroblastlar en dış katmanda bulunan dış saç hücrelerinden çok hızlı bir şekilde dışa doğru büyüdü (Şekil 3, Video 1). Bu nedenle, GFP etiketli MSC'lerin çoğu hızlı büyüyen fibroblastlar tarafından itilmiş gibi görünüyordu (Video 1). Bununla birlikte, bazı GFP etiketli MSC'ler fibroblast tabakasına nüfuz etti ve Corti organına başarıyla göç etti (Şekil 3, Video 1).

Şekil 3. Corti ve GFP etiketli MSC'lerin organının konfokal görüntüsü. Cam silindirin çıkarılmasından ve ek 4 saat inkübasyondan sonra fiksasyon ve boyama yapıldı. Ölçek çubuğu =100 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; MSC'ler: mezenkimal kök hücreler. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: Corti ve GFP etiketli MSC'lerin organının zaman atlamalı konfokal mikroskopisi. Cam silindirin çıkarılmasından ve ek 4 saat inkübasyondan sonra fiksasyon ve boyama yapıldı. Ölçek çubuğu =100 μm. Kısaltmalar: GFP = yeşil floresan protein; MSC'ler: mezenkimal kök hücreler. Bu videoyu indirmek için lütfen tıklayınız.

72 saat inkübasyondan elde edilen sonuçlar, MSC'lerin Corti'nin organına göç ettiğini ve esas olarak modiolusta ve modiolulardan ayrılan koklear sinir liflerinin toplandığı bölgede lokalize olduğunu gösterdi; MSC'lerin morfolojisi sinir liflerininkine benzer radyal bir şekle değiştirildi (Şekil 4B). İlginç bir şekilde, hücreler saç hücresi bölgesi yerine limbus çizgisi boyunca doğrusal bir şekle dönüştürülmüştür(Şekil 4E, oka bakın). Corti organının apikal ve bazal uçları, MSC'lerin basilar zarın medial tarafına taşınmasını önlemek için birleştirilmiş olsa da, MSC'ler çeşitli hücre katmanlarına ve fiziksel bariyerlere nüfuz ederek sinir lifi toplama alanında göç edebildi ve büyüyebildi (Şekil 4E). 16 saat boyunca 1 mM kanamycin ile tedavi ile saç hücrelerinde hasar indüklendiğinde ve kanamycin çıkarıldıktan sonra hücreler 72 saat daha kültürlendiğinde, MSC'ler sadece modiolus'ta değil, dış saç hücrelerinde de lokalize edildi (Şekil 4C,D).

Şekil 4. Corti ve GFP etiketli MSC'lerin organının konfokal görüntüleri. (A) Cam silindirin çıkarılması ve 16 saat ek kuluçkadan sonra fiksasyon ve lekelenme sonrası görüntü alınmıştır. Ölçek çubuğu =200 μm. (B) MSC'ler ağırlıklı olarak modiolus bölgesinde, ölçek çubuğu =20 μm'de dağıtıldı. Cam silindirin tabaktan çıkarılmasından sonra, hücreler 16 saat boyunca 1.0 mM kanamycin ile daha da inkübe edildi, 72 saat boyunca kanamycin içermeyen ortamla kültürlendi ve daha sonra sabitlendi ve lekelendi. Görüntüler (C) dış saç hücresi bölgesi, ölçek çubuğu = 20 μm; (D) modiolus bölgesi, ölçek çubuğu= 50 μm; ve (E) tüm koklea, ölçek çubuğu = 100 μm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Bu sonuçlar, bu çalışmada gösterilen deneysel sistemin MSC'leri kullanarak hücre terapötik stratejileri geliştirmek için yararlı bir test aracı olacağını ve özellikle çeşitli faktörlerin neden olduğu işitme kaybını incelemek için uygulanabileceğini göstermektedir.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.