Yöntem makalesi

Corti Organına Doğru Hücre Göçünü Keşfetmek için Tüp Bebek Zaman Atlamalı Canlı Hücre Görüntüleme

DOI:

10.3791/61947

⸱

4 Aralık 2020

 ,  ,  ,  , 
1Department of Otorhinolaryngology, Yonsei University Wonju College of Medicine, 2Research Institute of Hearing Enhancement, Yonsei University Wonju College of Medicine, 3Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Hallym University College of Medicine

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, Corti organını içeren koklear epitel ile eks vivo inkübasyon ile hasarlı dokuya doğru hareket eden hücreleri gözlemlemek için konfokal mikroskopi kullanarak gerçek zamanlı bir görüntüleme yöntemi sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mezenkimal kök hücrelerin (MSC' ler) hücre yenilenmesi ve tedavisi üzerindeki etkilerini incelemek için bu yöntem koklear epitel ile birlikte kültürden sonra MSC göç ve morfolojik değişiklikleri izler. Corti'nin organı, reissner'ın diseksiyon sırasında üretilen zarının bir kısmına basılarak plastik bir kapak kapağı üzerinde hareketsiz hale getirildi. Cam silindirle sınırlı olan MSC'ler, silindir çıkarıldığında koklear epitellere doğru göç etti. Baskın lokalizasyonları, Corti organının modiolusunda, sinir liflerine benzer bir yönde hizalanmış olarak gözlendi. Bununla birlikte, bazı MSC'ler limbus bölgesinde lokalize edildi ve yatay olarak uzatılmış bir şekil gösterdi. Ayrıca saç hücresi bölgesine göç arttırıldı ve kanamycin tedavisinden sonra MSC'lerin morfolojisi çeşitli formlara dönüştü. Sonuç olarak, bu çalışmanın sonuçları, KOKLEAR epitel ile MSC'lerin kokültürünün hücre nakli yoluyla terapötiklerin gelişimi ve çeşitli durumları ve faktörleri inceleyebilen hücre yenilenmesi çalışmaları için yararlı olacağını göstermektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İşitme kaybı doğuştan ortaya çıkabilir veya yaşlanma, ilaçlar ve gürültü de dahil olmak üzere çeşitli faktörlerden giderek kaynaklanabilir. İşitme kaybı genellikle tedavi etmek zordur, çünkü işitmeden sorumlu saç hücreleri hasar gördükten sonra bozulmuş işlevi geri yüklemek çok zordur1

figure-introduction-1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ICR farelerini içeren tüm araştırma protokolleri Wonju Tıp Fakültesi'ndeki Yonsei Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Deneyler Dünya Tabipler Birliği Etik Kuralları'na göre gerçekleştirildi. Bu protokolde, hamile ICR fareleri yiyecek ve suya ücretsiz erişim ile 12/12 saat açık / karanlık bir döngüde tutuldu.

1. Koklea diseksiyonu

  1. Ultraviyole ışığını ~30 dakika açarak laminer akış dokusu kültür davlumbazını sterilize edin ve kullanmadan önce tüm yüzeyleri% 70 etanol ile püskürtün. Yüzeylerin kurumasını bekleyin.
  2. Diseksiyon aletlerini 10 dakika boyunca% 70 etanol içine yerleştirin ve kullanmadan önce kurutun.
  3. Doğum sonrası 3-4 günlük farelerin kafasını kesmek için bir çalışma bıçağı kullanın (Şekil 2A).
  4. Kafatasını laminer akış başlığına bir stereomikroskopun altına yerleştirin ve dokuyu% 70 etanol içine batırın.
  5. Etanol çıkarmak için dokuyu doku diseksiyon çözeltisine (1x Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi, 1 mM HEPES) hızlı bir şekilde batırın.
  6. Kafatasının orta çizgisini cerrahi bir bıçakla kesin (Şekil 2B,C).
  7. Cildi ön olarak aşağı çekerek ve kulağın dış işitsel kanalını keserek kafatasını ortaya çıkarın (Şekil 2D).
  8. Ön kısımdan kafatasının arka kısmına göz çizgisi boyunca kesin (Şekil 2E).
  9. Kafatasını açın ve künt forps ile beyin, beyincik ve beyin sapı çıkarın (Şekil 2F,G).
  10. Mikro kümes uçlarını kullanarak kokleayı temporal kemikten ayırın (Şekil 2H).
  11. Kokleayı doku diseksiyon çözeltisi içeren bir Petri kabına aktarın.
  12. Koklear otik kapsülün tümünü dikkatlice parçalara ayırın, sadece iç koklear yumuşak doku bırakın(Şekil 2I,J).
  13. Kokleanın modiolularını başka bir çift asa ile kümes ve koklear kanal ile tutun ve iki dokuyu yavaşça ayırın (Şekil 2K).
  14. Stria vascularis ve tectorial membranları nazikçe soyup çıkararak çıkarın (Şekil 2L,M).
  15. Sterilize edilmiş bir plastik kapak kapağını yeni doku diseksiyon çözeltisine yerleştirin ve ardından Basilar zarının aşağı doğru yüzleştiğinden emin olarak Corti organını 9 mm çapında bir kapak kapağına yerleştirin (Şekil 2N-P).
  16. Reissner'ın zarını ve kalan modiolus dokusunups ile kapak kılıfına bastırarak dokuyu hareketsiz hale verin (Şekil 2N-P).
  17. Gömülü doku ile kapak sapını 35 mm çapındaki bir konfokal kabın ortasına aktarın.
  18. Cam klonlama silindirini, koklear eksplant ile çanağın ortasına yerleştirin ve silindirin içine 100 μL eksizyon kültürü ortamı (DMEM / F12,% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 N2 takviyesi, ampisilin (10 μg / mL))10 ekleyin (Şekil 2Q).
  19. Plaka 5 ×10 3 hücre fare kemiği iliği türevi yeşil floresan protein (GFP)-etiketli MSC'ler 2 mL kültür ortamında (E DMEM + E DMEM/F12, FBS, %1 N2 takviyesi, 10 μg/mL ampisilin) cam silindirin dışında (Şekil 2R).
    1. MSC'ler % 80-90 birleştiğinde, tripin-etilenediamin tetraasetik asit ile ayırarak bunları geçiştirin.
  20. Konfokal kabı dikkatlice nemlendirilmiş bir inkübatöre aktarın ve % 5 CO2 atmosferinde 37 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
  21. Silindirin içindeki ve dışındaki tüm ortamı aspire edin ve ardından cam silindiri konfokal tabaktan çıkarın.
  22. Konfokal yemeğe 2 mL taze kültür ortamı ekleyin ve doku kültürü çanağini analize hazır olana kadar nemlendirilmiş bir inkübatörde kuluçkaya yatırın.

figure-protocol-1
Şekil 2. Bir fare kokleasının diseksiyonu ve Corti ve MSC organlarının kokültürü. (A) Farenin kafasının kesilmesi, (B) ve (C) başın orta çizgi sagittal diseksiyonu, (D) ve (E) beynin koronal diseksiyonu, (F) ve (G) beyin ve temporal kemiğin çıkarılması, (H) koklea, (I) kemik koklear duvarının çıkarılması, (J) koklear kanalın modiolustan ayrılması, (L) stria vascularis (SV) ve spiral ligamentin (SL) Corti'nin organından ayrılması, (M) tectorial membranının çıkarılması, (N-P) kokleanın plastik bir kapak kaymasına sabitlenmesi, (Q) konfokal çanaktaki kapak ve cam silindirin yeri, (R) MSC'lerin aşılanması. Beyaz ölçek çubuğu (A-E) = 1 cm; turuncu (F, G, P) ve sarı ölçek çubuğu (H,I) = 1 mm; yeşil ölçek çubuğu (J-O) = 0,5 mm. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Zaman atlamalı görüntüleme

  1. Burada sunulan deneyler için, sahne üstü inkübatör sistemine sahip bir konfokal mikroskopi sistemi kullanın.
  2. Konfokal mikroskobu, floresan ışığı ve bilgisayarı açın.
  3. Konfokal mikroskop sahnesine yerleştirilen sahne üstü inkübatörün koşullarını 37 °C ve %5 CO2 atmosfere ayarlayın.
  4. Numune kabını bulaşık sabitleme kabına yerleştirin, bulaşık sabitleme kapağıyla örtün ve odayı üst ısıtıcı kapağıyla kapatın.
  5. Corti ve MSC'lerin organını görüş alanında yerelleştirmek için yakınlaştırmayı ve odağı ayarlayın.
  6. Görüntü işleme yazılımını açın. Bul seçeneğinin altında, 20x Plan-Apochromat hedefi (sayısal diyafram 0,8) ve 0,5x kırpma alanıseçin.
  7. Edinmealtında, akıllı kuruluma tıklayın ve EGFP'yi seçin.
  8. Satın Almaaltındaki kanal sekmesini açın ve lazer gücünü% 0.2, iğne deliğini 44 μm, ana kazancı 750 Vve dijital kazancı 1.0olarak ayarlayın.
  9. Görüntüleme kurulumualtında ESID'ye tıklayın ve ESID kazancını 4'e ve dijital kazancı 7,5olarak ayarlayın.
  10. 210 fayans üretmek için Fayans ve kazık tıklayın.
  11. Odak stratejisini açın ve odak modunuseçin.
  12. Zaman serisialtında, süreyi 24 saat ve aralığı 10 dk olarak ayarlayın.
  13. Edinmealtında, çerçeve boyutunu 512 x 512 piksel, tarama hızını 8, yönü çift yönlü, ortalamayı 4xve piksel başına bitleri 16olarak ayarlayın.
  14. Denemeye başlamak için denemeyi başlat'a tıklayın.

3. Görüntü dosyası değişikliği

  1. İşlemealtında, dikişetıklayın ve minimum kaplamayı% 5'e ve maksimum kaymayı% 10'aayarlayın.
  2. Film dışa aktarma, sıkıştırılmamışolarak ayarlayın ve hızı 7,5olarak ayarlayın.

4. İmmünasyon

  1. Ortamı dikkatlice emiş edin ve numuneyi fosfat tamponlu salin (PBS) ile 5 dakika boyunca iki kez yıkayın.
  2. Örneği PBS'de %4 formalin ile 15 dakika sabitlayın ve numuneyi PBS ile 3 kez 5 dakika yıkayın.
  3. Numuneyi PBS'de %0,1 Triton X-100'de 10 dakika permeabilize edin ve 5 dakika pbs ile 3 kez yıkayın.
  4. 250 μL phalloidin-iFluor 647 reaktifi (PBS'de 1:1000 seyreltme) ekleyin ve numuneyi çalkalayıcıda oda sıcaklığında 1 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Numuneyi PBS ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın.
  6. Kapak kapağını cam slayda aktarın ve 2 damla montaj çözeltisi ekleyin.
  7. Slayda hafifçe bir kapak kılıfı yerleştirin.
  8. Kapak kapağını berrak oje ile kapatın ve hücreler gözlemlenene kadar karanlıkta 4 °C'de saklayın.
  9. Slaydı, phalloidin için 650/665 nm ve EGFP için Ex/Em=488/507 nm'de uygun bir filtreye sahip bir konfokal mikroskop kullanarak görüntüleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MSC'lerin üç boyutlu modda in vitro geçişi, iki boyutlu (2D) mod11'degeçişi gözlemlemek için bir Transwell sistemi veya geleneksel yara iyileştirme yöntemi ile değerlendirilmiştir. Corti'nin organı Boettcher hücreleri, Claudius hücreleri, Deiters hücreleri, sütun hücreleri, Hensen hücreleri, dış saç hücreleri, iç saç hücreleri, sinir lifleri, basilar membran ve retiküler lamina12gibi çeşitli hücrelerden oluşan karmaşık bir yapıdır. MSC'ler b...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hasarlı hücrelerin yenilenmesini teşvik etmek için MSC'lerin hasarlı bölgelere nakli kapsamlı bir şekilde incelenmiştir ve terapötik etki açıktır. MSC'lerin transplantasyonu ve daha sonra farklılaşması, 3-nitropropionik asit13tarafından indüklenen işitme kaybı olan sıçanlarda işitmeyi geri getirdiği bildirilmiştir. Lee ve arkadaşları insanlara trans-venöz olarak MSC'ler uygulamış olsalar da, işitmede önemli bir iyileşme sağlayamadılar14. Yakın zamana kadar MSC transplantasy...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) ve Hallym Üniversitesi Araştırma Fonu'ndan (NRF-2018-R1D1A1B07050175, HURF-2017-66) araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10X PBS TamponGenDEPOTP2100-104
%4 Formalin T& BenBPP-9004
Ampisilinsigma A5354-10ml
BSAsigma A4503-100G
konfokal çanakSPL200350
konfokal mikroskop ve nbsp;ZEISSLSM800
lamelSPL20009
DMEM/F12Gibco10565-018
Fetal Sığır SerumuThermo Fisher bilimsel16140071
DAPI sigma ile Fluorsheild F6057
ForcepDumont0508-L5-P0
HBSSThermo Fisher bilimsel14065056
HEPESThermo Fisher bilimsel15630080
N2 takviyesiGibco17502-048
Phalloidin-iFluor 647 Reaktifabcamab176759
Sahne Üst İnkübatörTOKAI HITWELSX
Suşu C57BL / 6 fare messenkimal kök hücreleri GFPsiyajenMUBMX-01101
Triton X-100sigma ve nbsp;T8787
Serisi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, C. S., Emmett, S. D., Robler, S. K., Tucci, D. L. Global hearing loss prevention. Otolaryngologic Clinics of North America. 51 (3), 575-592 (2018).
  2. Chamberlain, G., Fox, J., Ashton, B., Middleton, J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity, immunological features, and potential for homing. Stem Cells. 25 (11), 2739-2749 (2007).
  3. Fu, X., et al. Mesenchymal stem cell migration and tissue repair. Cells. 8 (8), (2019).
  4. Uder, C., Brückner, S., Winkler, S., Tautenhahn, H. M., Christ, B. Mammalian MSC from selected species: Features and applications. Cytometry A. 93 (1), 32-49 (2018).
  5. Rojewski, M. T., et al. Translation of a standardized manufacturing protocol for mesenchymal stromal cells: A systematic comparison of validation and manufacturing data. Cytotherapy. 21 (4), 468-482 (2019).
  6. Ullah, M., Liu, D. D., Thakor, A. S. Mesenchymal stromal cell homing: Mechanisms and strategies for improvement. iScience. 15, 421-438 (2019).
  7. Ahn, Y. J., et al. Strategies to enhance efficacy of SPION-labeled stem cell homing by magnetic attraction: a systemic review with meta-analysis. International Journal of Nanomedicine. 14, 4849-4866 (2019).
  8. Alon, R., Ley, K. Cells on the run: shear-regulated integrin activation in leukocyte rolling and arrest on endothelial cells. Current Opinion in Cell Biology. 20 (5), 525-532 (2008).
  9. Sykova, E., Jendelova, P. In vivo tracking of stem cells in brain and spinal cord injury. Progress in Brain Research. 161, 367-383 (2007).
  10. Landegger, L. D., Dilwali, S., Stankovic, K. M. Neonatal murine cochlear explant technique as an in vitro screening tool in hearing research. Journal of Visualized Experiments. (124), e55704(2017).
  11. Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107(2019).
  12. Rask-Andersen, H., et al. Human cochlea: anatomical characteristics and their relevance for cochlear implantation. The Anatomical Record. 295 (11), 1791-1811 (2012).
  13. Kamiya, K., et al. Mesenchymal stem cell transplantation accelerates hearing recovery through the repair of injured cochlear fibrocytes. The American Journal of Pathology. 171 (1), 214-226 (2007).
  14. Lee, H. S., Kim, W. J., Gong, J. S., Park, K. H. Clinical safety and efficacy of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cell transplantation in sensorineural hearing loss patients. Journal of Audiology and Otology. 22 (2), 105-109 (2018).
  15. Vanden Berg-Foels, W. S. In situ tissue regeneration: chemoattractants for endogenous stem cell recruitment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 20 (1), 28-39 (2014).
  16. Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti. Journal of Visualized Experiments. (36), e1685(2010).
  17. Ogier, J. M., Burt, R. A., Drury, H. R., Lim, R., Nayagam, B. A. Organotypic culture of neonatal murine inner ear explants. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 170(2019).
  18. Oshima, K., et al. Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and induced pluripotent stem cells. Cell. 141 (4), 704-716 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mezenkimal K k H crelerKonfokal MikroskopiZaman Atlamal G r nt lemeKoklear EpitelCam SilindirDoku SabitlemeGFP etiketli MKH ler

İlgili makaleler