Yöntem makalesi

Bir C. elegans Eksitotoksik Nekroz Modelinde Nörodejenerasyonun İncelenmesi için Canlı Hayvan Görüntüleme ve Hücre Ayıklama Yöntemleri

DOI:

10.3791/61958

⸱

22 Ocak 2021

 ,  , 
1Cellular, Molecular, and Biomedical Science, CUNY School of Medicine, The City University of New York (CUNY), 2PhD Program in Biology, The CUNY Graduate Center, The City University of New York (CUNY)

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bir C. elegans eksitotoksisite modelinde, bu protokol nekrotik nörodejenerasyonun düzenlenmesini, aday mediatörleri kodlayan genlerin etkisini ve mitokondrinin tutulumunu analiz etmek için in vivo görüntüleme kullanır. Hücre ayrışması ve sınıflandırılması, nörodejenerasyon ve nöroproteksiyon mekanizmalarının hücreye özgü transkriptomik analizi için risk altındaki nöronları spesifik olarak elde etmek için kullanılır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksitotoksik nekroz, nörodejenerasyonun önde gelen bir şeklidir. Bu düzenlenmiş nekroz süreci, nörotransmitter glutamatın sinaptik birikimi ve postsinaptik reseptörlerinin aşırı uyarılması ile tetiklenir. Bununla birlikte, bu tip nörodejenerasyonun farklı nöronal şişme morfolojisi ile sonuçlanan müteakip moleküler olaylar hakkında bilgi eksiktir. Belirli hücre altı bölmelerdeki değişiklikler veya farklı nöronal alt tiplerin diferansiyel hücresel savunmasızlığının temeli gibi diğer yönler yeterince araştırılmamıştır. Ayrıca, in vitro veya ex vivo preparatların kullanıldığı çalışmalarda ortaya çıkan bir dizi faktör, bu nörodejenerasyon formunun doğal ilerlemesini değiştirebilir ve bozabilir. Bu nedenle, nematod Caenorhabditis elegans'ın genetik olarak uygun ve şeffaf model sisteminde nöronal nekrozun derecesini düzenleyen müdahalelerin etkilerini izleyerek canlı hayvanlarda eksitotoksik nekrozu incelemek önemlidir. Bu protokol, optik, genetik ve moleküler analizleri birleştirerek C. elegans nöronlarında eksitotoksik nekrozu inceleme yöntemlerini açıklar. Eksitotoksik koşulları indüklemek için C. elegans, bir glutamat taşıyıcı genin (glt-3) nakavtlanması, glutamat reseptörü hiperstimülasyonu ve nörodejenerasyon üretmek için nöronal duyarlılaştırıcı bir genetik arka plan (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) ile birleştirilir. Canlı hayvanlarda Nomarski diferansiyel girişim kontrastı (DIC), floresan ve konfokal mikroskopi, nörodejenerasyonu ölçmek, floresan etiketli proteinlerin hücre altı lokalizasyonunu takip etmek ve dejenere nöronlarda mitokondriyal morfolojiyi ölçmek için kullanılan yöntemlerdir. Nöronal Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS), nörodejenerasyonun hücre tipine özgü transkriptomik analizi için risk altındaki nöronları belirgin bir şekilde sıralamak için kullanılır. Canlı görüntüleme ve FACS yöntemlerinin yanı sıra C. elegans model organizmasının faydalarının bir kombinasyonu, araştırmacıların büyük bir örneklem büyüklüğüne sahip tekrarlanabilir veriler elde etmek için bu sistemden yararlanmalarına olanak tanır. Bu tahlillerden elde edilen bilgiler, nörodejeneratif hastalıklarda terapötik müdahale için yeni hedeflere dönüşebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksitotoksisite, beyin iskemisinde nöronal ölümün önde gelen nedenidir ve çoklu nörodejeneratif hastalıklara katkıda bulunan bir faktördür 1,2,3,4,5,6,7,8,9. Beyne giden oksijenli kan akışının bozulması (örneğin, bir kan pıhtısı nedeniyle) glutamat taşıyıcılarının arızalanmasına neden olarak sinapsta glutamat birikimine yol açar. Bu glutamat fazlalığı, sinaptik sonrası Glutamat Reseptörlerini (GluR'ler) aşırı aktive eder ve nöronlara aşırı (katalitik, stokiyometrik olmayan) Ca2+ akışına yol açar (Şekil 1A). Bu zararlı akın, morfolojik ve mekanik olarak apoptozdan düzenlenmiş nekroza kadar değişen ilerleyici postsinaptik nörodejenerasyona yol açar 10,11,12. Hayvan modellerinde başarılı müdahalelere dayanmalarına rağmen, Ca2 + girişini engellemeye ve hücre canlılığını arttırmaya çalışan GluR antagonistlerinin çoklu klinik çalışmaları klinik ortamda başarısız olmuştur 13,14,15,16. Bu başarısızlıklara muhtemel kritik bir katkıda bulunan (hayvan modellerinin aksine) klinik ortamda tedavinin inme başlangıcından saatler sonra uygulanmasıdır, bu da müdahalenin geç etkili nöroprotektif mekanizmaları bloke etmesine neden olurken, GluRs 14,16,17'nin aşağı akışında dejeneratif sinyallemeyi kesintiye uğratmamasıdır. Tromboliz üzerine kurulu alternatif bir yaklaşım, ancak ciddi şekilde kısıtlı bir zaman aralığında uygulanabilir ve bu da birçok hastayı (evde inme geçiren ve başlangıç zamanı iyi bilinmeyen) bundan yararlanamazhale getirir 17. Bu aksilikler, eksitotoksisite araştırmalarının GluR hiper-stimülasyonundan sonra meydana gelen olayların incelenmesine odaklanması ve sonraki dejeneratif kaskadları eşzamanlı nöroprotektif süreçlerden ayırt etme ihtiyacını vurgulamaktadır. Bu yaklaşım, hücre hasarını önlemeye ve hasar başlangıcından sonra daha sonra uygulanabilecek etkili ilaç hedeflerini belirlemeye yardımcı olabilir.

Eksitotoksisitede sonraki olayları tanımlamak için bir yaklaşım, mitokondriyal çöküşe yol açanlar gibi GluR hiperstimülasyonunun aşağı akışındaki hücre ölümü sinyal mekanizmalarını incelemektir. Mitokondriyal fizyoloji ve dinamiğin ciddi arızası, eksitotoksisite 18,19,20'de görüldüğü gibi nörodejenerasyonun ayırt edici bir özelliğidir. Tüm hücreler mitokondriyal fonksiyona ve hayatta kalma, aktivite ve hücresel bakım için kullanılabilirliğe bağlı olsa da, nöronlar sinyal iletimini ve yayılmasını desteklemek için özellikle mitokondriyal enerji üretimine bağımlıdır. Spesifik olarak, nöronlar, oksijen ve glikoza yüksek bağımlılık ile postsinaptik reseptörlerin/kanalların21 aktivasyonunu takiben dinlenme zarı potansiyelini geri kazanmak için sinyalleşmeyle ilgili enerji tüketimlerinin ~%50'sini harcarlar. İnmede gözlenen glikoz ve oksijen mevcudiyetinin azalması, ciddi mitokondriyal değişikliklere yol açarak ATP üretiminde daha fazla azalmaya neden olur 19,22,23,24. Bununla birlikte, mitokondriyal çöküşe yol açan olayların sırasını belirlemeye yönelik çalışmalar tartışmalı sonuçlar verdi ve fikir birliğinden yoksundu. Mitokondriyal morfolojiyi analiz etmek, nöronal sağlığın iyi bir göstergesi olduğu için mitokondriyal patolojiye yol açan bu olayların anlaşılmasına yardımcı olabilir 25,26,27,28,29. Filamentli mitokondri, sağlıklı bir nöronun temsilcisidir, oysa parçalanmış mitokondri, hücre ölümüne yol açabilecek önemli nöronal hasarı ortaya çıkarır. Farklı genetik koşullar altında canlı hayvanlarda mitokondriyal morfolojinin analiz edilmesi, eksitotoksisitede mitokondriyal bağımlı nörodejenerasyonda yer alan spesifik genlere ve yollara odaklanmaya yardımcı olabilir.

Eksitotoksik nörodejenerasyonun derecesini düzenleyebilecek müteakip olayları tanımlamaya yönelik bir başka yaklaşım, eksitotoksisitenin bazı etkilerini hafifleten transkripsiyonel nöroprotektif mekanizmaları incelemektir14,16. Bununla birlikte, temel nöroprotektif transkripsiyon faktörlerinin özgüllüğünün olmaması ve deneysel düzeneklerin farklılığı, temel nöroprotektif programları (özellikle düzenlenmiş nekrozda) net bir şekilde tanımlama çabalarının başarısını engellemektedir.

Bu nedenle, hem aşağı akış ölüm sinyal yollarının incelenmesi hem de eksitotoksisitede transkripsiyonel nöroproteksiyonun incelenmesi, gözlemlenen sonuçlar üzerinde büyük zorluklar ve anlaşmazlıklarla karşılaştı. Bu tartışmaların çoğunun, ex vivo veya in vitro eksitotoksisite modellerinin kullanımından ve farklı deney düzeneklerinin özgüllüğünün getirdiği değişkenlikten kaynaklanması muhtemeldir. Bu nedenle, yüksek oranda korunmuş temel mekanizmaları belirlemeye odaklanmak ve bunları in vivo olarak incelemek son derece faydalıdır. Nematodun basit model sistemi C. elegans, özellikle güçlü ve çeşitlendirilmiş araştırma araçlarının güçlü kombinasyonu, çekirdek hücre ölüm yollarının korunması ve sinir sisteminin yapısı ve bağlanabilirliği hakkında zengin bilgi nedeniyle özellikle etkili bir seçenek sunar 30,31,32,33. Gerçekten de, Driscoll laboratuvarının mekanosensoriyel nöronlardaki nekrotik nörodejenerasyonun genetik analizi üzerine yaptığı ufuk açıcı çalışma, bu yaklaşımın gücünün mükemmel bir göstergesidir34. Eksitotoksisite analizi için önemli olan, nematoddaki sinyal yollarının korunması, glutamaterjik nörotransmisyonun tüm ana bileşenlerini içerir35,36.

Nematod eksitotoksisite modeli, bu ufuk açıcı çalışmalara dayanmakta ve araştırmacının inme ve glutamata bağımlı nörotoksisiteden etkilenen diğer nörodejeneratif hastalıklarda meydana gelenlere benzer biyokimyasal süreçleri incelemesine olanak tanımaktadır. Eksitotoksik koşulları indüklemek için C. elegans bu deneysel yaklaşım, bir glutamat taşıyıcı genin (glt-3) ve nöronal duyarlılaştırıcı genetik arka planın (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L)]) GluR hiperstimülasyonu ve nörodejenerasyon37 üretmek için nakavt edilmesinin kombinasyonu olan bir eksitotoksisite suşu kullanır. Bu eksitotoksisite suşu, eksitotoksik nörodejenerasyona postsinaptik ila glutamaterjik bağlantılar olan 30 spesifik (glr-1 eksprese eden) nöronu açığa çıkarır. Risk altındaki bu 30 nörondan, hayvan gelişim boyunca ilerledikçe bireysel nöronlar nekrozdan geçer (karışık stokastiklik ve belirli spesifik nöronlara karşı kısmi tercihile 38), aynı zamanda hücre cesetleri de yavaş yavaş çıkarılır. Birçok mutant suşun erişilebilirliği ile birlikte, bu yaklaşım nörodejenerasyonu ve nöroproteksiyonu etkileyen çoklu yolların incelenmesine izin verir. Bu yaklaşımlar, eksitotoksisitede 38,40 eksitotoksik nörodejenerasyonun bazı aşağı akış ölüm sinyal kaskadlarını39 ve transkripsiyonel düzenleyicilerini analiz etmek için zaten kullanılmıştır. Solucan41'deki diğer nekrotik nörodejenerasyon vakaları gibi, nematodun eksitotoksik nörodejenerasyonu klasik apoptozuiçermez 40.

Bu yöntem makalesi, C. elegans'ta eksitotoksik nekrotik nörodejenerasyonu indüklemek, ölçmek ve manipüle etmek için temel sistemi açıklamaktadır.Ayrıca, nematod eksitotoksisitesinin belirli yönlerine ilişkin çalışmaları kolaylaştırmak için şu anda kullanımda olan iki ana protokolün ana hatlarını çizmektedir. Araştırmacı, floresan raportörler ve canlı in vivo görüntüleme kullanarak, eksitotoksik nörodejenerasyonun nematod modelindeki mitokondriyal tutulumu ve dinamikleri inceleyebilir. Spesifik nöroprotektif transkripsiyon faktörlerinin etkisini belirlemek için, araştırmacı, floresan belirteçlerin hücre tipine özgü ekspresyonu, hayvanların tek hücrelere ayrışması ve eksitotoksisiteden nekroz riski taşıyan spesifik nöronları izole etmek için FACS'yi kullanabilir. Bu hücre tipine özgü izole nöronlar daha sonra anahtar transkripsiyon faktörlerinde mutasyonları barındıran suşlarda RNA dizilimi için kullanılabilir. Bir araya getirildiğinde, bu yöntemler araştırmacıların eksitotoksik nörodejenerasyonun ve nöroproteksiyonun moleküler temellerini in vivo olarak büyük bir netlik ve hassasiyetle ortaya çıkarmalarına izin verebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Eksitotoksik Nörodejenerasyon ve Nöroproteksiyonu Araştırmak İçin Kullanılan Suşlar

  1. Standart eksitotoksik nörodejenerasyon için referans noktası olarak nematod eksitotoksisite suşu ZB1102'yi kullanın.
    NOT: Glutamata bağımlı eksitotoksisite C. elegans , ZB1102 suşunda, bir glutamat taşıyıcısının bir nakavtının (ko) bu hayvanlardaki nöronları nörotoksisiteye duyarlı hale getiren bir transgen ile birleştirilmesiyle üretilir ve postsinaptik ila glutamaterjik bağlantılara37 nöronların bir alt kümesinde eksprese edilir. Bu genetik kombinasyon nematod eksitotoksisite suşu olarak adlandırılır ve Caenorhabditis Genetik Merkezi'nden (CGC) ücretsiz olarak temin edilebilir.
  2. Eksitotoksik nekrozun aday düzenleyicilerini kodlayan genlerin etkisini incelemek için, bu tür genlerdeki bir mutasyonu (örneğin, dapk-1 veya crh-1) nematod eksitotoksisite suşu ile birleştirin.
  3. Standart C. elegans yöntemlerinegöre genetik çaprazlamalar yapın 30, wormbook.org 42,43'te belirtildiği gibi.
  4. Mutasyonun moleküler temeli tipik olarak belgelendiğinden, PCR kullanarak spesifik lokusu genotipleyerek çapraz dölleri takip edin. WT ile mutantı parça boyutuna (delesyonlar için) veya sıralamaya (nokta mutasyonları için) göre ayırt edin.
    NOT: Tablo 1 , özellikle bu protokol için farklı nörodejenerasyon ve nöroproteksiyon yollarını incelemek için kullanılan suşları özetlemektedir.
  5. Tüm kritik suşları iki bağımsız çizgiyle türetin ve gözlemlenen fenotipin geçerliliğini doğrulamak için bunları ayrı ayrı test edin.

2. Büyüme Ortamı ve Hayvancılık

  1. Solucanları 16-25 °C'de standart yöntemlere göre OP50 E.coli ile tohumlanmış standart NGM plakaları 30,37,42 veya MYOB plakaları38,44 üzerinde büyütün.
    NOT: MYOB plakları, NGM plakları ile aynı sonuçları verir ancak hazırlanması biraz daha kolaydır.
  2. Deneysel suşları sürekli olarak iyi beslenmiş halde tutun.
    NOT: Açlık, nörodejenerasyonu etkileyebilir ve ölmekte olan kafa nöronlarının sayısını azaltabilir. Solucanlar yetersiz beslenirse veya aç kalırsa, onları taze tabaklara koyun ve deneylere devam etmeden önce birkaç nesil bekleyin. Açlığın nesiller arası etkisi birkaç nesil sonra azalacaktır.

3. Dejenere kafa nöronlarının Nomarski diferansiyel girişim kontrastı (DIC) ve skorlama ile ölçülmesi

  1. Normal eksitotoksisite seviyelerini temsil eden miktar tayini için deneysel kontrol olarak nematod eksitotoksisite suşunu (ZB1102: glt-3 (bz34) IV; nuIs5 V) kullanın. Protokol, aynı hayvanı farklı gelişim aşamalarından geçirmez. Bunun yerine, karışık aşamalı bir hayvan popülasyonunun anlık görüntüsünü verir, böylece toplamda tüm gelişim aşamalarını temsil etmek için farklı hayvanlardan bilgi toplanır.
    NOT: Nuls5 transgeni[Pglr-1::GαS(Q227L). Pglr-1::GFP]45 (postsinaptik ila glutamaterjik bağlantılara sahip nöronlarda aktive edilmiş bir Gαs ve GFP'yi ifade eder), ~1 ölmekte olan baş nöron/hayvanın (gelişim sırasında herhangi bir zamanda) arka plan GluR'den bağımsız nekrotik nörodejenerasyon seviyesini üretir. Glt-3 (ko) ilavesi, postsinaptik nuIs5 eksprese eden nöronların nekrotik nörodejenerasyonunu GluR'ye bağımlı bir şekilde arttırır ve üçüncü larva aşamasında (L3) 4-5 ölmekte olan baş nöron/hayvana kadar çıkar37.
  2. Test suşları için, yakın zamanda tamamlanmış bir genetik çaprazlamadan elde edilen hayvanları kullanın veya taze melezlerden hazırlanan -80 ° C'lik donmuş stoklardan ilgili suşları çözün. Bir fenotip ve nörodejenerasyon puanlamadan önce birkaç nesil (≥4) bekleyin.
  3. İyi beslenmiş hayvanlardan oluşan karışık aşamalı bir popülasyonun bir plakasından küçük bir agar parçasını kesin ve çıkarın ve agar parçasını ters çevirerek bir lamel üzerine monte edin, böylece agarın yüzeyinde sürünen hayvanlar şimdi lamel ile karşı karşıya kalacak.
    NOT: Hayvanlar hala hareket edebilir, ancak şimdi biraz kısıtlanmıştır ve anestezi olmadan gözlemlenebilir. Böyle bir yığın, yenisiyle değiştirilmeden önce ~ 1 saat kullanılabilir.
  4. x10 oküler ve x40 veya x63 objektifli ters çevrilmiş bir DIC kapsamı kullanarak, lameli manuel olarak kaydırarak hayvanları rastgele tarayın. Aşağıda açıklanan diğer görüntüleme adımları, ters çevrilmiş veya dik mikroskoplarda gerçekleştirilebilirken, agar yığınındaki solucanların incelenmesi, ters çevrilmiş bir kapsam gerektirir.
  5. Her hayvanın gelişim aşamasını rahminin şekline göre tanımlayın (wormbook.org'daki rahim diyagramlarına bakın).
  6. Her hayvan için, gelişim aşamasını ve ölmekte olan (yani vakuollenmiş) nöronların sayısını kaydedin. Kafadaki ölmekte olan nöronların toplam sayısını, retroveziküler gangliondaki ölmekte olan nöronların sayısını (belirli hücrelerin kolayca tanımlanmasını sağlar) ve kuyruktaki ölmekte olan nöronların sayısını (glutamattan etkilenmeyen ve hassaslaştırıcı transgen nuIs5'in tamamen aktif olduğunu doğrulayan bir iç kontrol görevi görür) sayın ve kaydedin.
  7. Bu verileri, belirli bir suştaki hayvanların gelişim aşaması kategorilerine göre gruplandırıldığı bir tabloya kaydedin.
  8. Her oturumda, çeşitli gelişim aşamalarındaki solucanlardan rastgele veri toplayın; İstatistiksel analiz için yeterli veri toplamak için birden çok gün boyunca birkaç puanlama oturumu gerçekleştirin. Nörodejenerasyon seviyelerini birden fazla aşamada kaydedin ve Şekil 1C'ye benzer bir çubuk grafik oluşturun.
    NOT: Bu yöntem, belirli bir tedavi veya mutasyonun tüm aşamalarda nörodejenerasyon seviyelerini yükseltip yükseltmediğini (dağılımı yukarı/aşağı kaydırarak) veya nörodejenerasyondaki zirveyi daha erken veya sonraki bir gelişim aşamasına kaydırıp kaydırmadığını (dağılımı sola/sağa kaydırarak) belirlemeye izin verecektir.
  9. Genotipin kimliğine kör iken veri toplama işlemini gerçekleştirin. Genetik çizginin iki bağımsız izolatında onaylayın (izolatlar arasındaki diğer / beklenmedik genetik farklılıkların istenmeyen etkileri tehlikesini en aza indirmek için) ve analiz için verileri toplayın.
  10. Her suşta, her gelişim aşamasında kafadaki (retroveziküler ganglion dahil) dejenere nöronların sayısının ortalamasını ve SEM'ini hesaplayın (Şekil 1D). Gerektiği gibi, ölmekte olan retroveziküler ganglion -sadece ve kuyruk nöronlarının benzer bir analizini yapın.

4. Spesifik dejenere kafa nöronlarının tanımlanması

  1. Tek tek (veya küçük gruplar-) hayvanları bir agar pedine46 monte edin ve solucanı tetramizol ile felç edin (aşağıya bakınız, bölüm 5).
  2. Kombine bir floresan ve DIC kapsamı (dik veya ters) ile belirli vakuollü nöronları bulun.
  3. GFP etiketli süreçlerini izleyerek ve hücre gövdesinin konumunu ve süreçlerin şeklini WormAtlas47 kullanarak glr-1'i eksprese ettiği bilinen nöronlarınkilerle karşılaştırarak vakuollenmiş nöronun spesifik nöron kimliğini belirleyin.
    NOT: Alternatif olarak, tanımlama, Hobert laboratuvarı48'den yakında gelecek olan çok renkli etiketleme ile nöronları hızlı bir şekilde tanımlamak için yeni yöntemlerle desteklenebilir.

5. Raportör suşların floresan mikroskobu ile nöronal mitokondriyal morfolojinin canlı görüntülenmesi

  1. Dejenere postsinaptik nöronlardaki mitokondriyal değişikliklerin görüntülenmesi için (orijinal eksitotoksisite suşunda sitoplazmik GFP ile etiketlenmiştir) mito-mCherry floresansını inceleyin.
  2. Test eksitotoksisite suşunu, postsinaptik nöronların mitokondrisini kırmızı floresan ile etiketleyen suşlarla çaprazlayın (floresan proteini ile glr-1 promotörü altında TOM-20'nin N-terminali arasında bir füzyonu ifade ederek; yapılar ve suşlar hakkında ayrıntılar için, bkz.49). Hayvanlar artık normal bir epifloresan mikroskobu (dik veya ters) veya konfokal bir mikroskop kullanılarak görüntülenebilir.
  3. Nöronal sağkalımı etkilemeden solucanı felç etmek için, 5 μL 10 mM tetramisol'ü taze hazırlanmış bir agaroz pedine pipetleyin. Ped hazırlama ile ilgili ayrıntılı protokol için Arnold ve ark.46'ya bakınız.
  4. Hayvanları tetramisol damlasının ortasına yerleştirin ve bir lamel ile monte edin.
  5. Lamelin kenarlarını oje ile kapatın ve ojenin kurumasını bekleyin.
  6. Tetramisol tedavisinden 20 dakika sonra ve DIC ve floresan görüntülemeli bir dürbün kullanarak, 20x objektif lens kullanarak solucanları bulun.
  7. Solucanın başı (veya ilgilenilen nöronlar) yerleştirildikten sonra, 100x yağ hedefine geçin ve soma içindeki mitokondrinin floresan etiketlemesine odaklanın.
  8. DIC, GFP ve TxRed filtre ayarlarını kullanarak Z yığını görüntüleri yakalayın.

6. Nöronal mitokondri morfolojisi, puanlama ve nicelik tayini

  1. Solucanın canlı görüntülenmesi sırasında veya ImageJ veya başka bir görüntüleme yazılımı kullanarak görüntü elde edildikten sonra mitokondriyal morfolojiyi analiz edin.
  2. Spesifik nöronların kolay tanımlanması ve tekrarlanan analizi için, retroveziküler gangliondaki üç nöronu, RIGL / R ve AVG'yi tanımlayın (bazı durumlarda, eksitotoksisitede hücre cesedi klerensi nedeniyle sadece ikisi mevcuttur).
  3. Mitokondriyi üç ana gruba ayırın: filamentli, orta ve parçalı50,51,52.
    NOT: Filamentli mitokondri, nöronların somasında, genellikle çekirdeği çevreleyen sürekli ince yapılar olarak görünür. Ara mitokondri, kırılmalara ve somada bir miktar parçalanmaya rağmen, en az bir belirgin filamentli ağın bir kombinasyonu olarak ortaya çıkar. Parçalanmış mitokondriler, mitokondriyal ağda tam kırılmalar sergiler, şiş bir görünüme sahiptir ve soma boyunca dağılırlar (Şekil 2A).
  4. Her solucan için, toplamda en az 30 solucan için filamentli, orta veya parçalanmış mitokondri ile nöronların yüzdesini puanlayın.
  5. Suşlar53 arasındaki her mitokondriyal morfoloji için tek yönlü ANOVA ve ardından post hoc Tukey testi kullanarak istatistiksel analiz yapın.

7. Nörodejenerasyon riski taşıyan nöronların FACS'ı için solucan ayrışması için tampon ve reaktif hazırlığı

  1. M9 tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 3 g KH2PO4, 6 g Na2HPO4, 5 g NaCl, H2O ila 1 L otoklavlama ile sterilize edin. 1 mL filtreyle sterilize edilmiş 1 MMgS04 ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
  2. Yumurta tamponunu aşağıdaki gibi hazırlayın: 118 mM NaCl, 48 mM KCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2 ; sterilize etmek için otoklav. 25 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar 2 M HEPES pH 7.3 stok çözeltisi (daha önce 0.2 μm şişe üstü filtre ile filtrelenmişti) ekleyin. PH'ı 1 N NaOH (10 mL'den fazla değil) ile 7.3'e ayarlayın. Son ozmolaritenin 335 -345 mOsm arasında olduğundan emin olmak için ozmolarmetre kullanın. Filtre, yumurta tamponunu 0,2 μm şişe üstü filtrelerle sterilize eder. 4 °C'de saklayın.
    NOT: İlgili MgCl 2 ve CaCl 2stok çözeltilerini yapmak için MgCl2 ·6H2O ve CaCl2 · 2H2O kullanıldığında tuzlar daha kolay çözünür. Ayrıca 10x yumurta tamponu stoğu yapabilir ve gerektiğinde steril deiyonize suda seyreltebilirsiniz.
  3. SDS-DTT'yi aşağıdaki gibi hazırlayın: 20 mM HEPES pH 8.0, %0.25 SDS, 200 mM DTT, %3 sükroz. Bir doku kültürü davlumbazında, SDS-DTT'yi 0,2 μm şırınga filtresi ile sterilize edin. 300 μL'lik alikotları -20 °C'de, ışıktan korumak için folyo ile kaplı olarak saklayın.
  4. Pronaz çözeltisini aşağıdaki gibi hazırlayın: ayrışma gününü yumurta tamponunda 15 mg / mL pronaz hazırlayın. Buz üzerinde saklayın.

8. Nörona özgü FACS için Yaş Senkronizasyonu

  1. Eksitotoksisite genotipini (ve istenildiği gibi diğer mutasyonları) sıralama için kolayca kullanılabilen güçlü bir floresan markörün transgenik ekspresyonu ile birleştiren hayvanları kullanın (örneğin, FJ1244: pzIs29 [Pglr-1::NLS::LAC-Z::GFP::glr-1 3'UTR] X)54. Hayvanları iki veya üç adet 100 mm NGM/MYOB plakası üzerinde 20 °C'de, plaka ağırlıklı olarak gravid solucanlarla dolana kadar büyütün.
  2. M9 tamponu kullanarak solucanları plakalardan yıkayın. Solucanları 10 mL'lik bir cam serolojik pipet kullanarak 50 mL'lik konik tüplere aktarın.
  3. Oda sıcaklığında 250x g'da 2,5 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın.
  4. Solucan peletini 10 mL çamaşır suyu çözeltisinde (steril deiyonize suda %2, 10 N NaOH ve %5 taze ev tipi çamaşır suyu) yeniden süspanse edin.
  5. Tüpleri yatay olarak bir çalkalayıcıya yerleştirin, düşük hızda sallayın. Solucanların tüpün dibine yerleşmediğinden emin olun. Çamaşır suyu çatlakları solucanın kütikülünü açar ancak yumurta kabuğu tarafından korunan embriyoları etkilemez.
    1. Bu beyazlatma işlemi yaklaşık olarak 5 dakika sürer ancak bu süre değişkenlik gösterir. Aşırı ağartmanın meydana gelmemesini sağlamak için, her dakika bir numune alarak işlemi izleyin: Her tüpten 10 μL'yi bir cam mikroskop lamı üzerine nazikçe pipetleyin ve solucanları bir diseksiyon mikroskobu kullanarak inceleyin.
  6. Gravid solucanlarının çoğu kırılarak açıldıktan ancak tamamen çözülmedikten sonra, konik tüpleri yumurta tamponu ile doldurarak ağartma adımını durdurun.
  7. Yumurtaları / embriyoları almak için, tüpleri 250x g'de 2,5 dakika santrifüjleyin, süpernatanı çıkarın ve tekrar yumurta tamponu ile yıkayın.
  8. Dört yıkama daha tekrarlayın.
  9. Peleti nazikçe pipetleyerek yumurtaları yeniden süspanse edin ve dört adet 100 mm'lik tohumlanmış NGM/MYOB plakasına yayın. Embriyoların 3 gün boyunca 20 ° C'de çatlamasına ve büyümesine izin verin.
    NOT: Plakalar şimdi ağırlıklı olarak gravid solucanlarla dolu olmalıdır.
  10. Bu ağartıcı/yaş senkronizasyon protokolünü tekrarlayarak yaş senkronizasyonunu tekrarlayın.
  11. Yumurtaları sekiz adet 100 mm NGM/MYOB plakasına pipetleyin. İstenilen larva aşamasına gelene kadar hayvanın yumurtadan çıkmasına ve 20 ° C'de büyümesine izin verin.

9. FACS için tüm solucan hücresi ayrışması

  1. Senkronize solucanları istenen gelişim aşamasına kadar büyütün. 100 mm'lik plakaları M9 tampon ve cam serolojik pipetlerle nazikçe yıkayın ve 50 mL konik tüplere aktarın.
  2. 45 mL'ye kadar soğuk M9 ekleyin. Solucanların yerçekimi ile dibe yerleşmesine izin vermek için tüpleri 30 dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin, plakalardan kalan bakteri kalıntıları süpernatantta yüzer.
  3. Süpernatanı çıkarın ve solucanları taze M9 ile yıkayın.
  4. Buz üzerine 30 dakikalık yerçekimi çökelmesini tekrarlayın.
  5. Süpernatanı çıkarın, 45 mL'ye kadar M9 ekleyin ve 5 dakika boyunca 250 x g'da santrifüjleyin.
  6. Peleti bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 1 mL'ye kadar M9 ekleyin.
  7. Masa üstü santrifüjde 14.000 rpm'de 1 dakika döndürün ve süpernatanı çıkarın.
  8. Kütikülü bozmak için, peletin hacminin (yaklaşık) iki katı kullanarak solucan peletini SDS-DTT ile yeniden süspanse edin ve L2-yetişkin aşamaları için oda sıcaklığında 4 dakika sallanarak inkübe edin.
    NOT: SDS-DTT'de 4 dakikalık inkübasyonu aşmayın, çünkü floresan protein sinyali daha uzun SDS-DTT tedavisi ile büyük ölçüde azalacaktır. SDS-DTT ışığa duyarlı olduğundan, 3 aydan daha eski olmamalıdır, çünkü çözelti zamanla gücünü kaybetmiş olabilir; Ayrışmalar, yakın zamanda hazırlanmış SDS-DTT çözeltisi ile en iyi sonucu verir.
  9. SDS-DTT tedavisini durdurmak için 1 mL'ye kadar 1x yumurta tamponu (pH 7.3, 335-345 mOsm) ekleyin.
  10. Masa üstü santrifüjde 14.000 rpm'de 1 dakika döndürün ve süpernatanı çıkarın.
  11. Kütikülü daha da bozmak ve hayvanların hücrelerini ayırmak için, peletin hacminin üç katını kullanarak peleti oda sıcaklığında pronaz solüsyonu ile yeniden süspanse edin.
  12. Oda sıcaklığında 15-30 dakika inkübe edin.
  13. P-200 veya P-1000 pipet ile her 5 dakikada bir 40 kez yukarı ve aşağı pipetleyin, pipet ucuyla tüpün altına dokunun.
    NOT: Tüpün dibine temas eden ucun oluşturduğu basınç, solucanın ayrışmasını kolaylaştırır. Hızlı pipetleme sırasında solucanların yanlışlıkla pipet miline girmemesi için bir filtre ucu kullanın.
  14. 15 dakika sonra, bir cam slayt üzerine 5μL'yi nazikçe pipetleyerek ve ilerlemeyi bir diseksiyon mikroskobu altında gözlemleyerek solucan ayrışmasının ilerlemesini kontrol edin. Sağlam solucanların çoğu (~% 90) patladığında, işlem tamamlanır.
    NOT: Birçok solucan sağlam kalırsa pronaz inkübasyonu uzatılabilir.
  15. Bir hücre kültürü davlumbazında, pronaz tedavisini durdurmak için 1,5 mL'ye kadar 1x yumurta tamponu ekleyin.
  16. FACS tüplerine aktarın, 5 mL yumurta tamponu ekleyin ve 5 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
  17. Süpernatanı çıkarın ve 3 mL pf yumurta tamponunda tekrar süspanse edin.
  18. Yeni FACS tüplerine 70 μm'lik bir hücre süzgeci kapağı yerleştirin, süzgeç üzerine pipet hücresi süspansiyonu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 800 x g'da döndürün. Akış hücresi süspansiyonunu toplayın.
  19. Yeni FACS tüplerine 5 μm'lik bir hücre süzgeci kapağı yerleştirin, süzgecin üzerine pipet hücresi süspansiyonu yerleştirin ve 1 dakika boyunca 800 x g'da döndürün.
  20. Yumurta tamponunda 0,5 μg/mL'lik son konsantrasyon için DAPI ekleyin, ışıktan korumak için bir kapak/kapak ile buzun üzerine yerleştirin.
  21. FACS'ı mümkün olan en kısa sürede gerçekleştirin. Floresan protein sinyali zamanla ve ışığa maruz kaldıkça azalır, bu nedenle ayrışma protokolünü mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirmek ve ayrışma tamamlandıktan hemen sonra FACS'yi gerçekleştirmek önemlidir.
    NOT: Solucan ayrışma protokolü, Miller laboratuvarı 55,56,57, Murphy laboratuvarı58 ve Shaham laboratuvarı59'dan alınan protokollerden uyarlanmıştır.

10. C. elegans nöronlarının tanımlanması için FACS makine çalışma modifikasyonları

  1. C. elegans nöronlarını sıralarken standart kılıf sıvısı yerine 4 litre soğutulmuş (4 °C) yumurta tamponu kullanın.
    NOT: C. elegans hücrelerinin ozmolaritesi, memeli hücrelerinden çok daha yüksektir ve standart kılıf sıvısı nöronları patlatacaktır. Tüm makine ayarları ve kalibrasyonlar, yumurta tamponu eklendikten sonra yapılır, çünkü yumurta tamponunun viskozitesi standart kılıf sıvısınınkinden farklıdır. Sıralama teknisyeni, lazerlerin düzgün çalıştığından emin olmak için teşhis boncuklarını makineden geçirecektir.
  2. Sıralanmış nöronlar sonraki transkriptomik çalışmalarda kullanılacaksa, en az 100.000 GFP + hücresini doğrudan 800 μL Trizol-LS + 10 μL RNaz inhibitörüne sıralayın.
  3. Karıştırmak için Trizol'deki hücreleri 15 kez ters çevirin.
  4. Kuru bir buz/etanol banyosunda dondurun ve bir RNA dizileme deneyi için tüm örneklerden RNA'yı çıkarmaya hazır olana kadar -80 °C'de saklayın.
    NOT: Sıralanan hücrelerin çoğu, transkriptom analizi için doğrudan Trizol'e toplanırken, sıralama verimliliğinin mikroskopi doğrulaması için yumurta tamponuna toplanan küçük bir GFP + sıralanmış hücre örneğini (her suştan) aldığınızdan emin olun.

11.FACS geçit stratejisi

  1. GFP pozitif sinyalini tanımlamak için 530/30 filtreli ve 502 uzun geçişli (LP) 488 nm lazer kullanın.
  2. DAPI pozitif ve negatif hücreleri tanımlamak için 450/50 filtreli 405 nm lazer kullanın.
  3. GFP pozitif hücrelerle karıştırılabilecek otomatik floresan hücreleri tanımlamak için 610/20 filtreli ve 595 LP ile 488 nm lazer kullanın (kişisel iletişim, Stanka Semova, Operasyon Müdürü, Akış Sitometrisi Kaynak Merkezi, Rockefeller Üniversitesi).
  4. Standart bir geçit stratejisi uygulayın ve hücre ve döküntü kümelerini temsil etmesi muhtemel büyük bir yan saçılma alanı (SSC-A) ve küçük ileri saçılma alanı (FSC-A) olan olayları kaldırın.
  5. Önsöz dağılım tekillerini ve ardından yan dağılım teklerini ayırın.
  6. Yüksek GFP sinyali ve düşük otofloresan sinyali olan hücreleri izole edin.
    NOT: Otofloresan için yüksek ve GFP'de daha düşük hücreler gerçek GFP pozitif hücreler değildir.
  7. GFP+ kapısı için eşik, GFP- hücreleri (yani N2) ile GFP+ hücreleri55,56 karşılaştırılarak belirlenir.
  8. DAPI'nin ölü hücrelere seçici geçirgenliğine bağlı olarak, canlı/ölü geçitli tüm ölü hücreleri çıkarın: Canlı ölü kapı eşiği, boyanmamış hücrelerin DAPI lekeli hücrelerle karşılaştırılmasıyla belirlenir.
    NOT: Birden fazla numuneyi sıralarken, çapraz kontaminasyon olmadığından emin olmak için numuneler arasındaki akışı yıkayın.

12. FACS geçit stratejisinin verimliliğini doğrulamak için sıralanmış nöronların mikroskobu

  1. Sıvı itici bir kalemle cam mikroskop lamı üzerine bir daire çizin.
  2. 10 μL sıralanmış hücreleri, dairenin içindeki yumurta tamponunda süspansiyon halinde pipetleyin. Numunenin üzerine bir lamel yerleştirin ve lamel cidarının çevresini oje ile kapatın.
  3. Oje kuruduktan sonra, dik/ters çevrilmiş floresan mikroskobu altında, sıralanan hücrelerin gerçekten esas olarak GFP + hücreleri olduğunu kontrol edin.
    NOT: FACS geçit stratejisini57 doğrulamak için her sıralama oturumundan sonra bu kontrolü gerçekleştirin.

13. Kalite Kontrol otomatik elektroforez sisteminde RNA Ekstraksiyonu ve RNA kalite ölçümü

NOT: RNaz ile kontaminasyonu önlemek için tüm RNA çalışmaları son derece dikkatli bir şekilde yürütülmelidir (reaktiflerin, sarf malzemelerinin dikkatli bir şekilde hazırlanması ve en iyi RNaz güvenli uygulamaları dahil).

NOT: Numunelerin çeker ocakta fenol ve/veya kloroform içerdiği tüm adımları gerçekleştirin.

  1. Trizol'deki hücre şişelerini oda sıcaklığında çözdürün.
  2. Filtre ucu P200 pipet ucu kullanarak, numuneyi homojen hale getirmek için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
  3. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
  4. Liziz için kullanılan 1 mL Trizol reaktifi başına 0.2 mL kloroform ekleyin, ardından tüpü güvenli bir şekilde kapatın.
  5. Tüpleri 15 kez ters çevirin ve 2-3 dakika inkübe edin (20-25 ° C'de).
  6. Numuneyi 4 °C'de 12.000 × g'da 15 dakika santrifüjleyin. Karışım, bir alt kırmızı fenol-kloroforma, bir ara faza ve renksiz bir üst sulu faza ayrılır.
  7. RNA'yı içeren üst sulu fazı münhasıran toplayın ve 1.5 mL'lik yeni bir düşük DNA / RNA bağlayıcı tüpe aktarın.
    NOT: Bazı durumlarda, hücre sıralayıcıdan Trizol'e düşen yumurta tamponundaki hücrelerin oranı 1: 3 numune: Trizol-LS oranından büyükse, yumurta tamponunun yüksek tuz içeriği katmanların ters çevrilmesine neden olabilir; bu meydana gelirse, daha fazla Trizol-LS ekleyin ve ters çevirme ve santrifüjlemeyi tekrarlayın. Sıralamadan sonra numune hacmindeki artışı not ederseniz bu da önlenebilir; 1:3 oranı korunmazsa, RNA ekstraksiyonuna başlamadan önce yeterli trizol ekleyin.
  8. RNA'yı daha da saflaştırmak için RNA ekstraksiyon kolonu kimyasını kullanın.
  9. RNA Bütünlük Numarasını (RIN) ölçmek ve sonraki RNA dizileme deneylerine girdi için 8.0 veya daha yüksek RNA RIN'ini doğrulamak için Kalite Kontrol otomatik elektroforez sistemini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksitotoksisite nematod modeli ve vakuollü dejenere nöronların tanımlanması
Burada gösterilen veriler önceki yayınlardanalınmıştır 37,38. Eksitotoksik kaynaklı nörodejenerasyonu taklit etmek için, bir glutamat taşıyıcı gen nakavtı (glt-3), nöronal duyarlılaştırıcı bir transgenik arka plan (nuls5 [Pglr-1::GαS(Q227L); Pglr-1::GFP)]). Transgenik yapı, GLutamat Reseptörü 1'i (GLR-1, AMPA ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaygın tartışmalar ve başarısızlıklar, eksitotoksisitenin deşifre edilmesi son derece zor bir süreç sunduğunu öne sürse de, nematoddaki eksitotoksisite analizi, bu kritik nörodejenerasyon formunda korunmuş nöronal hücre ölüm yollarını aydınlatmak için özellikle çekici bir strateji sunmaktadır. Araştırmacı, bu sistemde bulunan zengin araştırma araçları koleksiyonuna ve özellikle hayvanın şeffaflığına (in vivo analize izin verir) ve yaşayabilir mutantların geniş repertuarına (CGC'den ücret...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların ifşa edecek hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mano Lab ve Li lab'ın (mevcut ve yeni) tüm üyelerine yardımları ve destekleri için teşekkür ederiz. Nematodlarda nekrotik nörodejenerasyon analizine öncülük ettiği ve sürekli destek sağladığı için Dr. Monica Driscoll'a (Rutgers Univ.) teşekkür ederiz; Destek ve tavsiye için Dr. Chris Li (CCNY); Jeffery Walker (CCNY Akış Sitometrisi Çekirdek tesisi), Dr. Bao Voung (CCNY) ve Stanka Semova (Rockefeller Univ. Sıralama Fakültesi Çekirdeği) hücre sıralama konusunda pratik destek ve tavsiyeler için; Reaktifler için Dr. Chris Rongo (Rutgers Univ.); Dr. David Miller (Vanderbilt Üniversitesi), Coleen Murphy (Princeton Üniversitesi), Shai Shaham, Menachem Katz ve Katherine Varandas (üçü de Rockefeller Üniversitesi'nden) C. elegans ayrışma protokolleri için.

Mano laboratuvarı, NIH NINDS'ten (NS096687, NS098350, NS116028) IM'ye ve bir NIH U54 CCNY-MSKCC ortaklığı (CA132378/CA137788) aracılığıyla fon aldı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
AgarVWRAAA10752-0E
BactopeptoneVWR90000-264
BD FACSAriaIII 
Çamaşır SuyuHerhangi bir ev
CaCl2VWR97062-586
CaCl2· 2H2O BioExpress0556-500G
Hücre Süzgeci, PluriStrainer mini 70umPluriSelect43-10070-40
Hücre Süzgeci, PluriStrainer mini 5umPluriSelect43-10005-60
Santrifüj - 15-50 mL Sorval tezgah üstü  LEGENDX1R TC Fisher Sci75618382
Santrifüj - mikrofüj ; Ependorff 5424VWRMP022629891
KloroformVWR97064-680
KolesterolSigmaC8667-25G
DAPIFisher SciEN62248
Kuru buzBirleşik Şehir Buz Küpü
DTTVWR97061-340
E. coli OP50CGCOP50
Etanol (% 100)VWREM-EX0276-1S
Etanol (% 90)VWRBDH1160-4LP
FACS tüpleriABD Sci1450-2810
Filtre uçları ABD Sci1126-7810
Cam 10 mL serolojik pipetler ABD Sci1071-0810
Isıtma bloğu BioExpressD-2250
Hepes VWR97061-824
Daldırma Yağı - Carl Zeiss ImmersolFisher Sci12-624-66A
İzopropanolVWR EM-PX1830-4
KClVWRBDH9258-2.5KG
KH2< / sub>PO < sub>4< / sub>VWRBDH9268-2.5KG
Düşük bağlama 1.5mL tüplerABD Sci4043-1021
Metamorf Görüntüleme YazılımıMoleküler Cihazlar
MgCl2VWR97063-152
MgCl2· 6H < alt > 2 < / alt > OBioExpress0288-500g
MgSO< alt > 4< / alt >VWR97061-438 ve nbsp;
Mikroskop, Konfokal, Floresan Görüntüleme içinZeissLSM 880
Mikroskop, Ters, Floresan Görüntüleme içinZeissAxiovert 200 M
Mikroskop  KameraQ-ImagingRetiga R1
Mikroskop Floresan GörüntülemeLümeniSOLA SE Işık Motoru
Mikroskobu, Nomarski DICZeissAxiovert Observer A1
Mikroskobu, Nomarski DICNikonEclipse Ti-S
Na2HPO4VWR97061-588
NaClVWRBDH9286-2.5KG
NaOHVWR97064-476
Petri kapları, 100mmFisher SciFB0875712
Petri kapları, 60mmTriTechT3308
Pipet Kontrol CihazıEkipman P2002
Pipetleyici P10 UçlarıABD Sci1110-3000
Pipetleyici P1000 İpuçlarıABD Bilimi1111-2020
Pipetleyici P200 İpuçlarıABD Sci1110-1000
PronaseSigmaP8811-1G
RNAse uzak spreyFisher Sci7000TS1
RNAse içermeyen serolojik pipetlerABD Sci1071-0810
RNAse-free 50 mL tüplerABD Sci5622-7261
RNeasy mikroQiagen74004
SDSVWR97064-496
Streptomisin sülfatSigmaS6501-100G
SükrozVWRAAJ63662-AP
SUPERase ve middot; RNase inhibitörüFisher SciAM2694
Kalite Kontrol otomatik elektroforez sisteminde: Tapestation - Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Agilent5067-5579 
Tapestation - Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Merdiveni Agilent5067-5581 
Tapestation - Yüksek Hassasiyetli RNA ScreenTape Örnek Tamponu Agilent5067-5580
Bant İstasyonu - IKA MS3 vortekserAgilent/IKA4674100
Tapestation - 2000 rpm'de IKA vortekser adaptörü Agilent/IKA3428000
Tapestation - Yükleme uçları Agilent5067- 5152 veya 5067- 5153
Tapestation - Optik Kapak 8x StripAgilent401425
Tapestation - Optik Tüp 8x StripAgilent401428
Kalite Kontrol Otomatik Elektroforez Sistemi: TapeStation 2200AgilentG2964AA
TetramisolSigmaL9756-10G
Tris tabanıFisher SciBP152-500
Tris hidroklorürFisher SciBP153-500
Trizol-LSFisher Sci10296-010
Wescor Vapro 5520 Buhar Basıncı OzmometreFisher SciNC0044806
Wheaton Unispense & mu; P DağıtıcıVWR25485-003
BD için Işık Kaynağı

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Choi, D. W., Rothman, S. M. The role of glutamate neurotoxicity in hypoxic-ischemic neuronal death. Annual Review of Neuroscience. 13, 171-182 (1990).
  2. Donnan, G. A., Fisher, M., Macleod, M., Davis, S. M. Stroke. The Lancet. 371 (9624), 1612-1623 (2008).
  3. Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments. Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).
  4. Fisher, M., Saver, J. L. Future directions of acute ischaemic stroke therapy. Lancet Neurology. 14 (7), 758-767 (2015).
  5. Chamorro, A., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurology. 15 (8), 869-881 (2016).
  6. Baron, J. C. Protecting the ischaemic penumbra as an adjunct to thrombectomy for acute stroke. Nature Reviews Neurology. 14 (6), 325-337 (2018).
  7. GBD Neurology Collaborators. Global, regional, and national burden of neurological disorders, 1990-2016: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2016. Lancet Neurology. 18 (5), 459-480 (2019).
  8. Kaji, R. Global burden of neurological diseases highlights stroke. Nature Reviews Neurology. 15, 371-372 (2019).
  9. Chen, R. L., Balami, J. S., Esiri, M. M., Chen, L. K., Buchan, A. M. Ischemic stroke in the elderly: an overview of evidence. Nature Reviews Neurology. 6 (5), 256-265 (2010).
  10. Mehta, S. L., Manhas, N., Raghubir, R. Molecular targets in cerebral ischemia for developing novel therapeutics. Brain Research Reviews. 54 (1), 34-66 (2007).
  11. Galluzzi, L., Kepp, O., Krautwald, S., Kroemer, G., Linkermann, A. Molecular mechanisms of regulated necrosis. Seminars in Cell and Developmental Biology. 35, 24-32 (2014).
  12. Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H., Vandenabeele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell death pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (2), 135-147 (2014).
  13. Davis, S. M., et al. Selfotel in Acute Ischemic Stroke : Possible Neurotoxic Effects of an NMDA Antagonist. Stroke. 31 (2), 347-354 (2000).
  14. Ikonomidou, C., Turski, L. Why did NMDA receptor antagonists fail clinical trials for stroke and traumatic brain injury. Lancet Neurology. 1 (6), 383-386 (2002).
  15. O'Collins, V. E., et al. 1,026 experimental treatments in acute stroke. Annals of Neurology. 59 (3), 467-477 (2006).
  16. Lai, T. W., Zhang, S., Wang, Y. T. Excitotoxicity and stroke: Identifying novel targets for neuroprotection. Progress in Neurobiology. 115 (157-188), (2014).
  17. Tymianski, M. Stroke in 2013: Disappointments and advances in acute stroke intervention. Nature Reviews Neurology. 10 (2), 66-68 (2014).
  18. Nicholls, D. G. Mitochondrial calcium function and dysfunction in the central nervous system. Biochimica et Biophysica Acta. 1787 (11), 1416-1424 (2009).
  19. Galluzzi, L., Blomgren, K., Kroemer, G. Mitochondrial membrane permeabilization in neuronal injury. Nature Reviews Neuroscience. 10 (7), 481-494 (2009).
  20. Sharma, N., Pasala, M. S., Prakash, A. Mitochondrial DNA: Epigenetics and environment. Environmental and Molecular Mutagenesis. 60 (8), 668-682 (2019).
  21. Howarth, C., Gleeson, P., Attwell, D. Updated energy budgets for neural computation in the neocortex and cerebellum. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 32 (7), 1222-1232 (2012).
  22. Sims, N. R., Muyderman, H. Mitochondria, oxidative metabolism and cell death in stroke. Biochimica et Biophysica Acta. 1802 (1), 80-91 (2010).
  23. Dawson, T. M., Dawson, V. L. Mitochondrial Mechanisms of Neuronal Cell Death: Potential Therapeutics. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 57, 437-454 (2017).
  24. Verma, M., Wills, Z., Chu, C. T. Excitatory Dendritic Mitochondrial Calcium Toxicity: Implications for Parkinson's and Other Neurodegenerative Diseases. Frontiers in Neuroscience. 12, 523(2018).
  25. Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death & Differentiation. 10 (8), 870-880 (2003).
  26. Knott, A. B., Perkins, G., Schwarzenbacher, R., Bossy-Wetzel, E. Mitochondrial fragmentation in neurodegeneration. Nature Review Neuroscience. 9 (7), 505-518 (2008).
  27. Cho, D. H., Nakamura, T., Lipton, S. A. Mitochondrial dynamics in cell death and neurodegeneration. Cellular and Molecular Life Sciences. 67 (20), 3435-3447 (2010).
  28. Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends in Cell Biology. 23 (2), 64-71 (2013).
  29. Picard, M., Shirihai, O. S., Gentil, B. J., Burelle, Y. Mitochondrial morphology transitions and functions: implications for retrograde signaling. American Journal of Physiology - Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 304 (6), 393-406 (2013).
  30. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  31. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of Caenorhabditis elegans. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 314, 1(1986).
  32. Horvitz, H. R. Worms, Life, and Death (Nobel Lecture). Chembiochem. 4 (8), 697-711 (2003).
  33. Cook, S. J., et al. Whole-animal connectomes of both Caenorhabditis elegans sexes. Nature. 571 (7763), 63-71 (2019).
  34. Driscoll, M., Gerstbrein, B. Dying for a cause: invertebrate genetics takes on human neurodegeneration. Nature Reviews Genetics. 4 (3), 181-194 (2003).
  35. Brockie, P. J., Maricq, A. V. Ionotropic glutamate receptors: genetics, behavior and electrophysiology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  36. Mano, I., Straud, S., Driscoll, M. Caenorhabditis elegans Glutamate Transporters Influence Synaptic Function and Behavior at Sites Distant from the Synapse. Journal of Biological Chemistry. 282 (47), 34412-34419 (2007).
  37. Mano, I., Driscoll, M. C. elegans Glutamate Transporter Deletion Induces AMPA-Receptor/Adenylyl Cyclase 9-Dependent Excitotoxicity. J Neurochem Journal of Neurochemistry. 108 (6), 1373-1384 (2009).
  38. Feldmann, K. G., et al. Non-Canonical Activation of CREB Mediates Neuroprotection in a C. elegans Model of Excitotoxic Necrosis. Journal of Neurochemistry. 148 (4), 531-549 (2019).
  39. Del Rosario, J. S., et al. Death Associated Protein Kinase (DAPK) -Mediated Neurodegenerative Mechanisms in Nematode Excitotoxicity. BMC Neuroscience. 16, 25(2015).
  40. Tehrani, N., Del Rosario, J., Dominguez, M., Kalb, R., Mano, I. The Insulin/IGF Signaling Regulators Cytohesin/GRP-1 and PIP5K/PPK-1 Modulate Susceptibility to Excitotoxicity in C. elegans. PLoS One. 9 (11), 113060(2014).
  41. Chung, S., Gumienny, T. L., Hengartner, M. O., Driscoll, M. A common set of engulfment genes mediates removal of both apoptotic and necrotic cell corpses in C. elegans. Nature Cell Biology. 2 (12), 931-937 (2000).
  42. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  43. Fay, D. S. Classical genetic methods. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  44. Church, D. L., Guan, K. L., Lambie, E. J. Three genes of the MAP kinase cascade, mek-2, mpk-1/sur-1 and let-60 ras, are required for meiotic cell cycle progression in Caenorhabditis elegans. Development. 121 (8), 2525-2535 (1995).
  45. Berger, A. J., Hart, A. C., Kaplan, J. M. Galphas-induced neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 18 (8), 2871-2880 (1998).
  46. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiment. , e61368(2020).
  47. Altun, Z. F., Herndon, L. A., Crocker, C., Lints, R., Hall, D. H. WormAtlas. , Available from: www.wormatlas.org (2019).
  48. Yemini, E., et al. NeuroPAL: A Neuronal Polychromatic Atlas of Landmarks for Whole-Brain Imaging in C. elegans. bioRxiv. , (2019).
  49. Ghose, P., Park, E. C., Tabakin, A., Salazar-Vasquez, N., Rongo, C. Anoxia-reoxygenation regulates mitochondrial dynamics through the hypoxia response pathway, SKN-1/Nrf, and stomatin-like protein STL-1/SLP-2. PLoS Genetics. 9 (12), 1004063(2013).
  50. Regmi, S. G., Rolland, S. G., Conradt, B. Age-dependent changes in mitochondrial morphology and volume are not predictors of lifespan. Aging (Albany NY). 6 (2), 118-130 (2014).
  51. Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201 (1453-1466), (2015).
  52. Momma, K., Homma, T., Isaka, R., Sudevan, S., Higashitani, A. Heat-Induced Calcium Leakage Causes Mitochondrial Damage in Caenorhabditis elegans Body-Wall Muscles. Genetics. 206 (4), 1985-1994 (2017).
  53. Fay, D. S., Gerow, K. A biologist's guide to statistical thinking and analysis. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2013).
  54. Moss, B. J., Park, L., Dahlberg, C. L., Juo, P. The CaM Kinase CMK-1 Mediates a Negative Feedback Mechanism Coupling the C. elegans Glutamate Receptor GLR-1 with Its Own Transcription. PLoS Genetics. 12 (7), 1006180(2016).
  55. Christensen, M., et al. A primary culture system for functional analysis of C. elegans neurons and muscle cells. Neuron. 33 (4), 503-514 (2002).
  56. Fox, R. M., et al. A gene expression fingerprint of C. elegans embryonic motor neurons. BMC Genomics. 6, 42(2005).
  57. Spencer, W. C., et al. Isolation of Specific Neurons from C. elegans Larvae for Gene Expression Profiling. PLoS One. 9 (11), 112102(2014).
  58. Kaletsky, R., et al. Transcriptome analysis of adult Caenorhabditis elegans cells reveals tissue-specific gene and isoform expression. PLoS Genetics. 14 (8), 1007559(2018).
  59. Katz, M., et al. Glutamate spillover in C. elegans triggers repetitive behavior through presynaptic activation of MGL-2/mGluR5. Nature Communications. 10 (1), 1882(2019).
  60. Shaham, S. Methods in cell biology. WormBook. , Available from: www.wormbook.org (2006).
  61. Kaal, E. C., et al. Chronic mitochondrial inhibition induces selective motoneuron death in vitro: a new model for amyotrophic lateral sclerosis. Journal of Neurochemistry. 74 (3), 1158-1165 (2000).
  62. Lewis, J. A., et al. Cholinergic receptor mutants of the nematode Caenorhabditis elegans. Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).
  63. Zhang, S., Banerjee, D., Kuhn, J. R. Isolation and culture of larval cells from C. elegans. PLoS One. 6 (4), 19505(2011).
  64. Zhang, S., Kuhn, J. R. Cell isolation and culture. WormBook. , Available from: www.wormbook.org 1-39 (2013).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

N ronal FACS Ay klamaGlutamat Ta y c NakavtMitokondriyal Morfoloji AnaliziKonfokal MikroskopiDiferansiyel nterferans KontrastFloresan Protein LokalizasyonuH cre Tipi Spesifik TranskriptomikN rodejenerasyon Kantifikasyonu
Video yakında

İlgili makaleler