Yöntem makalesi

Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu

8.1K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/61967

⸱

4 Aralık 2020

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Microbiology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 2Center for Women’s Infectious Disease Research, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 3Center for Cellular Imaging, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 4Department of Obstetrics and Gynecology, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 5Department of Pediatrics, Washington University School of Medicine in Saint Louis, 6Fred Hutchinson Cancer Research Center, 7TESCAN USA, Inc., 8University of California San Diego

Bu makalede

Özet

Gizli hücre içi mesane rezervuarları oluşturmak için üropatojenik E. coli (UPEC) transüretral aşılamasının bir fare modeli ve tekrarlayan UPEC İYE'yi indüklemek için G. vajinalis'e mesane maruziyeti gösterilmiştir. Ayrıca bakterilerin sayımı, idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu için işlenmesi de gösterilmiştir.

Özet

Üropatojenik Escherichia coli'nin (UPEC) neden olduğu tekrarlayan üriner sistem enfeksiyonları (rİYE) yaygın ve maliyetlidir. Erkek ve dişi farelerde İYE modellerini açıklayan önceki makaleler, idrar ve dokularda bakteriyel aşılama ve numaralandırma prosedürlerini göstermiştir. C57BL / 6 farelerde ilk mesane enfeksiyonu sırasında, UPEC, mesane epitel hücrelerinin içinde, UPEC bakteriürisinin temizlenmesini takiben devam eden gizli rezervuarlar oluşturur. Bu model, UPEC'in gizli mesane rezervuarlarının içinden ortaya çıkmasının neden olduğu rİYE'yi incelemek için bu çalışmalara dayanmaktadır. Ürogenital bakteri Gardnerella vaginalis, bu modelde rİYE'nin tetikleyicisi olarak kullanılır, çünkü kadınların ürogenital yollarında, özellikle İYE ile ilişkili vajinal dysbiosis bağlamında sıklıkla bulunur. Ek olarak, mesane dokusunun taramalı elektron mikroskobu (SEM) analizini takiben in situ mesane fiksasyonu için bir yöntem de tanımlanmıştır ve mesaneyi içeren diğer çalışmalara potansiyel olarak uygulanmaktadır.

Giriş

İdrar yolu enfeksiyonları (İYE) dünya çapında önemli bir sağlık yükü getirmekte ve her yıl milyonlarca insanın, özellikle de kadınların yaşam kalitesini etkilemektedir1. Üropatojenik Escherichia coli (UPEC) İYE1'in en sık nedenidir. İYE gelişen birçok hasta (yaklaşık% 20-30), ilk enfeksiyonun antibiyotik aracılı temizlenmesine rağmen 6 ay içinde tekrarlayan bir İYE (rİYE) yaşayacaktır2. Ne yazık ki, menopoz öncesi kadınların% 5'iher yıl 3,4 veya daha fazla rİYE'den muzdariptir. Sıralı rUE atakları, indeks vakası 5,6,7,8'den aynı UPEC suşunun kalıcılığından kaynaklanabilir. İnsan örneklerinden ve fare modellerinden elde edilen veriler, aynı suş rİTI'sinin mesanedeki sessiz rezervuarlarda bulunan UPEC'den kaynaklanabileceğini düşündürmektedir. İnsanlarda, UTEC epitel hücrelerinde ve İYE 9,10,11,12,13 hastalarının mesane biyopsilerinde tespit edildi. C57BL / 6 farelerde yapılan çalışmalar, bazı UPEC suşlarının, floresan mikroskobu ve mesane dokusunun homojenizasyonu ve kültürü ile tespit edildiği gibi, mesanede sessiz hücre içi rezervuarlar oluşturabileceğini göstermiştir ve bakteriüri 14,15,16'nın çözülmesini takiben aylarca korunur. Mesanenin, mesane epitelinin (ürotelyum) pul pul dökülmesine neden olan ajanlarla tedavisi, örneğin protamin sülfat17 veya kitosan18, rİYE'ye neden olmak için rezervuarlardan UPEC'in ortaya çıkmasını tetikler. Bu veriler, önceki bir enfeksiyondan mesane UPEC rezervuarlarını barındıran kadınlarda, ürotelyal pul pul dökülmeye yol açan mesane maruziyetlerinin rİYE'yi tetikleyebileceğini düşündürmektedir.

Vajinal mikrobiyotanın idrar yolu enfeksiyonuna katkıda bulunduğuna dair kanıtlar artmaktadır19,20. Gardnerella vaginalis, hem vajinal hem de üriner mikrobiyota 21,22,23,24,25,26,27,28,29'un sık görülen bir üyesidir. Vajinada, yüksek düzeyde G. vajinalis varlığı, bakteriyel vajinozis (BV) olarak bilinen ve kadınların ~% 30'unu etkileyen mikrobiyoz disbiyozu ile ilişkilidir30,31,32. BV'li kadınlar, Lactobacillus33,34,35,36,37'nin hakim olduğu vajinal topluluğa sahip kadınlara kıyasla İYE yaşama riski daha yüksektir. Fare modellerinde, G. vaginalis, hem vajina38'de hem de mesane39'da epitel pul pul dökülmesine neden olur. UPEC mesane rezervuarlarını barındıran C57BL / 6 farelerde, G. vaginalis'e iki ardışık mesane maruziyeti - ancak PBS'ye değil - UPEC'in rezervuarlardan yeniden ortaya çıkmasına neden olur ve UPEC rUTI'ye neden olur. Ortaya çıkış, daha önce UPEC bakteriürisini çözmüş farelerden idrarda UPEC titrelerinin ortaya çıkması ve PBS'ye maruz kalan kontrol hayvanlarına kıyasla kurban sırasında UPEC mesane homojenat titrelerinde daha sonra bir azalma ile kanıtlanmıştır39. İlginçtir ki, mesanede G. vaginalis tarafından kalıcı bir kolonizasyon yoktur. Vakaların büyük çoğunluğunda, her biri idrarda 12 (h)'den az canlı G. vaginalis'e sahip iki kısa maruziyet, ürotelyal peelingi ortaya çıkarmak ve rİYE'yi teşvik etmek için yeterlidir.

Bu protokol, hücre içi mesane rezervuarlarında bulunan UPEC'in neden olduğu bir fare rUE modelini tanımlar ve nüksetmeyi tetiklemek için G. vaginalis mesane aşılamasını kullanır. Bu modelle elde edilen ilerleme, G. vajinalis'in daha önce kullanılan kimyasal ajanlara kıyasla rİYE'nin klinik olarak ilgili bir biyolojik tetikleyicisi olmasıdır. Ayrıca, fare idrar yollarında G. vaginalis'in nispeten kısa ömürlü sağkalımı, cinsel aktiviteden sonra ortaya çıkabileceği gibi, geçici mikrobiyal maruziyetlerin ürotelyum üzerindeki etkisinin incelenmesine izin verir. rUTI modelini özetlemenin yanı sıra, bu protokol ayrıca idrar sitolojisi ve in situ mesane fiksasyonu ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile ürotelyumun görüntülenmesi için yöntemleri de açıklamaktadır.

G. vajinalis kaynaklı tekrarlayan UPEC UTI'nin bu protokolü, bir kanamisin direnç kaseti (UTI89kanR)40 taşıyan UPEC suşu UTI89'u kullanır. Test edilen tüm UPEC suşları, farelerde akut enfeksiyon aşamasında hücre içi bakteri toplulukları oluşturamamıştır41 ve UPEC'in tüm suşlarının gizli hücre içi rezervuarlar oluşturma yeteneğine sahip olup olmadığı henüz bilinmemektedir. Modeldeki diğer UPEC suşları kullanılmadan önce rezervuar oluşumu doğrulanmalıdır. Bu protokol spontan streptomisin'e dirençli G. vaginalis izolatı JCP8151BSmR38 kullanır. JCP8151BSmR ile rUTI'nin indüklenmesi,39 saat arayla 12 saat veya 7 gün (d) verilen iki ardışık G. vajinalis aşılaması gerektirir. Diğer G. vaginalis suşlarının peeling ve / veya UPEC rİTI'ye neden olup olmadığı bu modelle belirlenmeye devam etmektedir. Bilinen antibiyotik direncine sahip UPEC ve G. vaginalis suşlarının (UPEC için kanamisin veya spektinomisin ve G. vaginalis için streptomisin gibi) kullanılması esastır, çünkü antibiyotikler, enfeksiyonu izlemek için koloni oluşturan birimlerin (CFU) numaralandırılmasına müdahale edebilecek endojen fare mikrobiyotasının büyümesini önlemek için agar plakalarına eklenebilir. Bu özellikle idrar örneklerinin kültürlenmesi için önemlidir, çünkü fare idrarı sıklıkla antibiyotiksiz kültür plakalarında aşırı büyüyebilen diğer bakterileri içerir. Bu endojen bakterilerin fare idrarındaki kökeni bilinmemektedir, ancak muhtemelen idrar toplama sırasında toplanan periüretral ve ürogenital bakterileri yansıtmaktadır.

G. vaginalis, fakültatif bir anaerobik bakteridir ve bu nedenle, bu protokol anaerobik bir odada büyüyen G. vaginalis JCP8151BSmR'yi tanımlar. Bir anaerobik hazne mevcut değilse, anaerobik büyüme koşullarını korumak için diğer yöntemler (hava geçirmez bir kaptaki GasPak torbası gibi) kullanılabilir. Alternatif olarak, bazı G. vaginalis suşları (JCP8151BSmR dahil) standart bir doku kültürü inkübatöründe (% 5 CO2) büyüyecektir. JCP8151BSmR dışındaki G. vaginalis suşlarının kullanılması, bakterilerin bu modelde benzer şekilde davrandığından emin olmak için test yapılmasını gerektirdiği gibi, değişen büyüme koşulları, istenen canlı inokülum konsantrasyonlarını elde etmek için kültür (plakalar ve sıvı içinde) ve optik yoğunluk (OD) 600 eşdeğerleri için ideal sürelerin ampirik olarak belirlenmesini gerektirir. Ayrıca, büyüme koşullarının G. vaginalis'in patobiyolojisini etkileyip etkilemediği bilinmemektedir.

Son olarak, bu modelin kullanılıp kullanılmayacağını düşünürken, araştırmacılar grup başına tipik İYE fare modellerinden daha fazla sayıda hayvan gerektirebileceğinin farkında olmalıdır. Bu kısmen, rUTI'nin indüklenmesinin, farelerin mesanenin ilk enfeksiyonunun neden olduğu UPEC bakteriürisini çözmesini gerektirmesidir. Bu nedenle, bakteriüriyi temizleyemeyen herhangi bir fare (genellikle devam eden böbrek enfeksiyonunun göstergesi olan bir fenotip), protokolün rUTI fazına dahil edilmez. Bu çalışmalara güç vermek için gereken farelerin sayısı, idrara "kendiliğinden" UPEC ortaya çıkma oranından da etkilenir (ortalama %12-14). Son olarak, farklı fare suşları, hücre içi rezervuar oluşumuna karşı kronik bakteriüri geliştirme eğilimine sahiptir42,43. Bu modelde C57BL/6 dışındaki fare suşları kullanılıyorsa, hayvanların sessiz UPEC hücre içi rezervuarlar geliştirdiği doğrulanmalıdır.

Protokol

Washington Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), 06/09/2020 tarihinde sona eren 20170081 ve 18.03.2023 tarihinde sona erecek olan 20-0031 numaralı protokollerin bir parçası olarak tüm fare enfeksiyonlarını ve prosedürlerini onayladı. Hayvanların genel bakımı, Ulusal Araştırma Konseyi'nden Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu ve USDA Hayvan Bakımı Kaynak Kılavuzu ile tutarlıydı. Ötenazi prosedürleri, Hayvanların Ötenazisi için AVMA Kılavuzları: 2020 Baskısı ile tutarlıdır.

figure-protocol-1
Şekil 1. Fare Modelinin Şeması. Zaman çizelgesi, protokolde özetlenen modelin aşamalarını veya prosedürlerini yansıtacak şekilde vurgulanır. Faz 1 (turuncu): Hücre içi UPEC rezervuarlarının kurulması. Fareler transüretral olarak UPEC ile aşılanır ve idrar örnekleri toplanır ve bakteriürinin temizlenmesi için izlenir. Sadece bakteriüriyi temizleyen fareler sonraki aşamalara ilerler. Faz 2 (yeşil): G. vajinalise mesane maruziyeti. Fareler transüretralal olarak G. vaginalis ile iki kez aşılanır. İki sıralı pozlama arasındaki süre, istenen aşağı akış analizine bağlı olarak 12 saat (üst panel) veya 1 haftadır (wk; alt panel). Faz 3 (sarı): UPEC rİYE. İdrar, G. vaginalis maruziyetini takiben günlük olarak toplanır ve UPEC bakteriürisi açısından izlenir. Ek olarak, mesaneler ve böbrekler UPEC doku titrelerini ölçmek için deneysel son noktada toplanabilir. 1 wk maruz kalma modelinde, UPEC'in hücre içi rezervuarlardan G. vajinalis kaynaklı ortaya çıkışı ve ardından idrar yolundan temizlenmesi de UPEC mesane dokusu titrelerindeki azalmaya yansır (PBS'ye maruz kalan farelere kıyasla, bkz. Şekil 3D). Mesane titrelerindeki bu azalma, 12 saatlik maruz kalma modelinde belirgin değildi, çünkü muhtemelen doku titrelerini önemli ölçüde azaltmak için yeterli rezervuar ortaya çıkması ve klirensinin gerçekleşmesi için daha fazla zamana ihtiyaç vardır. Prosedür A: İdrar sitolojisi, akut UPEC enfeksiyonunu incelemek için Faz 1 sırasında ve Faz 3 sırasında, UPEC ortaya çıkışı ile ilişkili idrar PMN içeriğini değerlendirmek için tipik olarak 1 dpi (veya daha önce) gerçekleştirilir. Diğer zaman noktalarında toplanan idrar örnekleri benzer şekilde analiz edilebilir. Prosedür B: Ürotelyal pul pul dökülmeyi incelemek için mesane taramalı elektron mikroskobu (SEM) tipik olarak 12 saatlik modelde ikinci G. vajinalis maruziyetinden 3 saat sonra (0. sırada ilk maruziyetin uygulanmasından 15 saat sonra) gerçekleştirilir. Faz 1'de gösterildiği gibi UPEC aşılamasından 6-24 saat sonra olduğu gibi diğer zaman noktaları da değerlendirilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Farelerde UPEC sessiz hücre içi rezervuarlar oluşturun

  1. İdrar kateterleri hazırlayın (bu adımın videoları için 44,45,46,47'ye bakın).
    1. İplik 30 İğne tabanından iğne ucunun birkaç mm ötesine uzanan PE10 boru uzunluğuna sahip ölçer iğneleri. Boruyu iğne ucuyla delmemeye dikkat edin. Alternatif olarak, pediatrik intravenöz kanül46 kullanın.
    2. Hazırlanan kateterleri bir petri kabına yerleştirin ve en az 30 dakika UV ışığı ile sterilize edin. Petri kabı kapağını değiştirin ve ihtiyaç duyulana kadar saklamak için sabitleyin.
  2. UPEC inokulumunu hazırlayın (Gün -3 ila 0)
    1. Gün -3: UTI89kanR'yi -80 °C dondurucu stoğundan Luria-Bertani (LB) agar plakasına yerleştirin. Plakayı 18-24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.
      NOT: İnokulum büyüme ortamına kanamisin eklemek gerekli değildir, çünkü kanamisin direnci UTI89kanR'ye stabil bir şekilde entegre edilmiştir.
    2. Gün -2: Tek bir UTI89 kanR kolonisi ile steril bir 125 mL şişede 20 mL LB suyuaşılayın. Daha küçük bir şişe kullanmayın, çünkü bu kültür yöntemi, mesane yapışması için gerekli olan UPEC tip 1 pilusunun ekspresyonunu indüklemek için önemlidir.
    3. 18-24 saat boyunca 37 °C'de statik olarak (sallanmadan) inkübe edin. Büyüme ortamına antibiyotik eklemeyin. Sıvı kültürleri başlatmak için sadece LB plakalarında (18-24 saat eski) taze koloniler kullanın.
    4. Gün -1: Alt kültür UTI89kanR, 20 μL kültürü çıkararak (yerleşmiş bakterileri yeniden askıya almak için şişeyi yavaşça döndürün) ve steril bir 125 mL şişede 20 mL taze LB suyuna ekleyerek. 18 saatlik bir firma süresi hariç, adım 2'deki gibi inkübe edin. Büyüme ortamına antibiyotik eklemeyin.
    5. 0. Gün: Tüm kültürü 50 mL'lik bir tüpe aktarın ve 3200 × g'de bir masa üstü santrifüjde 10 dakika boyunca pelet bakterilerine döndürün. Süpernatantı aspire edin ve bakteriyel peleti 10 mL PBS'de yeniden askıya alın.
    6. Bir küvete 4. adımdan 900 μL'ye kadar PBS'nin 100 μL'sini konsantre bakteri süspansiyonu ekleyin ve PBS ile boşaltılmış bir spektrofotometre kullanarak 600 nm'de (OD600) optik yoğunluğu belirleyin. Süspansiyonun OD 600'ünü (OD süspansiyonu) belirlemek için spektrofotometre değerini10 ile çarpın (seyreltmeyi hesabakatmak için).
    7. 50 μL'de istenen 1 x 107 CFU inokülum konsantrasyonunu elde etmek için, istenen OD inokulumun 0.35 olduğu (diğer UPEC suşları için değer değişebilir) ve Y'nin gerekliinokulum hacmi olduğu aşağıdaki denklemi kullanarak UTI89kanR süspansiyonunu seyreltin (veya konsantre edin):
      X mL x ODsüspansiyon = Y mL x ODinokulum
      Örneğin, ODsüspansiyon değeri 4.7 ise ve 5 mL inokülum gerekiyorsa:
      X mL × 4.7 = 5 × 0.35
      X = (5 × 0,35) / 4,7
      X = 0.372 mL
      Bu nedenle, 5 mL (son hacim) yapmak için 372 μL bakteriyel süspansiyon ekleyin
    8. 96 delikli bir plakada steril PBS'de inokülumun 1:10 seri seyreltilmesini 10-6'ya çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Spot beş 10 μL, 6 seyreltmenin tümünü bir LB ve LB + kan plakasına çoğaltır, lekelerin kurumasını sağlar ve gece boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Antibiyotiksiz LB plağı, inokulumun başka bir organizma tarafından kontamine olmamasını sağlamak için kullanılır (bu, kan antibiyotik seçim plakasında bulunmayan ek bir koloni morfolojisi olarak görünecektir). Her iki plaka tipi de aynı sonucu vermelidir.
      NOT: Plakalar, kullanımdan bir gün önce tezgahın üzerinde kurumaya bırakılmalıdır, böylece kaplanmış sıvıyı lekeler birleşmeden emeceklerdir.
    9. Seyreltmenin tüm noktalarındaki toplam koloni sayısını ayırt edilebilir kolonilerle sayın ve her deneyde kullanılan gerçek inokülum dozunu hesaplamak için değeri kullanın. Sadece OD600 değerlerine güvenmeyin.
  3. UTI89kanR'yi anestezi uygulanan dişi farelerin mesanelerine aşılamak (0. Gün)
    NOT: Bu prosedürün video kayıtları daha önce44,46 oranında yayınlanmıştır. Daha kapsamlı bir açıklama için bu makalelere bakın. Fare kateterizasyonu hakkında daha fazla ayrıntı için bu protokolün 5. bölümüne bakın.
    1. IACUC onaylı yöntemlere göre izofluran inhalasyonu ile fareleri anestezi altına alın.
    2. Farelerin anestezi almasını beklerken, tüberkülin şırıngasını UTI89kanR inokulumu ile doldurun ve ardından hazırlanmış bir kateter yapıştırın. Kateterdeki havayı boşaltmak için pistonu bastırın, ardından kateteri steril cerrahi kayganlaştırıcıya batırın.
    3. Fareyi sırt üstü konumlandırın ve fare ayak tabanını sıkıca sıkarak ve refleks veya yanıt olmadığını gözlemleyerek anesteziyi onaylayın. Mesanenin (alt karın bölgesinde bezelye gibi hissedilir) her elin işaret parmakları arasında yerini belirleyin. Mesanesine hafif bir sıkma basıncı uygulamak için parmaklarınızı birbirine doğru hareket ettirerek idrarı ifade edin.
    4. Kateteri fare üretrasından mesaneye yerleştirin ve yavaşça 50 μL inokülum verin.
    5. Birkaç saniye bekleyin ve ardından doğrudan dışarı çekerek kateteri yavaşça çıkarın. Fareyi kafesine geri döndürün ve anesteziden iyileşene kadar izleyin.
    6. 1.3.1 - 1.3.5 adımlarını ek farelerle tekrarlayın, kateteri her kafes (5 fare) arasında değiştirin. İstenirse, aynı prosedür PBS ile bir kontrol grubu fareyi aşılamak için kullanılabilir, örneğin başka bir G. vaginalis suşu rİYE'yi ortaya çıkarır (spontan / arka plan seviyesi üzerinden).

2. UPEC bakteriürisinin temizlenmesinin izlenmesi (Gün 1 ila 28)

NOT: İdrar toplama prosedürünün videosu daha önceyayınlanmış 44.

  1. Mesane palpasyonu ile tüm farelerden idrar (en az 10 μL) toplayın, 44 d sonrası enfeksiyon sonrası 44 ve haftalık 4 wk (7,14 , 21 ve 28 d enfeksiyon sonrası) olarak tanımlandığı gibi. UPEC enfeksiyonunu izlemek için idrar toplandıktan sonraki birkaç saat içinde kültüre alınmalıdır. İdrarı kaplanana kadar 4 ° C'de saklayın. İdrar ayrıca sitoloji için de kullanılabilir (bakınız Bölüm 4). Bazen mesane çok iltihaplıysa, 10 μL idrar elde edilemez; Bu durumda PBS 10 μL'ye kadar eklenebilir, ancak idrar bakteri titresi ve sitoloji skorları buna göre ayarlanmalıdır (örneğin, sadece 5 μL idrar toplanırsa ve 5 μL PBS eklenirse, titreleri ve puanları 2 ile çarpın).
  2. Çok kanallı pipetle, 96 delikli bir plakada steril PBS'de 1:10 seri seyreltmeler yaparak 10-6'ya kadar yapın. İlgili antibiyotik seçim işaretleyicisini içeren bir LB plakasının sol kenarındaki dikey yönde sütun 1'deki 6 seyreltmenin 10 μL'sini tespit etmek için P10 çok kanallı pipet kullanın. İpuçlarını atın.
  3. Kaplamayı kalan numunelerle tekrarlayın (sütun 2, sonra sütun 3, vb.). Tek bir plaka 5 numuneyi yan yana barındırabilir. Bu, 5 × 6 nokta matrisine sahip, yukarıdan aşağıya doğru artan seyreltmeler ve soldan sağa artan numune sayıları ile bir plaka üretir (Şekil 2A).
  4. Lekelerin tezgah üstünde kurumasına izin verin, ardından gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Ertesi gün, kolonilerin farklı olduğu en az seyreltilmiş noktadaki kolonilerin sayısını sayın (Şekil 2B) ve CFU / mL'yi hesaplamak için bu sayıyı kullanın:
    Tek idrarda koloni sayısı nokta × seyreltme faktörü × 100 = CFU/mL idrar
  5. Grafik yazılımı kullanarak UTI89kanR idrar titrelerini çizin (Şekil 2C). 28 d'de idrarda saptanabilir UTI89kanR bulunmayan fareleri tanımlayın (C57BL / 6 farelerin ~% 65-80'i). Bu fareler sessiz hücre içi rezervuarları barındırır ve tekrarlayan İYE'nin indüksiyonunu incelemek için sonraki deneysel aşamada kullanılır. İdrarda 28 d'de bakteri olanlar sonraki adımlara dahil edilmez.

3. G. vajinalis mesane maruziyeti

  1. Fareleri maruz kalma gruplarına atayın (29. Gün). Bu adımın temel amacı, daha uzun süreli bakteriürisi olan tüm farelerin aynı maruz kalma grubunda bir arada bulunmasını önlemektir, çünkü bunun rİYE olasılığını etkileyip etkilemediği bilinmemektedir.
    1. İdrar CFU verilerini kullanarak (Şekil 2D), fareleri UTI89kanR bakteriürisinin artık tespit edilemediği zaman noktasına göre kategorize edin (Şekil 2E).
    2. Her kategorideki fareleri G. vaginalis veya PBS aşılama gruplarına randomize edin; Örneğin, 7. günden önce temizlenen farelerin yarısı G. vaginalis'i alır ve yarısı PBS alır; 8. ve 14. günler arasında temizlenen farelerin yarısı G. vajinalis alacak ve yarısı PBS vb. alacaktır ( Şekil 2E'de olduğu gibi).
  2. G. vaginalis inoculum'u hazırlayın (anaerobik bir odada gerçekleştirilen tüm adımlar)
    NOT: İdeal kültür inkübasyon süreleri, G. vaginalis'in farklı suşları arasında değişir, bazı suşlar durağan faza girer ve hatta diğerlerinden daha hızlı ölmeye başlar. Bu, öldürülen G. vajinalis'in (JCP8151B) rUTI39'u tetikleyemediği göz önüne alındığında özellikle önemlidir. Bu nedenle, kuluçka süreleri, farelerde deneyler yapmadan önce belirli bir suş için ampirik olarak belirlenmelidir. G. vaginalis'in diğer/tüm suşlarının bu modelde aynı etkileri tetikleyip tetiklemeyeceği bilinmemektedir.
    1. Streak G. vaginalis, -80 °C dondurucu stoğundan bir NYCIII plakasına (antibiyotiksiz) suşlar. Plakayı 37 ° C'de 24 saat boyunca anaerobik olarak inkübe edin.
    2. Anaerobik odada, NYCIII plakasından 5 mL anaerobik NYCIII ortamını 1 μL döngüsel hücre (tek bir koloni yetersizdir) ile aşılayın ve kültürü 18 saat boyunca anaerobik koşullar altında 37 ° C'de statik olarak inkübe edin. Büyüme ortamına antibiyotik eklemeyin.
  3. Bir spektrofotometre kullanarak kültürün OD600'ünü belirleyin.
    1. 1 dakika boyunca 9600 × g'da tanımlanmış bir kültür hacmini (X) santrifüj edin ve ortamı aspire edin. Aşağıdaki denklemi kullanarak 50 μL'de 108 CFU'ya ulaşmak için istenen inokülum OD'yi elde etmek üzere peleti yeniden askıya almak için PBS'nin hacmini (Y) hesaplayın:
      X mL × ODkültürü = Y mL × Y için ODinokülum çözümü
      Y = (X ml × ODkültürü) / ODinokulum
      NOT: JCP8151BSmR için ODinokulumu 5'tir, ancak bu diğer G. vaginalis suşları için ampirik olarak belirlenmelidir. Örneğin, OD kültürü = 2.0 ile bir JCP8151B SmR gecelik sıvıkültürünün 3mL'sini eğiriyorsanız: Y = (3 mL × 2.0) / 5.0; bu nedenle peleti 1,2 mL PBS'de yeniden askıya alın
    2. PBS'deki bakteriyel peleti istenen konsantrasyona kadar yeniden askıya alın. Her deneyde kullanılan gerçek inokülum dozunu belirlemek için inokulumu (yukarıdaki CFU kaplama protokolünde açıklandığı gibi) seri olarak seyreltin ve plakalayın. Sadece OD değerlerine güvenmeyin.
  4. UPEC aşılamasını takip eden 29-31. günlerde, yukarıdaki adım 1.3'te açıklandığı gibi anestezi uygulanan fareleri G. vaginalis veya PBS ile aşılayın. Bir PBS kontrol grubu gereklidir, çünkü mesanenin kateterize edilmesi eylemi, bir dereceye kadar UPEC rezervuarının yeniden ortaya çıkmasına neden olabilecek hasara ve ürotelyal pul pul dökülmeye neden olabilir. PBS ile aşılanmış fareler bu nedenle G. vaginalis-aşılanmış farelerin karşılaştırıldığı kontrol görevi görür.
    NOT: 28 d'de nihai UPEC bakteriüri tayini, CFU plakasının gece boyunca inkübasyonunu gerektirir. Bu nedenle, bu adımın gerçekleştirilebileceği en erken adım, ilk UPEC aşılamasından sonraki 29 gündür. Gerekirse, maruz kalma 31. güne kadar verilebilir. Araştırmacılar deneyler arasında tutarlı olmalıdır.
  5. İlk aşılamadan sonra 12 saat veya 1 wk gibi istenen zaman noktasında ikinci bir G. vaginalis (veya PBS kontrolü) aşılaması uygulamak için inokulum preparatını tekrarlayın. İkinci bir maruz kalma gereklidir, çünkü G. vaginalis ile tek bir aşılama önemli UPEC ortaya çıkmasına neden olmaz39.

4. UPEC tekrarlayan İYE'nin izlenmesi

  1. Her G. vaginalis aşılamasını takiben farelerden istenen zaman noktalarında idrar toplayın (aşılama sonrası 1, 2 ve 3 d önerilir).
    1. UTI89kanR CFU / mL'yi belirlemek için seçici plakalarda (örneğin, LB + kanamisin) seri olarak seyreltin ve plaka idrarı. İstenirse, idrar seyreltmeleri G. vaginalis CFU / mL'yi belirlemek için seçici plakalara (örneğin, NYCIII + 1 mg / mL streptomisin) de kaplanabilir. Bununla birlikte, G. vaginalis JCP8151BSmR, çoğu farenin idrarından 12 saat 39 ile temizlendi. Bu nedenle, çoğu farede G. vaginalis'i tespit etmek için daha erken zaman noktaları gerekli olacaktır.
  2. Deneysel bitiş noktasında (örneğin, ikinci G. vaginalis aşılamasından sonra 3 d), fareleri onaylanmış yöntemlere göre (örneğin, izofluran anestezisi veya CO2 inhalasyonu altında servikal çıkık) feda edin ve daha önce tarif edildiği gibi CFU sayımı için mesane ve böbrekleri toplayın 44,46.

5. İdrar sitolojisi

NOT: Bu prosedür, idrarda bulunan hücrelerin ve / veya bakterilerin görselleştirilmesinin istendiği herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Şekil 1'de belirtildiği gibi, idrar sitolojisi tipik olarak akut UPEC enfeksiyonunu incelemek için Faz 1 sırasında ve Faz 3 sırasında UPEC ortaya çıkışını gösteren idrarlarda polimorfonükleer (PMN) hücrelerin varlığını değerlendirmek için 1 dpi'de (veya daha önce) gerçekleştirilir.

  1. Bağlı filtre ve slayt ile bir sitohuni kasetinde 90 μL PBS'ye 10 μL idrar ekleyin. (En basit yöntem, idrar kültürü için kullanılan 96 delikli plakadan 1:10 seyreltmenin geri kalanını kullanmaktır; Bu örnekler, 4 ° C'de saklanırsa, idrar kültürlenmesinden sonra 24 saate kadar kullanılabilir). Kasetleri sito-santrifüje yerleştirin ve yüksek ivmelenme ile 6 dakika boyunca 600-800 x g'de döndürün.
  2. Slaytları çıkarın ve gece boyunca kurumaya bırakın. Ertesi gün, üreticinin protokolüne göre bir hematoloji boyama kiti (örneğin, Wright'ın, Giemsa, fiksatif dahil) ile lekeleyin.
  3. PMN'lerin ve epitel hücrelerinin varlığı için slaytları ışık mikroskobu ile analiz edin. İstenirse, bunlar her yüksek güçlü görüş alanında bulunan her hücre tipinin bolluğuna dayanan nitel bir puanlama metriği kullanılarak puanlanabilir (örneğin, 0 = hiçbiri, 1 = az, 2 = orta, 3 = sağlam). Slaytları analiz eden bireyin, potansiyel önyargıyı en aza indirmek için deney gruplarına kör olduğundan emin olun.

6. Taramalı elektron mikroskobu ile mesanelerin görüntülenmesi

NOT: Bu prosedür, ürotelyumun görselleştirilmesinin istendiği herhangi bir zaman noktasında gerçekleştirilebilir. Şekil 1'de (mor kutular) belirtildiği gibi, UPEC-ürotelyal etkileşimler, rezervuar oluşum aşamasında UPEC aşılamasından 6 saat ila 24 saat sonra en iyi şekilde görselleştirilir ve G. vajinalis tarafından tetiklenen ürotelyal peeling, ikinci G. vajinalis maruziyetinden sonra 3 saat ile 12 saat arasında en iyi şekilde görselleştirilir.

  1. In situ mesane fiksasyonu
    1. Mesane hasadından hemen önce, pH 7.4'te 2 mM CaCl 2 ile 0.15 M sodyum kakodilat tamponuna glutaraldehit (% 2.5 nihai) ve paraformaldehit (%2 nihai) ekleyerek fiksatif hazırlayın. Yeni açılan cam ampullerden paraformaldehit ve glutaraldehit kullanın, çünkü her iki fiksatif de açılan kaplarda zamanla oksitlenir.
      DİKKAT: Glutaraldehit toksiktir, solunum tahriş edici ve aşındırıcıdır; paraformaldehit yanıcı, kanserojen, tahriş edici ve üreme toksinidir; sodyum kakodilat toksik ve kanserojendir.
    2. 50 mL fiksatif çözelti yapmak için, 4 mM CaCl 2 ile pH 7.4'te 0.3 M'lik bir sodyum kakodilat çözeltisine 6.25 mL% 16 paraformaldehit,% 50 glutaraldehit ve 16.75 mL ultra saf suekleyin.
    3. Mesanelere uygulamadan önce hazırlanan fiksatifi 37 ° C'ye ısıtın.
    4. Tüberkülin kayma ucu şırıngasını fiksatif ile doldurun ve sonuna bir kateter yapıştırın, eğim şırınga işaretlerinin karşısına bakar. İğne ucunu açığa çıkarmamaya dikkat ederek fazla boruyu iğnenin ucundan 1-2 mm çıkarın. Kabarcıkları çıkarmak için şırıngayı hafifçe vurun ve pistonu havayı boşaltmak için itin ve uygun şekilde bertaraf için herhangi bir fiksatif toplamak için kateteri bir mikrosantrifüj tüpü üzerine fiksatif ile doldurun.
    5. Onaylanmış bir yöntem kullanarak fareyi uyuşturun ve feda edin (örneğin, anestezi altında servikal çıkık). Fareyi diseksiyon yüzeyine bacakları sabitlenmiş olarak (lastik bantlar veya pimlerle) yerleştirin. Mesaneyi açığa çıkarmak için fare pelvik bölgesini forseps ve bir çift cerrahi makasla açın. Bitişik yağı dikkatlice bir kenara itin, ancak mesaneyi yerinde bırakın.
    6. Şırıngayı baskın elinizle iğne aşağı bakacak şekilde ve iğne eğimi ve şırınga işaretleri sizden uzağa bakacak şekilde tutun. Kateter ucunu steril yağlayıcıya batırın.
    7. Kateter ucunu üretral açıklığa yerleştirin, şırınga namlusunu fare gövdesi üzerinde 30-45° açıyla uzağa yerleştirin.
    8. Uçla birlikte saat yönünde çok küçük bir hareket kullanarak aşağı doğru basınç uygulayın ve kateteri yavaşça üretraya yerleştirin. Kateter ucu üretraya girerken, şırınga namlusu çalışma yüzeyine paralel olana kadar kateteri üretraya doğru kaydırmaya devam ederken şırıngayı farenin kuyruğuna doğru menteşeleyin. Tüm kateter iğne mili (taban hariç) fareye girmeli ve kateter ucunu mesane lümeni içine yerleştirmelidir.
    9. Yavaşça 50-80 μL fiksatif verin ve mesanenin bir balon gibi şişmesine neden olun. Kateteri yerinde tutun ve şırıngayı hafifçe kaldırın, ucu yukarı doğru eğin.
    10. Öte yandan, bir hemostat açın ve üretranın kesiştiği noktada kateter iğnesinin altında bir çatalı kaydırın. Sadece iğne ile temas edene kadar hemostatı kısmen kapatın.
    11. Fiksatif kaybını önlemek için kateter iğnesini nazikçe mesaneden dışarı kaydırırken, aynı anda hemostatı tamamen sıkıştırın ve kilitleyin.
    12. Hemostatı, mesanenin üstünde durduğu çalışma yüzeyine paralel olacak şekilde tutun. Mesaneyi hemostat hala bağlıyken çıkarmak için hemostatın altında (mesanenin karşı tarafı) yavaşça ve dikkatlice kesin.
    13. Mesaneyi ve bağlı hemostatı, ısıtılmış fiksatif içeren bir Falcon tüpüne yerleştirin. Mesanenin sıvıya tamamen batırıldığından ve tüpün duvarlarına bastırılmadığından emin olun. 24 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin.
  2. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile mesane işleme ve görüntüleme
    1. Mesaneyi temizlenmiş, çift taraflı bir tıraş bıçağı ile Sagittal olarak ikiye bölün ve mesaneyi serbest bırakmak için hemostata teğetsel olarak ikinci bir kesim yapın. Bu, 2 yarım mesane "bardağı" ile sonuçlanır. Mesanenin dış kısmında kalan yağ yastıkları varsa, yavaşça çıkarın.
    2. Mesaneyi yarıya indirin (her biri 10 dakika) sodyum kakodilat tamponunda (0.15 M, pH 7.4).
    3. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca 0.15 M kakodilat tamponunda %1 ozmiyum tetroksit ile dokuyu lekeleyin. Osmiyum ışığa duyarlıdır; bu nedenle, karanlık bir ortamı korumak için bu adımı folyoya sarılmış boyama kabı ile gerçekleştirin.
      DİKKAT: Osmiyum tetroksit toksiktir ve cilt için aşındırıcıdır. Bu adımı duman başlığında eldivenlerle yapın.
    4. Mesane yarıya incelti, ultra saf suda üç kez (her biri 10 dakika) durulayın. Bu adımlar sırasında, somiküle yağ bazen su yüzeyinde görülebilir. Kurutma adımları sırasında kontaminasyonu önlemek için bunu aspire edin veya fitilleyin.
    5. Her biri 10 dakika boyunca derecelendirilmiş bir etanol serisine (50, 70, 90, 100 ve% 100) batırılarak dokuları kurutun.
    6. Sabit dokuyu en düşük hızda 12 CO2 değişimi gerçekleştiren kritik noktalı bir kurutucu kullanarak kurulayın. Hızlı olarak ayarlanan havalandırma adımı hariç tüm ek ayarları yavaş olarak ayarlayın.
    7. Daha verimli kaplama için numunenin eğriliğini azaltmak, SEM'de görüntüleme kolaylığı sağlamak ve kurutma sırasında kıvrılmış olabilecek dokuyu açığa çıkarmak için toplam 4 parça üretmek üzere her bir mesaneyi temiz bir çift taraflı tıraş bıçağı ile tekrar ikiye bölün.
    8. Mesane parçalarını alüminyum saplama üzerindeki iletken bir karbon yapıştırıcı tırnağına yapıştırın ve aşırı yapıştırıcının mesanenin iç yüzeyine karışmasını önlemeye özen göstererek bir kürdan ile alt temasın etrafına az miktarda gümüş yapıştırıcı boyayın.
    9. Numune saplamalarını 6 nm iridyum ile püskürtmek için yüksek vakumlu bir püskürtücü kaplayıcı kullanın. Numuneler şarj olmaya devam ederse, yüzeye gümüş boya ile iletken bir yol boyandığından emin olun ve ilave 4 nm iridyum ile kaplanın.
    10. Örnekleri taramalı elektron mikroskobu ile görüntüleyin. Koşullar kullanılan mikroskopa bağlı olarak değişebilse de, Everhart-Thornley (SE2) elektron dedektörü kullanılırken 200 pA'lık bir ışın akımı ve 12-13 mm'lik bir çalışma mesafesi ile 3 KeV'lik bir hızlanan voltaj, bir Zeiss Merlin FE-SEM üzerinde iyi çalıştı.

Sonuçlar

Aşılamayı takiben, idrarda UPEC titreleri saptanabilir (Şekil 2B). İdrar örneklerinin kanamisin içeren seçici ortamlar üzerinde plakalanmaması, muhtemelen idrarı kirleten endojen fare mikrobiyotasının aşırı büyümesine neden olacaktır. UPEC bakteriüri seviyesi muhtemelen 1. günde yüksek olacaktır ve daha sonraki zaman noktalarında azalmadan önce ilk hafta boyunca artabilir (Şekil 2C). Farelerin yaklaşık% 65-80'inde idrarda 28 dpi ile saptanabilir UPEC olmayacaktır (Şekil 2C, yeşil daire). Bu fareler modelin sonraki adımlarında kullanılabilir. Bakteriyik kalan fareler (Şekil 2C, kırmızı elips) deneyden çıkarılmalıdır.

12 saat (Şekil 3A) veya 1 wk aralıkla verilen iki ardışık G. vaginalis maruziyeti (Şekil 3B), tekrarlayan bakteriüriye neden olmak için hücre içi rezervuarlardan UPEC'in ortaya çıkmasına neden olur. Hem UPEC bakteriüri seviyesi (Mann-Whitney testi) hem de UPEC rUTI (Fisher'ın kesin testi) gösteren farelerin fraksiyonu, PBS kontrol grubuna kıyasla G. vajinalise maruz kalan farelerde anlamlı derecede yüksektir. İdrar sitolojisi analizi, UPEC ortaya çıkışını gösteren G. vaginalis'e maruz kalan farelerden idrardaki PMN'leri tespit eder (Şekil 3C). 1 wk arayla verilen iki maruziyetli modelde, mesane dokusundaki UPEC titreleri, muhtemelen UPEC'in rezervuarlardan ortaya çıkması ve daha sonra temizlenmesi nedeniyle, PBS'ye kıyasla G. vajinalise maruz kalan farelerde daha düşüktür (Şekil 3D).

In situ sabit mesane dokusunun SEM ile görselleştirilmesi, sadece PBS'ye maruz kalan kontrol farelerinde mesane yüzeyini kaplayan büyük yüzeysel şemsiye ürotelyal hücreleri ortaya koymaktadır (Şekil 4A). Ürotelyal peeling, yüzeysel şemsiye hücrelerinin kaybı ile kanıtlanmıştır ve G. vaginalis'e maruz kalan farelerde daha küçük altta yatan transizyonel epitel hücrelerini ortaya çıkarmaktadır (Şekil 4B). Hücre içi rezervuarların kurulması sırasında UPEC aşılamasından erken sonra, UPEC ürotelyum üzerinde görülür ve peeling hücrelerinden filamentlenir (Şekil 4C).

figure-results-1
Şekil 2. Faz 1 sırasında idrardaki UPEC titrelerinin izlenmesi (rezervuar oluşumu). (A) Koloni oluşturan birimlerin (CFU) kaplamasının şeması. (B) UPEC titrelerinin idrarda LB + kanamisin üzerindeki temsili görüntüsü. Siyah daireler, CFU / mL'yi hesaplamak için sayılması gereken idrar örneği lekelerini gösterir. (C) C57BL/6 farelerde UPEC bakteriürisinin zaman seyri. Her çizgi, zaman içinde UPEC idrar titrelerini izleyen ayrı bir fareyi temsil eder. Noktalı çizgi, algılama sınırını gösterir (1000 CFU/mL). Kırmızı elips, UPEC bakteriürisini çözemeyen ve bu nedenle G. vaginalis'in neden olduğu rUTI modeli için kullanılmayacak dört fareyi (20 üzerinden) gösterir. Tersine, yeşil daire UPEC bakteriürisini çözen ve sonraki aşamalara ilerleyen fareleri gösterir. (D) C. panelinde grafik oluşturmak için kullanılan veri tablosu Sarı, algılanabilir CFU; yeşil, CFU yok. (E) UPEC CFU'nun artık idrarda tespit edilmediği zaman noktasına göre farelerin maruz kalma gruplarına randomizasyonu ("Gün çözüldü"). Panel D'nin sol sütunundaki fare numaraları, panel E'de verilen fare numaralarıyla aynıdır.

figure-results-2
Şekil 3. G. vajinalis UPEC rİYE'yi tetikler. PBS (daireler) veya G. vaginalis'e (Gvag; kareler) iki ardışık idrar yolu maruziyetini takiben idrarda UPEC titreleri, 12 saat (A) veya 1 wk (B) aralıklarla verilir. Her sembol ayrı bir fareyi temsil eder. İkinci pozlamayı takiben her fareden 1-3 d arasında tespit edilen en yüksek CFU / mL UPEC çizilir. Saptanabilir bakteriürisi olmayan fareler, tespit sınırında (noktalı çizgi) çizilir. (C) UPEC (ok uçları) ve polimorfonükleer (PMN) hücreleri (oklar) gösteren idrar sitolojisi analizi. Ölçek çubuğu = 20 μm. (D) Mesane dokularındaki UPEC titreleri, 1 wk arayla verilen iki ardışık idrar yolu maruziyetini takiben 3 d topladı. Her sembol farklı bir fareyi temsil eder ve sıfırlar algılama sınırında (noktalı çizgi) çizilir. A, B ve D'de, kutular medyan işaretli ve bıyıkları min'den maksimuma kadar bıyıklarla birinci ve üçüncü çeyrektedir<. ** P < 0,01; P < 0.0001. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-results-3
Şekil 4. Mesanelerin SEM analizi in situ olarak sabitlenmiştir. Mesaneler, PBS (A) veya G. vaginalis'e (C) iki maruziyetten (12 saat arayla) 3 saat sonra farelerden toplandı. Noktalı çizgiler, G. vajinalise maruz kalan mesanelerde daha küçük olan tek bir idrar epitel hücresini göstermektedir, çünkü büyük yüzeysel hücreler pul pul dökülerek altta yatan transizyonel epiteli ortaya çıkarmıştır. (B) Mesane, UPEC ile ilk aşılamadan 6 saat sonra, modelin 1. Aşaması sırasında, ürotelyal peeling ve hücre dışı UPEC gösterdi. (D) Mesane yüzeyinde bulunan çözünmez yağ damlacıkları örneği. Ölçek çubukları ana görüntülerde 20 μm ve girişte 2 μm'dir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışma

Birincil İYE fazı sırasında UPEC bakteriürisini temizlememiş fareleri tanımlamak için bu modeldeki ilk kritik adım. Bu fareler, G. vaginalis'e maruz kaldıktan sonra UPEC bakteriüri oranlarını karıştıracakları için deneyden çıkarılmalıdır. İlk UPEC aşılamasından sonra, bakteriyel klirensi izlemek için haftalık olarak idrar toplanmalıdır. C57BL / 6 farelerinin yaklaşık% 65-80'i 4 hafta içinde bir İYE89kanR enfeksiyonunu temizleyecektir. Diğer inbred fare suşları, UPEC klirensi42,43 ve rezervuar oluşumu için farklı eğilimlere sahiptir ve bu nedenle bu model için uygun olmayabilir. İkinci kritik nokta, ampirik çalışmaların, sadece PBS'ye maruz kalan kontrol farelerinde meydana gelen arka plan spontan ortaya çıkışının üzerinde önemli rezervuar ortaya çıkışını tetiklemek için iki ardışık G. vaginalis aşısının (12 saat veya 1 wk arayla) gerekli olduğunu belirlemesidir. İki ardışık maruziyet arasındaki diğer süreler test edilmemiştir, ancak benzer sonuçlar verebilir. UPEC mesane titrelerinde bir azalmanın sadece G. vajinalis maruziyetlerinin39 wk arayla 1 wk verildiği modelde gözlendiğini belirtmek önemlidir. İkiden fazla maruziyet uygulanabilirken, ampirik kanıtlar tek başına tekrarlanan kateterizasyonun ortaya çıkışı arttırdığını, bu da sonuçların yorumlanmasını karıştırabileceğini veya maruz kalma grupları ve kontroller arasındaki farklılıkları ayırt etmek için daha fazla sayıda hayvan gerektirebileceğini göstermektedir. Son olarak, in situ mesane fiksasyon yönteminin birkaç kritik adımı vardır. Fiksatifin kelepçeli mesanelerin içinde kalmasını sağlamak için bazı beceriler gereklidir. Sönük mesanelerin SEM tarafından görüntülenmesi daha zor olacaktır. Fiksatifin mesaneye aşılanması sırasında çok nazik olmak da önemlidir, çünkü ürotelyumun fiksatif içeren kateter ile kazınması, G. vaginalis tarafından tetiklenenlerden bağımsız olarak ürotelyal pul pul dökülmeye neden olabilir. Fiksatif kokteylde belirtilen tüm konsantrasyonlar nihai konsantrasyonlardır. Bunların yanlış oranları, hücrelerin yetersiz sabitlenmesine ve şişmesine veya büzülmesine neden olabilir. Fiksatörler, hücrelerde ve dokularda sıcaklık şokunu önlemek için fizyolojik sıcaklıklara ısıtılmalıdır. Isınma ayrıca fiksatiflerin plazma membranlarından difüzyon hızında hafif bir iyileşme sağlar. SEM analizi için hazırlanan numuneler için osmiyum boyama sıklıkla ihmal edilebilirken, bu protokolde lipitleri stabilize etmek ve kritik nokta kurutma sırasında hücresel membranların çatlamasını önlemek için önemli bir adımdır.

Bu protokol, diğer UPEC ve / veya G. vaginalis suşlarını sırasıyla rezervuar oluşturma ve ortaya çıkmalarını tetikleme yetenekleri açısından test etmek için değiştirilebilir. Diğer vajinal bakterilere (örneğin, Lactobacillus crispatus PVAS100) maruz kalma veya ısıda öldürülen G. vaginalis, hiçbiri bu modelde patoloji göstermeyen diğer deneysel faktörler de eklenebilir39. Test edilecek diğer bakteri suşlarını seçerken, tüm deneylerde standart bir inokülum konsantrasyonunun kullanılabileceği şekilde tutarlı bir büyüme göstermek önemlidir. JCP8151BSmR'nin büyümesi anaerobik bir odada optimize edilmiştir. Bu suş muhtemelen anaerobik bir GasPak sisteminde yetiştirilebilir, ancak bu, sağlam bakteri büyümesini sağlamak için optimizasyon gerektirir. Son olarak, modeldeki belirli adımların zamanlamasını değiştirmek mümkün olabilir. Örneğin, CFU veya konakçı yanıtlarını izlemek için idrar, UPEC rezervuar oluşum aşamasında daha erken zaman noktalarında toplanabilir. Bu modelde, erken zaman noktalarında (3, 6, 12 hpi) idrar örneklerinin toplanmasının enfeksiyonun ilerlemesi veya rezervuarların kurulması üzerinde olumsuz bir etkisi gözlenmemiştir. UPEC rezervuarlarının ortaya çıkışının, 12 saat veya 1 wk verilen iki JCP8151BSmR dozundan sonra meydana geldiği bildirilmiştir, ancak diğer zaman aralıkları henüz test edilmemiştir. Ayrıca, UPEC rezervuar oluşum aşamasını 2 haftaya (4 hafta yerine) düşürerek modelin toplam süresini azaltmak da mümkün olabilir, çünkü farelerin çoğu bu zamana kadar bakteriüriyi temizler. Mesanenin kimyasal eksfoliyantlara maruz kalmasını takiben UPEC ortaya çıkışını inceleyen önceki çalışmalarda 1 veya 2 wk UPEC rezervuar oluşum fazı17,18 kullanılmıştır. Bununla birlikte, UPEC bakteriüri temizliği için gereken süreyi azaltmak, deneyden daha fazla hayvanın itlaf edilmesini gerektirme pahasına olabilir. Son olarak, mesanenin SEM analizi, G. vajinalis'in ürotelyum üzerindeki etkisinin süresini gözlemlemek için ek zaman noktalarında yapılabilir.

Sorun giderme ile ilgili olarak, özellikle mesane SEM analizi ile ilgili bazı önemli hususlar vardır. Kullanılan fare arka planına ve mevcut inflamasyon miktarına bağlı olarak, bazı mesaneler çok ince duvarlarla ortaya çıkacaktır. Bu mesaneler kritik nokta kurutma sırasında daha fazla kıvrılma eğilimindedir ve kovan kabuğu benzeri bir şekle neden olabilir. Bu meydana gelirse, en iyi yöntem, kabuk şeklindeki mesaneyi kıvrılmış arayüz boyunca ikiye bölmek ve daha sonra çıkıntılı dokunun kütlesini çıkarmak için ikinci kez kesmektir. Kesim, PTFE kaplamalı çift kenarlı tıraş bıçağı ile en iyi şekilde çalışır. Aşırı yağ bazen osmiyum boyama adımları sırasında çözünebilir. Bu, durulama ve dehidrasyon adımları sırasında yıkanamayan ve sonraki kurutma sırasında mesane yüzeyine yerleşebilen istenmeyen çözünmez yağ damlacıklarına neden olabilir. Bu damlacıklar, numunenin üzerine dağılmış küçük küreler veya disk benzeri yapılar olarak görünebilir (Şekil 4D). Bu, mesanenin etrafından mümkün olduğunca fazla yağ dokusunun çıkarılmasını sağlayarak hafifletilebilir. Platinum, iridyum kaplama ile değiştirilebilir, ancak ince yapısal detayların maskelenmesini azaltmak için kalınlıklar minimumda tutulmalıdır. Kaplama sırasında dönen bir aşamanın kullanılması şiddetle tavsiye edilir.

Bu modelin bir sınırlaması, çok sayıda fare gerektirmesidir. C57BL/6 farelerinin sadece% 65-80'i UPEC bakteriürilerini temizleyecek ve sonraki G. vaginalis veya PBS aşılaması için uygun olacaktır (bkz. Şekil 2C). Grup başına 10-12 fare elde etmek için (G. vaginalis inoculation vs. PBS), ~ 30 fare başlangıçta UPEC ile enfekte edilmelidir. Ayrıca, istatistiksel anlamlılığı tespit etmek için gerekli biyolojik kopyaları elde etmek için muhtemelen birden fazla deney gereklidir. Maruziyetler 1 wk arayla verildiğinde, PBS'ye maruz kalan farelerin% 14'ünde UPEC ortaya çıkışı meydana geldi (Şekil 3B). Bu nedenle, G. vaginalis'e maruz kalan farelerde PBS kontrollerine göre (0.8'de güç; alfa = 0.05 [tek taraflı]) UPEC rUTI'sinde önemli bir artış tespit etmek, her maruz kalma grubu için kümülatif olarak en az 40 farenin test edilmesini gerektirir. Ek bir husus, bu deneylerin pahalı ve emek yoğun olmasıdır. Fareler UPEC klerensi için haftalık olarak izlenmelidir ve deneysel zaman seyri, G. vajinalis 12 saatlik bir zaman diliminde iki kez mi yoksa iki kez 1 wk aralıklarla mı verildiğine bağlı olarak 4-5 wk'dır. SEM emek yoğundur ve mikroskop kullanılabilirliğine ve servis ücretlerine bağlı olarak maliyetli olabilir. Tüm mesanenin SEM için hazırlanması, analiz için bol miktarda materyal sağlar, ancak dezavantajı, her mesanenin analiz edilmesinin zaman alıcı olabileceğidir. Bu nedenle, idrar ve doku titreleri için kullanılan daha yüksek hayvan sayılarına kıyasla SEM tarafından sadece sınırlı sayıda mesanenin analiz edilebilmesi muhtemeldir. Ek olarak, mesane "bardaklarının" kavisli yüzeylerinin yüksek kaliteli görüntülerini elde etmek, görünürlüğü engelleyebilecek gölgeler nedeniyle beceri gerektirir. Mesane SEM, ürotelyal peelingi görselleştirmek için yararlı bir araç olmasına rağmen, bu yöntem büyük ölçüde nitelikseldir. Numune yuvarlak bir şekilde sabitlendiğinden ve fiksatifte glutaraldehit kullanımı nedeniyle, ışık mikroskobu yoluyla floresan olarak eksprese eden bakterilerin taranması mümkün değildir. İmmün boyama ve kimyasal boyalar, çoğu antijeni ve ozmiyumu çapraz bağlayacak ve antijen bölgelerini maskeleyecek ve dokuyu koyulaştıracak glutaraldehit kullanımı nedeniyle bu işlemle uyumlu değildir. Bununla birlikte, SEM tekniği, hücre boyutu48,49 gibi ek problar kullanılmadan nicel olarak değerlendirilebilen parametreler için yararlıdır.

Bu model, daha önce açıklanan yöntemlerin ötesinde çeşitli avantajlar sunar. Mesanenin dış kaynaklı olarak yeniden sokulmasının aksine, mesane rezervuarlarından çıkmanın neden olduğu UPEC rUTI mekanizmalarının incelenmesine izin verir. Mesane rezervuarlarından ortaya çıkan diğer rUTI modelleri, ürotelyal pul pul dökülmeye neden olmak için kimyasal ajanlar (protamin sülfat veya kitosan) kullanır17,18, bu da kadınlarda rİYE'nin tetikleyicisi olmayacaktır. G. vaginalis, bazı kadınlarda kateterizasyon veya suprapubik aspirasyon yoluyla doğrudan mesaneden toplanan idrarda saptanan yaygın bir ürogenital bakteridir23,26. Bu gerçek, BV (G. vajinalis'in vajinada aşırı büyüdüğü yer) ve İYE arasındaki bilinen ilişki ile birleştiğinde, G. vajinalis'in rİYE'nin klinik olarak makul bir tetikleyicisi olduğunu göstermektedir. Son olarak, in situ mesane fiksasyon yöntemi, mesane ultrayapısını korur ve hasarı sınırlayarak mesane tabakalarının birbirinden ayrılmamasını sağlar. Ürotelyumu görselleştirmek için önceki yöntemler geleneksel olarak kullanıcının gerilmiş mesaneyi fiksatif48'e batırmadan önce mesaneyi aseptik olarak hasat etmesini, ikiye bölerek, germesini ve bir diseksiyon tepsisine sabitlemesini sağlar. Bu yöntem çok düz bir numune ile sonuçlanır, ancak dokunun eşit veya doğal gerilmesini sağlamaz ve gerilmiş ve gerilmiş (yüksek buruşuk doku ile sonuçlanan) alanlara neden olabilir ve mesane tabakasının ayrılmasına neden olabilir. Ek olarak, mesanenin dokuyu germek ve sabitlemek için bu fiziksel manipülasyonları, ürotelyal pul pul dökülme de dahil olmak üzere hasara neden olabilir. Başka bir yöntem, parafine gömülmeden ve bir mikrotom ile ince kesitler elde etmeden önce sağlam mesaneleri fiksatif olarak batırmaktır. İnce kesitler, bakterileri incelemek ve protein lokalizasyonunu barındırmak için immünohistokimya deneyleri için paha biçilmezdir, ancak ince bir kesit ürotelyal yüzeyin görselleştirilmesine izin vermez. Bu SEM yöntemi, tüm mesanenin yüzeyinin bir kerede incelenmesini sağlar.

Açıklandığı gibi, bu modelin gelecekteki uygulamaları, hücre içi rezervuarlar oluşturup oluşturmadıklarını belirlemek için diğer UPEC suşlarının test edilmesini ve pul pul dökülmeye neden olup olmadıklarını değerlendirmek için diğer G. vaginalis suşlarının test edilmesini ve rİYE'ye neden olmak için UPEC ortaya çıkışını içerir. C57BL / 6 farelerin ötesindeki diğer fare suşları da test edilebilir, ancak kronik sistit geliştirme eğilimi yüksek olan fareler (C3H arka planındaki fareler gibi) önerilmez, çünkü deneyden çok fazla farenin toplanması gerekir. C57BL / 6 farelerinin ek bir avantajı, birçok genetik nakavt suşunun ticari olarak temin edilebilmesidir. Bu tür suşlar, rezervuar oluşumunda ve / veya ortaya çıkmasında rol oynayan konakçı faktörleri sorgulamak için bir fırsat sağlar.

Açıklamalar

Yazarlar bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

Yazarlar, enfeksiyon deneylerinde teknik yardım için Lynne Foster'a, SEM'e erişim için Washington Üniversitesi Selül Görüntüleme Merkezi'nden (WUCCI) James Fitzpatrick'e, UTI89kanR UPEC suşu için Scott Hultgren'e ve makalenin eleştirel okuması için David Hunstad'a teşekkür ediyor.

Bu çalışma Ulusal Bilim Vakfı (VPO#DGE - 1143954 Lisansüstü Araştırma Bursu), Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Kadın Bulaşıcı Hastalıkları Araştırma Merkezi (NMG'ye Pilot Araştırma Ödülü), Amerikan Kalp Derneği: #12POST12050583 (NMG) ve #14POST20020011 (NMG) ve Ulusal Sağlık Enstitüleri, NIAID: R01 AI114635 (ALL) ve NIDDK tarafından desteklenmiştir: R21 DK092586 (ALL), P50 DK064540-11 (SJH, proje II PI:ALL) ve K01 DK110225-01A1 (NMG). Hayvan çalışmalarının bir kısmı NCRR hibesi C06 RR015502 tarafından desteklenen bir tesiste gerçekleştirilmiştir. Washington Üniversitesi Hücresel Görüntüleme Merkezi (WUCCI; SEM'in yapıldığı yer) ve MSJ, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi, Washington Üniversitesi Çocuk Keşif Enstitüsü ve St. Louis Çocuk Hastanesi (CDI-CORE-2015-505), Barnes-Yahudi Hastanesi Vakfı (3770) ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü (NS086741) tarafından desteklenmiştir. Fon verenlerin çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kateterler için30G x 1/2 iğneBD305106
5 1/2 "düz forsep hemostatMcKesson487377in yerinde mesane fiksasyonu
ACE 600 Sputter kaplayıcıLeicaSEM numune işleme
alüminyum SEM saplamasıTed Pella16111SEM numune işleme
Kalsiyum klorürEMS12340in yerinde Mesane Fiksasyonu
İletken Karbon Yapıştırıcı Tab Ted Pella16084-1SEM numune işleme
İletken gümüş boyaTed Pella16034SEM numune işleme
CPD 300 Kritik Nokta KurutucuLeicaSEM numune işleme
Cytofunnel metal klipsSimportM964Bsitospuslu idrar tahlili
EtanolEMS15050SEM numune işleme
Glikoz ve nbsp;NYCIII G. vaginalis büyüme ortamıSigmaG7528
EMS16320in situ mesane fiksasyonu
Hema 3 boyama kitiFisher23123869sitospuslu idrar tahlili
HEPESCellgro NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı25-060-Cl
Ted Pella91120SEM numune işleme
izofloranfare anestezisi
kanamisinGibco11815024UPEC LB seçici plakalarına (50 ug / mL)
eklenir Luria-Bertani agarBDDF0445174UPEC büyüme plakaları
Luria-Bertani et suyuBDDF0446173UPEC büyüme ortamı
Merlin FE-SEMZeisstaramalı elektron mikroskobu
Milli-Q Su ArıtmaCihazı MilliporeIQ-7000SEM numune işleme
NaCl NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı içinSigmaS3014
Olympus Vanox AHBT3 mikroskobuOlympussitospuslu idrar tahlili
osmiyum tetroksitEMS19170SEM numune işleme
paraformaldehitEMS15710in situ mesane fiksasyonu
polietilen boruIntramedic 427401kateterler için
Proteoz Pepton #3 Balıkçı NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı içinDF-122-17-4
PTFE kaplı çift kenarlı tıraş bıçağıSEM için EMS72000kesme keseleri
Shandon SitosantrifüjTermo BilimselA78300002sitospuslu idrar tahlili
Shandon sitohuni filtresiSimportM965FWDVsitospuslu idrar tahlili
Shandon Çift sitohuniSimportM964-1Dsitospuslu idrar tahlili
Shandon çift sitoslidelar (kaplamalı)Thermo Scientific5991055sitospuslu idrar tahlili
sodyum kakodilat trihidratEMS12310in situ mesane fiksasyon
spektrofotometresiBioChrom80-3000-45ölçümü bakteriyel OD600
streptomisinGibco11860038G. vaginalis NYCIII seçici plakalar (1 mg / mL)
tüberkülin kayma uçlu şırıngaBD309659kateterler için
Maya Özü NYCIII G. vaginalis büyüme ortamı içinFisherDF0127-17-9
için iridyum için

Kaynaklar

  1. Foxman, B. Urinary tract infection syndromes: occurrence, recurrence, bacteriology, risk factors, and disease burden. Infectious Disease Clinics of North America. 28 (1), 1-13 (2014).
  2. Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80 (3), 331-333 (1990).
  3. Foxman, B. Epidemiology of urinary tract infections: incidence, morbidity, and economic costs. American Journal of Medicine. 113, Suppl 1A 5-13 (2002).
  4. Foxman, B. The epidemiology of urinary tract infection. Nature Reviews Urology. 7 (12), 653-660 (2010).
  5. Ikaheimo, R., et al. Recurrence of urinary tract infection in a primary care setting: analysis of a 1-year follow-up of 179 women. Clinical Infectious Diseases. 22 (1), 91-99 (1996).
  6. Russo, T. A., Stapleton, A., Wenderoth, S., Hooton, T. M., Stamm, W. E. Chromosomal restriction fragment length polymorphism analysis of Escherichia coli strains causing recurrent urinary tract infections in young women. Journal of Infectious Diseases. 172 (2), 440-445 (1995).
  7. Luo, Y., et al. Similarity and divergence of phylogenies, antimicrobial susceptibilities, and virulence factor profiles of Escherichia coli isolates causing recurrent urinary tract infections that persist or result from reinfection. Journal of Clinical Microbiology. 50 (12), 4002-4007 (2012).
  8. Schreiber, H. L. t, et al. Bacterial virulence phenotypes of Escherichia coli and host susceptibility determine risk for urinary tract infections. Science Translational Medicine. 9 (382), (2017).
  9. Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Med. 4 (12), 329(2007).
  10. Elliott, T. S., Reed, L., Slack, R. C., Bishop, M. C. Bacteriology and ultrastructure of the bladder in patients with urinary tract infections. Journal of Infection. 11 (3), 191-199 (1985).
  11. Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
  12. Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
  13. De Nisco, N. J., et al. Direct Detection of Tissue-Resident Bacteria and Chronic Inflammation in the Bladder Wall of Postmenopausal Women with Recurrent Urinary Tract Infection. Journal of Molecular Biology. 431 (21), 4368-4379 (2019).
  14. Mulvey, M. A., Schilling, J. D., Hultgren, S. J. Establishment of a persistent Escherichia coli reservoir during the acute phase of a bladder infection. Infection and Immunity. 69 (7), 4572-4579 (2001).
  15. Kerrn, M. B., Struve, C., Blom, J., Frimodt-Moller, N., Krogfelt, K. A. Intracellular persistence of Escherichia coli in urinary bladders from mecillinam-treated mice. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 383-386 (2005).
  16. Eto, D. S., Sundsbak, J. L., Mulvey, M. A. Actin-gated intracellular growth and resurgence of uropathogenic Escherichia coli. Cellular Microbiology. 8 (4), 704-717 (2006).
  17. Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (38), 14170-14175 (2006).
  18. Blango, M. G., Ott, E. M., Erman, A., Veranic, P., Mulvey, M. A. Forced resurgence and targeting of intracellular uropathogenic Escherichia coli reservoirs. PLoS One. 9 (3), 93327(2014).
  19. Gilbert, N. M., Lewis, A. L. Covert pathogenesis: Transient exposures to microbes as triggers of disease. PLoS Pathogens. 15 (3), 1007586(2019).
  20. Lewis, A. L., Gilbert, N. M. Roles of the vagina and the vaginal microbiota in urinary tract infection: evidence from clinical correlations and experimental models. GMS Infectious Diseases. 8, (2020).
  21. Janulaitiene, M., et al. Prevalence and distribution of Gardnerella vaginalis subgroups in women with and without bacterial vaginosis. BMC Infectious Diseases. 17 (1), 394(2017).
  22. Fredricks, D. N. Molecular methods to describe the spectrum and dynamics of the vaginal microbiota. Anaerobe. 17 (4), 191-195 (2011).
  23. Hilt, E. E., et al. Urine is not sterile: use of enhanced urine culture techniques to detect resident bacterial flora in the adult female bladder. Journal of Clinical Microbiology. 52 (3), 871-876 (2014).
  24. Klein, S., et al. Significant increase in cultivation of Gardnerella vaginalis, Alloscardovia omnicolens, Actinotignum schaalii, and Actinomyces spp. in urine samples with total laboratory automation. European Journal of Clinical Microbiology Infect Dis. 37 (7), 1305-1311 (2018).
  25. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome in urgency urinary incontinence. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 213 (3), 341(2015).
  26. Pearce, M. M., et al. The female urinary microbiome: a comparison of women with and without urgency urinary incontinence. mBio. 5 (4), 01283(2014).
  27. Gottschick, C., et al. The urinary microbiota of men and women and its changes in women during bacterial vaginosis and antibiotic treatment. Microbiome. 5 (1), 99(2017).
  28. Malki, K., et al. Genomes of Gardnerella Strains Reveal an Abundance of Prophages within the Bladder Microbiome. PLoS One. 11 (11), 0166757(2016).
  29. Kramer, H., et al. Diversity of the midstream urine microbiome in adults with chronic kidney disease. International Urology and Nephrology. 50 (6), 1123-1130 (2018).
  30. Allsworth, J. E., Peipert, J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. Obstetrics & Gynecology. 109 (1), 114-120 (2007).
  31. Ravel, J., et al. Vaginal microbiome of reproductive-age women. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, Suppl 1 4680-4687 (2011).
  32. Hillier, S. L. Diagnostic microbiology of bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 169 (2), Pt 2 455-459 (1993).
  33. Amatya, R., Bhattarai, S., Mandal, P. K., Tuladhar, H., Karki, B. M. Urinary tract infection in vaginitis: a condition often overlooked. Nepal Medical College Journal. 15 (1), 65-67 (2013).
  34. Harmanli, O. H., Cheng, G. Y., Nyirjesy, P., Chatwani, A., Gaughan, J. P. Urinary tract infections in women with bacterial vaginosis. Obstetrics & Gynecology. 95 (5), 710-712 (2000).
  35. Sharami, S. H., Afrakhteh, M., Shakiba, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. Journal of Obstetrics and Gynaecology. 27 (3), 252-254 (2007).
  36. Hillebrand, L., Harmanli, O. H., Whiteman, V., Khandelwal, M. Urinary tract infections in pregnant women with bacterial vaginosis. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 186 (5), 916-917 (2002).
  37. Sumati, A. H., Saritha, N. K. Association of urinary tract infection in women with bacterial vaginosis. Journal of Global Infectious Diseases. 1 (2), 151-152 (2009).
  38. Gilbert, N. M., Lewis, W. G., Lewis, A. L. Clinical features of bacterial vaginosis in a murine model of vaginal infection with Gardnerella vaginalis. PLoS One. 8 (3), 59539(2013).
  39. Gilbert, N. M., O'Brien, V. P., Lewis, A. L. Transient microbiota exposures activate dormant Escherichia coli infection in the bladder and drive severe outcomes of recurrent disease. PLoS Pathogens. 13 (3), 1006238(2017).
  40. Wright, K. J., Seed, P. C., Hultgren, S. J. Uropathogenic Escherichia coli flagella aid in efficient urinary tract colonization. Infection and Immunity. 73 (11), 7657-7668 (2005).
  41. Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from urine of female patients with urinary tract infections is competent for intracellular bacterial community formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
  42. Hannan, T. J., Mysorekar, I. U., Hung, C. S., Isaacson-Schmid, M. L., Hultgren, S. J. Early severe inflammatory responses to uropathogenic E. coli predispose to chronic and recurrent urinary tract infection. PLoS Pathogens. 6 (8), 1001042(2010).
  43. Hopkins, W. J., Gendron-Fitzpatrick, A., Balish, E., Uehling, D. T. Time course and host responses to Escherichia coli urinary tract infection in genetically distinct mouse strains. Infection and Immunity. 66 (6), 2798-2802 (1998).
  44. Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), e52892(2015).
  45. Hannan, T. J., Hunstad, D. A. A Murine Model for Escherichia coli Urinary Tract Infection. Methods in Molecular Biology. 1333, 159-175 (2016).
  46. Zychlinsky Scharff, A., Albert, M. L., Ingersoll, M. A. Urinary Tract Infection in a Small Animal Model: Transurethral Catheterization of Male and Female Mice. Journal of Visualized Experiments. (130), e54432(2017).
  47. Thai, K. H., Thathireddy, A., Hsieh, M. H. Transurethral induction of mouse urinary tract infection. Journal of Visualized Experiments. (42), e2070(2010).
  48. O'Brien, V. P., et al. A mucosal imprint left by prior Escherichia coli bladder infection sensitizes to recurrent disease. Nature Microbiology. 2, 16196(2016).
  49. O'Brien, V. P., Dorsey, D. A., Hannan, T. J., Hultgren, S. J. Host restriction of Escherichia coli recurrent urinary tract infection occurs in a bacterial strain-specific manner. PLoS Pathogens. 14 (12), 1007457(2018).

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Tekrarlayan Üriner Sistem EnfeksiyonuFare ModeliTaramalı Elektron MikroskobuMesane Fiksasyonuİdrar SitolojisiHücre İçi RezervuarlarÜropatojenik Bakteriler
Farelerde Gardnerella vaginalis Mesane Maruziyeti Tarafından Tetiklenen Tekrarlayan Escherichia coli İdrar Yolu Enfeksiyonu
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.