Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Endoplazmik Retikulum Stresli Nöronlarda Lentivirüs Kaynaklı Spesifik ShRNA'lar Tarafından Moleküler Modülasyon

1.2K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/61974

⸱

24 Nisan 2021

 ,  , 
1Instituto de Investigación Médica M y M Ferreyra, INIMEC-CONICET, Universidad Nacional de Córdoba

Bu makalede

Özet

Bu çalışmada, ekspresyon, spesifik shRNA'lar kullanılarak PERK yolunun iki aşağı akış sinyal bileşeninin, sitoprotektif kalsinörin ve pro-apoptotik CHOP'un ifadesi yıkılmıştır. Zıt yönlerde, bunlar endoplazmik retikulum stresinin indüksiyonundan sonra primer kortikal nöronların nörit atrofisine duyarlılığını modüle eder.

Özet

Herhangi bir stres durumunun neden olduğu endoplazmik retikulum (ER) içinde katlanmamış proteinlerin birikmesi, özel sensörlerin aktivasyonu yoluyla katlanmamış protein tepkisini (UPR) tetikler. UPR önce homeostazı restore etmeye çalışır; ancak hasar devam ederse, sinyal apoptozu indükler.

Sürekli ve çözülmemiş ER stresinin nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere birçok patolojik duruma katkıda bulunduğuna dair kanıtlar artmaktadır. UPR, sitoprotektif ve apoptotik süreçler arasında geçiş yaparak hücre kaderini kontrol ettiğinden, bu geçişi tanımlayan olayları ve modülasyonunda yer alan unsurları anlamak önemlidir.

Son zamanlarda, anormal GM2 ganglioside birikiminin ER Ca2+ içeriğinin tükenmesine neden olduğunu ve bunun da UPR sensörlerinden biri olan PERK'yi (PKR benzeri-ER kinaz) aktive ettiğini gösterdik. Ayrıca, PERK sinyalizasyonu, GM2 birikiminin neden olduğu nörit atrofisine ve apoptozuna katılır. Bu bağlamda, aşağı akış PERK bileşenlerinin ekspresyonunu moleküler olarak modüle etmemize ve böylece nöronların nöritik atrofiye maruz kalma kırılganlığını değiştirmemize izin veren deneysel bir sistem kurduk.

Sıçan kortikal nöronal kültürlerinde kalsinörin (sitoprotektif) ve CHOP (pro-apoptotik) ekspresyonunun knockdown'unu gerçekleştirdik. Hücreler lentivirüs tarafından verilen spesifik shRNA ile enfekte edildi ve daha sonra farklı zamanlarda GM2 ile tedavi edildi, anti-MAP2 (mikrotüp ile ilişkili protein 2) antikoru ile sabitlendi ve immünoboyalandı. Daha sonra, hücre görüntüleri bir floresan mikroskobu kullanılarak kaydedildi ve toplam nörit büyümesi, kamu malı görüntü işleme yazılımı ImageJ kullanılarak değerlendirildi. Bu PERK sinyal bileşenlerinin ekspresyonunun inhibisyonu, ER stresinin neden olduğu nöritik atrofiyi hızlandırmayı veya geciktirmeyi açıkça mümkün kılmıştır.

Bu yaklaşım, nöronların nörit atrofisine karşı savunmasızlığını değerlendirmek için ER stresinin hücre sistemi modellerinde kullanılabilir.

Giriş

Endoplazmik retikulum (ER) stresi, organeldeki protein katlama kapasitesini tehlikeye atan herhangi bir pertürbasyon olarak tanımlanır. Katlanmamış proteinlerin ER lümeni içinde birikmesi, katlanmamış protein yanıtı (UPR) adı verilen bir transdüksiyon kaskad sinyalini aktive eder. Bu karmaşık sinyal yolu üç stres sensörü tarafından düzenlenir: PERK (protein kinaz RNA [PKR] benzeri ER kinaz), IRE1 (inositol gerektiren enzim 1) ve ATF6 (aktif transkripsiyon faktörü 6). Hep birlikte homeostazı restore etmeye çalışır. Ancak stres devam ederse, UPR sonunda apoptoz1 ile hücre ölümünü indükler.

Bir ER transmembran proteini olan PERK, ER stresi üzerine, ökaryotik başlatma faktörü-2 alfanın (eIF2α) fosforilasyonuna yol açarak, küresel protein sentezini ve dolayısıyla ER2'deki protein yükünü azaltır. Bir heterodimer Ca2+ fosfataz olan kalsinörin A/B'nin (CNA/B), PERK'in sitozolik alanını doğrudan bağladığını, oto-fosforilasyonunu arttırdığını ve protein translasyonunun ve hücre canlılığının inhibisyonunu önemli ölçüde arttırdığını gösterdik 3,4. İlginç bir şekilde, CNA / B, memeli beyninde bol miktarda bulunur ve CN'nin A alt biriminin iki izoformunu ayırt eder: α ve β.

Sürekli ER stresi altında, PERK sinyal yolu aktif kalan tek UPR dalıdır, böylece hem hayatta kalma yanlısı hem de apoptotik tepkiye aracılık eder. Kronik fazda, önemli bir aşağı akış olayı, transkripsiyon faktörü olan CHOP'un (CCAAT / arttırıcı bağlayıcı protein homolog protein) indüksiyonudur5. Kronik ER stresi, nörodejeneratif hastalıklar da dahil olmak üzere çok çeşitli patolojik bozukluklara ortak bir katkıda bulunan bir faktör olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir6. UPR'nin hücre ölümü yerine sitoprotektif sinyallemeyi nasıl kolaylaştırabileceğini anlamak önemlidir 7. Bununla birlikte, şu anda bu iki UPR fazı arasındaki geçişi kontrol eden kesin mekanizma hakkında çok az şey bilinmektedir.

Son zamanlarda, kültürlü nöronlarda, ganglioside GM2'nin ER membranlarında biriktiğini ve luminal kalsiyum tükenmesini indüklediğini bulduk. Bu da nörit atrofisi ve apoptoz 8'e aracılık eden PERK sinyallemesini aktive eder. Bu çalışmada, kültürlü nöronlarda GM2 birikimi, ER stresine bağlı nörit atrofisinin bir hücre sistemi modeli olarak kullanılmıştır. Spesifik olarak, iki PERK faktör ifadesi manipüle edilir, CN-Aα ve CHOP, erken / koruyucu olaylar ile kronik / apoptotik bir faz arasındaki geçişi değiştirir. Bunu başarmak için, ilgili genler susturulur; Böylece, primer kortikal nöron kültürleri lentivirüs tarafından verilen spesifik shRNA ile enfekte olur. Western blot analizi, karıştırılmış bir shRNA taşıyan lentivirüs ile enfekte olmuş kontrol hücrelerine kıyasla CN-Aα ve CHOP ekspresyon seviyelerinin önemli ölçüde azaldığını ortaya koymaktadır. Bu tedaviden sonra, nöronlar ekzojen GM2'nin farklı kuluçka sürelerine tabi tutulur, sabit ve anti-mikrotübül ile ilişkili protein 2 (MAP2) antikoru9 ile immünoboyalıdır. Görüntüler epifloresan mikroskop ile elde edilir. Toplam nörit büyümesi toplam hücre sayısına göre değerlendirilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan prosedürleri, Ulusal Sağlık Enstitüsü Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu'nun onaylanmış protokollerini izleyerek gerçekleştirilir. Çalışmanın yürütülmesi için onay, INIMEC-CONICET-UNC Hayvan Bakımı ve Etik Komitesi (CICUAL) tarafından verilmektedir (Karar numaraları 014/2017 B ve 006/2017 A).

1. Primer sıçan kortikal nöron kültürleri

  1. E18 Wistar hamile sıçanları, 60 s maruz kalma için% 80 CO 2/20%O2 karışımı ile bir CO2 odasında anestezi yapın ve daha sonra servikal omurları yerinden ederek feda edin.
  2. Laminer akış başlığında aşağıdaki adımları uygulayın. Ensefalonu, forseps stili # 3 ve düz keskin küçük yaylı makas (Malzeme Tablosu) ile embriyolardan hücre kültürü kaplarında Hanks çözeltisine çıkarın.
  3. Dokuyu 20x büyüteç altında disseke edin, iki ince uçlu forseps stili #5 kullanarak frontal korteksi meninkslerden ayırın. Frontal korteksi 15 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve dokuyu kimyasal sindirim için 37 ° C'de 15 dakika boyunca 3-4 mL Tripsin-EDTA (% 0.25) ile inkübe edin.
  4. Sindirimden sonra, 3-4mL Dulbecco'nun modifiye kartal ortamı (DMEM) artı% 10 fetal buzağı serumu (FCS) ile seyreltin. Daha sonra Ca 2+/Mg2+ içermeyen Hanks Dengeli Tuz çözeltisi ve santrifüjleme yoluyla% 0.1 glikoz (5 dakika boyunca 3000 g) ile 3 kez yıkayın.
  5. DMEM artı FCS (Malzeme Tablosu) içinde 1000 μL'lik bir uç kullanarak yukarı ve aşağı pipetleme yaparak dokuyu 10 kez mekanik olarak ayrıştırın. Daha sonra homojenatı 1 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj edin, süpernatantı toplayın ve kalan hacmi 1000 μL'ye tamamlayın.
  6. Hücre kültürü tabakları üzerindeki hücre süspansiyonunu,% 10 FCS,% 1 penisilin / streptomisin ve% 1 esansiyel bir aminoasit katkı maddesi içeren 2 mL DMEMile 520 hücre / mm2 yoğunlukta plakalayın (bkz. Daha sonra nemlendirilmiş bir ortamda 37 °C'de 2 saat boyunca% 5 CO2 ile inkübe edin.
    1. Organik madde giderimi ve hücre kültürü kaplarının poli-L-lizin kaplaması
      1. Cam malzemeyi bir reaksiyon odasına yerleştirerek organik maddeyi çıkarın ve malzemeyi hemen hemen örtmek için% 96 etil alkol ekleyin. Ardından, kahverengimsi-yeşilimsi kabarcıklar görünmeye başlayana kadar% 68 (w / v) nitrik asit damla damla ekleyin. Bu gerçekleştiğinde, kabı kısmen örtün ve patlama durana kadar reaksiyonun devam etmesine izin verin.
        NOT: Zararlı gazlara maruz kalmamak için organik maddeyi bir gaz emme kabininin altından çıkarın.
      2. Poli-L-lizin kaplamadan önce, camları steril Mili-Q suyla yaklaşık on kez durulayın. Daha sonra kültür bardaklarını ve tabaklarını kullanmadan önce 4 saat boyunca 0.1 μg / μL poli-L-lizin ile inkübe edin. Kuluçkadan sonra, bardakları steril Mili-Q suyla yaklaşık on kez durulayın.
  7. Nöral hücre farklılaşmasına izin vermek için, serumsuz bir nörobazal ortamın ortamını, serumsuz takviye ile değiştirin (Malzeme Tablosu). Kültürlerini tedaviye kadar% 5 CO2 ile 37 ° C'de tutun.

2. Lentivirüs üretimi

NOT: CN-Aα izoformu veya CHOP'un 3'UTR'lerini hedefleyen dizileri ve hedeflemeyen dizileri (karıştırmalar) içeren oligonükleotidler Tablo 1'de listelenmiştir.

  1. Tavlama için, Tavlama Tamponu (10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.0, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) kullanarak iki tek sarmallı oligonükleotidi eşit molar miktarlarda tamamlayıcı dizilerle karıştırın.
  2. 95 °C'de 2 dakika ısıtın ve ardından numuneleri ısı bloğundan veya su banyosundan oda sıcaklığında bir tezgaha aktararak yavaşça soğutun. Elde edilen ürünü [kısa saç tokası RNA, (shRNA) yapışkan uçlu] 0.5 μM'lik bir son konsantrasyona kadar seyreltin, alikot edin ve -20 ° C'de saklayın.
  3. shRNA ekini lentiviral vektör pLKO.3G'ye klonlayın, GFP yeşil floresan işaretleyici olarak. Bunun için, aşağıdakileri steril bir tüpte karıştırarak EcoRI ve PacI kısıtlama enzimleri ile 1 μg vektörü sindirin: 2 μL 10x kısıtlama enzim tamponu (100 mM bis-Tris propan-HCl, pH 6.5, 100 mM MgCl2, 1 mg / mL sığır serum albümini), 1 μL 1 μg / μL pLKO.3G, 0.5 μL 10 U / μL ECoRI, 0.5 μL PacI (10 U / μL) ve 16 μL steril iyonize su.
    1. Pipetleme yaparak nazikçe karıştırın. Reaksiyonu 37 ° C'de 3-4 saat boyunca inkübe edin.
      NOT: Gece boyunca yapılan sindirimlemeler genellikle gereksizdir ve DNA bozulmasına neden olabilir.
  4. Ligasyon için, sindirilmiş vektörü karıştırın ve 3: 1'lik bir molar oranında yerleştirin ve 16 ° C'de gece boyunca T4 ligaz ve ligaz tamponu (üretici tarafından sağlanan) ile inkübe edin.
    NOT: Bu noktada ligasyon reaksiyonu daha fazla kullanıma kadar 4 °C'de saklanabilir.
  5. DH5α yetkin hücreleri (Malzeme Tablosu) veya başka bir uygun E. coli suşunu ligasyon reaksiyonu ile aşağıdaki gibi dönüştürün.
    1. Yetkili E. coli'yi toplam ligasyon reaksiyonu hacmi ile karıştırın ve 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutun, 2 dakika boyunca 42 ° C'lik bir banyoya koyun ve ardından 15 dakika boyunca tekrar buz üzerinde soğutun.
    2. Isı şokuna maruz kalan toplam hacmi 15 mL'lik bir tüpe aktarın ve daha önce 37 ° C'de tutulan Luria-Bertani (LB) sıvı ortamı ile hacmi 1000 μL'ye tamamlayın. Bakterileri 37 ° C'de 90 dakika boyunca yaklaşık 330 rpm'de yörüngesel bir çalkalayıcıda çalkalayın.
    3. Onları 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de santrifüj edin ve 900 μL süpernatan atın. Peleti yeniden askıya almak için kalan süpernatantı kullanın. Bakteri süspansiyonunu katı bir ampisilin (100 μg / mL) LB plakası üzerine eşit olarak yayın.
    4. Gece boyunca 37 ° C'de inkübe edin, ardından bakteri büyümesini kontrol edin. Bu noktada, bakteriler 4-5 gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir.
    5. 10 mL LB sıvı ortamı ve ampisilin (100 μg / mL) içeren 50 mL'lik bir tüpe aktarmak için tek bir koloni seçin. Bakterileri yaklaşık 330 rpm'de 37 ° C'de AÇIK olarak çalkalayın.
    6. Bakterileri 4 ° C'de 5 dakika boyunca 5.000 x g'de peletlemek için kültürü santrifüj edin, süpernatantı atın ve bakteri peletini koruyun. Bu -20 °C'de saklanabilir.
  6. Plazmidi, üreticinin talimatlarını izleyerek bakteri peletinden bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırın (Malzeme Tablosu). Aşağıdaki ilişkiyi kullanarak 260 nm'deki absorbansı ölçerek ve seyreltme faktörü ile çarparak DNA konsantrasyonunu hesaplayın: 1.0 = 50 μg / mL saf çift sarmallı (ds) DNA'nın260'ı .

3. Lentivirüs enfeksiyonu

NOT: Lentivirüs üretim prosedürünü Sınıf II laminer akış başlığında uygulayın.

  1. Transfeksiyondan 24 saat önce, tohum 1-5 × 106 HEK 293 hücrelerini 8 mL büyüme ortamında 100 mm çapında kültür kaplarına koyun ve bunları 37 °C'de,% 5 CO2'de gece boyunca inkübe edin.
  2. 14 μg pKLO.3G vektörünü spesifik kesici uç, 10,5 μg ambalaj plazmidi psPAX ve 3,5 μg zarf plazmidi pMD2.G (Malzeme Tablosu) ile karıştırın. 45 μL plazmid transfeksiyon reaktifini (Malzeme Tablosu) 700 μL indirgenmiş serum ortamında (Malzeme Tablosu) seyreltin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Daha sonra DNA karışımını seyreltilmiş plazmid transfeksiyon reaktifi ile birleştirin, nazikçe karıştırın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bu arada, taze DMEM için HEK 293 hücre kültürlerinin kültür çanağının ortamını değiştirin (transfeksiyon sırasında% 70 akıcı). Ardından, DNA çözeltisinin tüm hacmini damla damla ekleyin. Yemeği nazikçe sallayın. Transfeksiyondan sonra ortam eklemek/değiştirmek gerekli değildir.
  4. ShRNA'ların bir floresan mikroskobu kullanılarak GFP floresan tarafından kontrol edilen optimum transdüksiyonlarına ulaşmalarını sağlamak için hücreleri 37 ° C'de, 48 h-72h için% 5 CO 2'de inkübe edin. Daha sonra, ortamı lentivirüs ile toplayın ve 4 ° C'de saklayın.
  5. 0.45 μm naylon membranlı filtrat viral süpernatant. 1 mL'de akış Aliquot. Ardından, 4 saat boyunca 17.000 x g'de santrifüj. Süpernatantı atın ve peleti koruyun. Görünmez peletin kurumasına izin verin ve kuruduktan sonra - 80 ° C'de saklayın.
    1. Akı sitometrisi ile viral titrasyon gerçekleştirin. 24 delikli plakalarda tohum 4 x 105 HEK 293 hücre ve 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin. Daha sonra viral parçacıkları 200 μL DMEM kültür ortamında (Malzeme Tablosu) yeniden askıya alın ve her bir kuyucuğa 0.05, 0.02 ve 0.005 μL ekleyin.
    2. Viral enfeksiyonu 72 saat boyunca inkübe edin, ortamı çıkarın ve 3 dakika boyunca tripsinize edin (% 0.05 tripsin, 1 mL). FCS çözeltisine 1 mL DMEM ekleyin ve 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüj yapın. Süpernatantı atın ve peleti PBS ile iki kez yıkayın.
    3. Peleti 100 μL PBS ile yeniden askıya alın ve hücreleri PBS'de 100 μL% 2 paraformaldehit (PFA) ile sabitleyin. Hücreleri bir akı sitometresi ile analiz edin ve GFP floresan hücrelerinin yüzdesini belirleyin. Aşağıdaki formülü kullanarak viral titrasyonunu hesaplamak için bu verileri toplayın:
      Viral Titrasyon
      figure-protocol-1

4. Ganglioside GM2 birikimi ve anti-MAP2 antikoru kullanan immünositokimya ile vurgulanan primer nöron kültürleri

  1. Birincil kortikal nöron kültürlerini (15 gün in vitro) CN-Aα veya CHOP'un 3' UTR'lerini hedef alan spesifik shRNA oligonükleotidlerle enfekte edin ve bunları 1 gün boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe edin.
    NOT: 7-8 günlük primer kortikal nöron kültürleri in vitro olarak da hücreler yüksek nörit büyümesi gösteriyorsa kullanılabilir.
    1. Etanol içinde ganglioside GM2'nin 500 μM stok çözeltisini hazırlayın ve 1 saat boyunca sonikleştirin.
    2. 2 μM'lik son konsantrasyonda orta kültür yemeklerine GM2 stok çözeltisi ekleyin. 16, 24 ve 48 saat boyunca% 5 CO2 ile 37 ° C'de inkübe etmeye bırakın.
  2. Batı leke analizi için hücresel homojenat hazırlamak üzere bazı kültürleri kullanın (antikor spesifikasyonu için Malzeme Tablosuna bakınız).
  3. 1.4 numaralı adımları izleyin. ve 1.5. ve daha sonra hücreleri PBS'de% 4 PFA ve 120 mM sakkaroz ile 37 ° C'de 20 dakika sabitleyin ve ardından PBS ile yıkayın. Bu prosedürü ıslak bir odadaki kaymayı önleyici bir membran üzerinde gerçekleştirin. Daha sonra, 5 dakika boyunca geçirgenlik çözeltisi (PBS'de% 0.2 Triton X-100) ekleyin ve PBS ile yıkayın.
    1. Blokaja izin vermek için PBS'de 45 dakika seyreltilmiş% 5 BSA kullanın, daha sonra anti-MAP2 antikoru ile inkübe edin, blokaj çözeltisinde 1:800 seyreltilmiş, gece boyunca 4 ° C'de.
    2. Kuluçka süresinin sonunda, PBS ile iki kez yıkayın ve 1 saat boyunca ikincil antikor (Malzeme Tablosu) ile inkübe edin. Daha sonra hücreleri PBS ile yıkayın ve camları sulu bir montaj ortamı kullanarak slaytlara monte edin (Malzeme Tablosu).

5. Nörit atrofi analizi

  1. CCD kamera ile donatılmış epifloresan ters çevrilmiş mikroskop kullanarak 20x hava lensi (NA 0.8) ile görüntüler elde edin. ImageJ eklentileriyle görüntüleri analiz edin. Bunun için resmi ImageJ'ye yükleyin ve İşlem | Arka planı çıkarın.
  2. Resme Tıklayın | Ayarlama | Eşik veya şu tuşları yazın: Ctrl (veya Cmd) + Üst Karakter + T. Minimum değerleri ayarlamak için bir pencere açılır ve yol ve soma izlemelerinin ayırt edilebilir olmasını sağlar. İkili resme tıklayın (nöritler ve somalar beyaz renklidir). Bu görüntüde, somonları silmek için serbest seçimi kullanın; seçilen soma bölgesi tekrar siyaha döner.
  3. İzleri seçin ve Düzenle'ye tıklayın | Seçim | Seçim Oluştur. Seçimin Ctrl (veya Cmd) ve T tuşlarına tıklayarak yatırım getirisini elde edin ve koruyun. Orijinal görüntüyü açın, ardından YG yöneticisi paneline tıklayın ve daha önce elde edilen ait YG'yi seçin. Ardından orijinal resme tıklayın.
  4. Yatırım getirisi görüntüde izlendikten sonra, Ctrl (veya Cmd) ve M tuşlarını (Analiz Et | Ölçün). Bir pencere açılır; istatistiksel analizi işlemek için ortalama değeri (keyfi birimler a.u.) kopyalayın.
    NOT: Değerleri μm olarak elde etmek için, Analiz Et | Ölçeği ayarlayın. Değerleri ayarlamak için bir pencere açılır. Doğru ölçeği eklediğinizden emin olun (Analiz | Set Scale) kullanılan mikroskobun özelliklerine bağlı olarak.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada, iki PERK aşağı akış bileşeninin susturulmasının bir ER gerilim hücresi modelinde UPR'nin geçiş aşamasını etkileyip etkilemediği sorusunu ele alıyoruz. Bunu başarmak için, CN-Aα genini ve CHOP genini, primer nöron hücre kültüründeki her biri için iki spesifik shRNA dizisi (Tablo 1) ile 1 gün10 boyunca susturuyoruz. İfade Batı lekelemesi ile analiz edilir (Şekil 1 ve Şekil 2). Nakavt hücrelerinde ER...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bir nöronal hücre modelinde sağkalımdan apoptotik UPR fazlarına geçişin moleküler modülasyonunu sağlayan deneysel bir sistemi tanımladık.

Nörit atrofisinin doğru bir analizi için, çok, uzun, çok dallı süreçlere sahip birincil nöron kültürlerinin elde edilmesi esastır 9,11. Bu, nöron süreci uzantısının incelenmesini kolaylaştırır ve tedaviler arasındaki net farklılıkların tespit edilmesini sağlar. 7-8 günlük in vitro primer kor...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların rekabet eden finansal çıkarları yoktur.

Teşekkürler

Dr. Gonzalo Quasollo'ya görüntüleme konusundaki paha biçilmez yardımları için ve hücre kültürü teknik desteği için Dr. Andrea Pellegrini'ye teşekkür ederiz.

Bu araştırma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüsü (#RO1AG058778-01A1, UTHSCSA-Instituto Investigación Médica M y M Ferreyra arasındaki Alt Ödül Anlaşması No 165148/165147) ve Agencia Nacional de Scientific and Technological Promotion, Arjantin Ulusal Ajansı'ndan (ANPCyT, PICT 2017 #0618) hibelerle desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Alexa Fluor 488 anti-FareThermo Fisher Scientific#R37120
anti-CHOPThermo Fisher# MA1 - 250
Anti-CN-A & alfa;Millipore# 07-067
Anti-GM2Matreya# 1961
anti-MAP2Sigma Aldrich# M2320
anti-β -aktinThermo Fisher# PA1 - 183
aprotininSanta Cruz Biyoteknoloji# 3595
Axiovert 200 epifloresan mikroskobuZeiss
B27 ekYaşam Teknolojileri#17504944
Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)Yaşam Teknolojileri#11966025
EcoRIPromega#R6011
Fetal Buzağı Serumu (FCS)Yaşam Teknolojileri#16000044
İnce uçlu forseps  stil #5Dumont
Forcep stili #3Dumont
HEK 293ATCC#CRL-1573
IRDye 680 CW ikincil antikorLI-COR Biosciences#92632221
IRDye 680 ikincil antikorLI-COR Biosciences#92632220
IRDye 800 CW ikincil antikorLI-COR Biosciences#92632210
IRDye 800 CW ikincil antikorLI-COR Biyolojik Bilimler# 92632211
lentiviral zarf plazmidi pMD2.GAddgene# 12259
lentiviral ambalaj plazmidi psPAX2Addgene# 12260
lentiviral vektör pLKO.3GAddgene# 14748
Leupeptin hemisülfatSanta Cruz Biyoteknoloji# 295358
Lipofektamin LTX & Artı Reaktif (plazmid transfeksiyon reaktifi)Life Technologies#A12621
MİSYON shRNASigma Aldrich
Monosialoganglioside GM2Matreya#1502
NanoDrop 2000Thermo Scientific
Nörobazal OrtaYaşam Teknolojileri#21103049
Nitroselüloz membran 0.45 & mikro; mBIO-RAD#1620115
Odyssey kızılötesi görüntüleme sistemiLI-COR Bioscience
OneShot Top 10Yaşam Teknolojisi#C404010
Opti-MEM (Azaltılmış serum ortamı)Yaşam Teknolojileri#105802
PacIBioLabs#R0547S
penisilin-streptomisinYaşam Teknolojileri#15140122
Pepstatin ASanta Cruz Biyoteknoloji# 45036
fenilmetilsülfonil florürSanta Cruz Biyoteknoloji# 329-98-6
Poli-L-lizinsigma aldrichP # 2636
Düz keskin küçük yaylı makasGüzel Bilim Araçları
T4 DNA LigazPromega#M1801
Tripsin-EDTA %0.25Yaşam Teknolojileri# 25200056
Vibra Hücreli Ultrasonik Sıvı İşlemci (VCX 130)Sonics
Wizard plus SV Minipreps DNA arıtma sistemiPromega#A1330

Kaynaklar

  1. Schroder, M., Kaufman, R. J. The mammalian unfolded protein response. Annual Review of Biochemistry. 74, 739-789 (2005).
  2. Cui, W., Li, J., Ron, D., Sha, B. The structure of the PERK kinase domain suggests the mechanism for its activation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 423-428 (2011).
  3. Bollo, M., et al. Calcineurin interacts with PERK and dephosphorylates calnexin to relieve ER stress in mammals and frogs. PLoS One. 5, 11925(2010).
  4. Chen, Y., Holstein, D. M., Aime, S., Bollo, M., Lechleiter, J. D. Calcineurin beta protects brain after injury by activating the unfolded protein response. Neurobiology of Disease. 94, 139-156 (2016).
  5. Harding, H. P., et al. An integrated stress response regulates amino acid metabolism and resistance to oxidative stress. Molecular Cell. 11, 619-633 (2003).
  6. Hetz, C., Saxena, S. ER stress and the unfolded protein response in neurodegeneration. Nature Reviews Neurology. 13, 477-491 (2017).
  7. Lin, J. H., Li, H., Zhang, Y., Ron, D., Walter, P. Divergent effects of PERK and IRE1 signaling on cell viability. PLoS One. 4, 4170(2009).
  8. Virgolini, M. J., Feliziani, C., Cambiasso, M. J., Lopez, P. H., Bollo, M. Neurite atrophy and apoptosis mediated by PERK signaling after accumulation of GM2-ganglioside. Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. 1866, 225-239 (2019).
  9. Ferreira, A., Busciglio, J., Landa, C., Caceres, A. Ganglioside-enhanced neurite growth: evidence for a selective induction of high-molecular-weight MAP-2. The Journal of Neuroscience. 10, 293-302 (1990).
  10. Moore, C. B., Guthrie, E. H., Huang, M. T., Taxman, D. J. Short hairpin RNA (shRNA): design, delivery, and assessment of gene knockdown. Methods in Molecular Biology. 629, 141-158 (2010).
  11. Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1, 2406-2415 (2006).
  12. Rusnak, F., Mertz, P. Calcineurin: form and function. Physiological Reviews. 80, 1483-1521 (2000).
  13. Hogan, P. G., Chen, L., Nardone, J., Rao, A. Transcriptional regulation by calcium, calcineurin, and NFAT. Genes & Development. 17, 2205-2232 (2003).
  14. Endo, M., Mori, M., Akira, S., Gotoh, T. C/EBP homologous protein (CHOP) is crucial for the induction of caspase-11 and the pathogenesis of lipopolysaccharide-induced inflammation. Journal of Immunology. 176, 6245-6253 (2006).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Endoplazmik Retikulum StresiLentivir s ile Aktar mshRNA NakavtKalsin rin A alfaCHOP EkspresyonuN rit AtrofisiMAP2 mmunboyamaWestern Blot AnaliziPrimer N ron K lt rGM2 Gangliozit
Endoplazmik Retikulum Stresli Nöronlarda Lentivirüs Kaynaklı Spesifik ShRNA'lar Tarafından Moleküler Modülasyon
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.