Modüler Altın Kapı Klonlama Kullanılarak Çok Genli Yapıların Hızlı Montajı

Summary

Bu protokolün amacı, Golden Gate klonlamaya dayalı modüler klonlama sistemini kullanarak çok genli yapıların montajı için ayrıntılı, adım adım bir kılavuz sağlamaktır. Ayrıca, deneyimlerimize göre en iyi montajı sağlamak için kritik adımlar hakkında önerilerde bulunmaktadır.

Abstract

Golden Gate klonlama yöntemi, kullanıcı tanımlı herhangi bir düzenlemede birden fazla genin hızlı bir şekilde bire birliğini sağlar. Tanıma alanlarının dışında kesilen ve kısa bir çıkıntı oluşturan tip IIS kısıtlama enzimlerini kullanır. Bu modüler klonlama (MoClo) sistemi, organizatörler, kodlama dizileri (CDS) ve sonlandırıcılar gibi farklı DNA parçalarının ilk olarak bir giriş vektörüne klonlandırıldığı hiyerarşik bir iş akışı kullanır. Birden çok giriş vektörü daha sonra transkripsiyon birimlerine monte edilir. Birkaç transkripsiyon ünitesi daha sonra çok genli bir plazmid içine bağlanır. Golden Gate klonlama stratejisi, tek pota reaksiyonunda skarsız, yönlü ve modüler montaja izin verdiği için muazzam bir avantaja sahip. Hiyerarşik iş akışı genellikle giriş vektörlerinin ötesinde sıralamaya gerek kalmadan çok çeşitli çok genli yapıların facile klonlasını sağlar. Floresan protein bırakmalarının kullanımı kolay görsel tarama sağlar. Bu çalışma, maya modüler klonlama (MoClo) kitini kullanarak çok genli plazmidlerin montajı için ayrıntılı, adım adım bir protokol sağlar. Çok genli plazmid montajının optimal ve yetersiz sonuçlarını gösteriyoruz ve koloniler için tarama için bir kılavuz sağlıyoruz. Bu klonlama stratejisi maya metabolik mühendisliği ve çok genli plazmid klonlamanın gerekli olduğu diğer durumlar için oldukça geçerlidir.

Introduction

Sentetik biyoloji, farmasötik, tarım ve kimya endüstrileri için yararlı yeni işlevlere sahip biyolojik sistemler tasarlamayı amaçlamaktadır. Çok sayıda DNA parçasını yüksek verimli bir şekilde birleştirmek sentetik biyolojide temel bir teknolojidir. Böyle karmaşık bir süreç, temel mühendislik bilimlerinden ödünç alınan bir kavram olan azalan karmaşıklık ile birden fazla seviyeye ayrılabilir^1,2. Sentetik biyolojide, DNA parçaları genellikle işlevselliğe göre hiyerarşik olarak bir araya gelir: (i) Parça düzeyi: "parçalar", organizatör, kodlama dizisi, sonlandırıcı, çoğaltmanın kaynağı gibi belirli bir işleve sah....

Protocol

NOT: Bu araç setinde sunulan hiyerarşik klonlama protokolü üç ana adıma ayrılabilir: 1. Parça plazmidlerini klonlama; 2. Klonlama transkripsiyon üniteleri (TUs); 3. Çok genli plazmidlerin klonlama (Şekil 1). Bu protokol astar tasarımından başlar ve klonlanmış çok genli plazmid uygulamaları ile sona erer.

1. Parça plazmid klonlama için astar tasarımı (pYTK001):

1. 5' ucunda TTT yan nükleotitleri içeren ileri ve ters astarları, giriş vektörün tamamlayıcısı olan 4 nükleotidli (nt) çıkıntılı (TCGG) ek nükleotidli (CGTCTCN) bir BsmBI tanıma alanını tasarlayın, şablona özgü sıraya ek olarak ek nükleotid (GGTCT....

Results

Burada β karoten (sarı) ve likopen (kırmızı) üretimi için dört çoğaltıcı çok genli plazmid sonuçları. ADE2 lokusunu bozmak için kolonileri kırmızı olan bir bütünleştirici çok genli plazmid inşa edildi.

CDS'leri giriş vektörüne klonlama (pYTK001)
ERG20 maya genomundan ve üç karotenoid gen crtE, crtYB, crtI plazmid pLM494^48'den pYTK001 giriş v.......

Discussion

Lee ve arkadaşları tarafından geliştirilen MoClo tabanlı klonlama kiti, maya genomuna çoğaltma veya entegrasyon için bir ila beş transkripsiyon ünitesinin çok genli bir plazmid içine hızlı bir şekilde montajı için mükemmel bir kaynak sağlar. Bu kitin kullanımı, mayadaki birden fazla geni ifade etmek için sıklıkla var olan zaman alıcı klonlama darboğazını ortadan kaldırır.

T4 DNA ligaz ile Golden Gate klonlamanın sindirim/ligasyon döngüleri için beş farklı koşulu test ettik. 5 dakika boyunca 37.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 mm Cam boncuklar	RPI araştırma ürünleri	9831	Maya hücrelerini parçalamak için
Bacto Agar	BD & Şirket	214010	Maya bileşeni tam sentetik ortam (CSM)
Bacto Peptone	BD & Şirket	211677	Maya ekstraktının bileşeni pepton dekstroz ortamı (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S,	BsaI kısıtlama enzimi Karbenisilin'in yüksek verimli bir versiyonu
	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Transkripsiyon ünitesi düzeyinde tarama için antibiyotik
Kloramfenikol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Tarama için antibiyotik giriş vektör seviyesi
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Maya tam sentetik ortamın amino asit takviyesi (CSM)
Dekstroz	Fisher Chemical	D16-500	Maya tam sentetik ortamın karbon kaynağı (CSM)
Difco Maya Azot Bazı, Amino Asitler olmadan	BD & Şirket	291940	Maya tam sentetik ortamın (CSM)
dNTP karışımının	Promega	U1515	PCR için dNTP'ler
Esp3I	New England Biolabs	R0734S,	BsmBI'nin yüksek verimli bir izoşizomeri
Frozen-EZ Maya Trasformation II Kiti	Zymo Research	T2001	Maya dönüşümü için
Hexanses	Fisher Chemical	H302-1	Maya hücrelerinden karotenoid ekstraksiyonu için
Kanamisin	Fisher Biyoreaktifleri	25389-94-0	Çok genli plazmit seviyesinde tarama için antibiyotik
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	E. coli kültürü için lizojenik agar ortamı
LB Suyu, Miller	Fisher Biyoreaktifleri	BP1426-2	E. coli< / em için lizojenik sıvı ortam>
Likopen	Cayman kimyasallarının	NC1142173	Likopen miktar tayini için
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Yatırma Laboratuvarı: John Deuber
Monarch Plazmid Miniprep Kiti	New England Biolabs	T1010L	E.coli
Nanodrop Spektrofotometre	Thermo Scientific	ND2000c'den	plazmit saflaştırması içinDoğru DNA konsantrasyonlarını ölçmek için:
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Bütünleştirici çok genli plazmit doğrusallaştırması için kısıtlama enzimi
Nourseothricin Sülfat	Goldbio	N-500-100	Bu çalışmada kullanılan pCAS plazmidi için Antibiyotik Seçim belirteci
Phusion HF reaksiyon Tamponu (5X)	New England Biolabs	B0518S	Phusion polimeraz kullanarak PCR için tampon
Phusion High Fidelity DNA Polimeraz	New England Biolabs	M0530S	Tüm PCR reaksiyonları için yüksek kaliteli polimeraz
pLM494	Addgene	100539	Bu çalışmada kullanılan crtI, crtYB ve crtE'yi amplifiye etmek için kullanılan plazmid
Kuvars Küvet	Termo Elektron	10050801	Karotenoidlerin miktarını belirlemek için
T4 ligaz	New England Biolabs	M0202S	Altın için Ligaz Kapı klonlama
Thermocycler	BIO-RAD	1851148	Tüm PCR ve klonlama reaksiyonlarını gerçekleştirmek için
Doku Homojenizatör	Bullet Blender	Model: BBX24	Maya hücrelerinin homojenizasyonu için
UV-Vis Spektrofotometre Thermo	Scientific	Genesys 150	Karotenoidlerin miktarını belirlemek için
Maya Özü	Fisher Biyoreaktifleri	BP1422-500	Maya ekstraktının bileşeni pepton dekstroz ortamı (YPD)
β-karoten	Alfa Aesar	AAH6010603	β-karoten miktar tayini için