CRISPR/Cas9 C. elegans rbm-3.2 Geninin dpy-10 Co-CRISPR Tarama İşaretçisi ve Monte Edilmiş Ribonikleoprotein Kompleksleri kullanılarak düzenlenmesi.

Kümelenmiş Düzenli Aralıklı Kısa Palindromik Tekrar (CRISPR)/ Streptococcus pyogenes CRISPR ilişkili protein (Cas)^teknolojisi,çok çeşitli organizmalarda verimli hedefli genom düzenleme sağlar 1 ,^2,3,4. CRISPR sistemi ilk olarak prokaryotik antiviral immün yanıt^5,6^,7'nin bir parçası olarak keşfedilmiştir. Type II CRISPR sistemi Cas9 gibi bir endonuclease kullanır, bir "NGG" Protospacer Bitişik Motifi (PAM) tanımak ve hedef DNA^5,6, 7 ,^8,9, 10 ,^11,12'de çift iplikli bir kırılma yapmak için transaktive RNA^(tracrRNA)ve^kısa,hedef DNA özgü²⁰nükleotid uzun kılavuz CRISPR RNA (crRNA). Bu çift iplikli kırılma hücresel DNA onarım makineleri tarafından lezyon olarak kabul edilir. Sonuç olarak, oluşturulan çift iplikli mola iki yoldan biri tarafından onarılabilir- i) Homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya ii) Homolojiye yönelik onarım (HDR)¹³. NHEJ genellikle hataya eğilimlidir ve bu nedenle, bu yol hedef DNA'daki çift iplikli kırılmayı onarmak için kullanıldığında, genellikle ilgi geninde mutasyonların (eklemeler, silmeler) inaktive olmasına neden olur. Öte yandan, çift iplikçik kırılmasının her iki tarafına homoloji ile eksojen bir onarım şablonu sağlayarak, hücresel DNA onarım makineleri molayı onarmak için HDR kullanmaya yönlendirilebilir¹³. HDR yöntemi böylece ilgi çekici herhangi bir çekirgenin hassas bir şekilde düzenlenmesini sağlar.

C. elegans^{14 , 15 , 16 , 17,18,19,20}için çeşitli CRISPR/Cas9 gen düzenleme protokolleritanımlanmıştır. C. elegans'ta en sık kullanılan CRISPR/Cas9 düzenleme yöntemleri, CRISPR/Cas9 düzenleme 14 , 15 ,^{16 , 17 , 18,19,20}için onarım şablonları oluşturmak için hem klonlama tabanlı hem de klonlama içermeyen protokolleri içerir. Bu protokol, tarama için dpy-10'u ortak CRISPR işaretçisi olarak kullanmaya dayalı klonlama içermeyen crispr/cas9 düzenleme protokolünü ayrıntılı olarak ele alınır. Şimdiye kadar, mevcut olan tek ayrıntılı C. elegans odaklıCRISPR / Cas9 düzenleme video protokolü tarama için bir floresan işaretleyici kullanır²¹. Bununla birlikte, tarama için floresan bir işaretleyici kullanmak, küçük Öncelikle Lisans Kurumlarındaki (PUI' ler) birçok laboratuvarın erişmekte zorlanabileceği bir floresan mikroskobuna erişim gerektirir. Floresan belirteçleri taşıyan solucanlar ile düzenlemenin varlığı arasında önceki çalışmalarda pozitif korelatif sonuçların elde edildiğini belirtmek cesaret^{vericidir 21,22}. Bununla birlikte, farklı kılavuz RNA'lar ve onarım şablonları ile çok çeşitli locileri düzenlemek için floresan bazlı tarama yönteminin genel verimliliğini belirlemek için ek çalışmalar gereklidir. Son olarak, bu floresan belirteçler için kodlanan plazmidler ekstrakromosomal diziler oluşturduğundan, değişken floresan genellikle pozitiflerin tanımlanmasını zorlaştırabilecek bu dizilerden üretilir²³. Bu nedenle, floresan bazlı tarama yönteminin benimsenmesi yararlı olsa da, yukarıda belirtilen konular uygulanabilirliğini sınırlayabilir.

Görünür bir fenotip üreten bir co-CRISPR işaretçisi kullanmak, olumlu düzenlenmiş bir solucan bulmak için taranan soy sayısını büyük ölçüde azaltır^{23 , 24,25,26,27,28}. Daha da önemlisi, bu belirteçler tarafından üretilen fenotipler basit bir diseksiyon mikroskobu 23 , 24 ,^25,26,27^,28,29,^{30,31,32,33,34}altında kolayca tespit edilebilir. dpy-10 co-CRISPR markörü, C. elegans CRISPR/Cas9 genom düzenleme^{24, 27}gerçekleştirmek için en iyi karakterize edilen ve yaygın olarak kullanılan ortak CRISPR işaretleyicilerindenbiridir. Bu nedenle, bu makalede, ribonikleoprotein komplekslerinin dpy-10 ile doğrudan teslimini kullanarak C. elegans'ta CRISPR/Cas9 düzenleme yönteminin ortak CRISPR işaretleyicisi olarak^27,35. Bu yöntemde, hazırlanan düzenleme enjeksiyon karışımı, dpy-10 geni^{24 , 27,}29 içinde bilinen bir heterozip dpy-10 (cn64) mutasyonu ile verilen gözlemlenebilir bir baskın "silindir" (Rol) fenotipinin üretilmesine aracılık etmek için iyi karakterize edilmiş bir dpy-10 crRNA ve^dpy-10onarım şablonundan oluşur. Homozigot durumunda mevcut olduğunda, dpy-10(cn64) mutasyonu, daha kısa ve stouter solucanları üreten dumpy (Dpy) fenotipine neden olur^24,29. Rol fenotipi, birlikte sağlanan dpy-10 onarım şablonunun HDR aracılı CRISPR/Cas9 düzenlemesi ile dpy-10 geninin tek bir kopyasına doğru bir şekilde yerleştirilmesiyle aracılık eder. Bu nedenle, Rol C. elegans'ın ortaya çıkması, enjekte edilen solucanın hücrelerinde başarılı bir enjeksiyonun yanı sıra başarılı bir HDR aracılı düzenleme olayına işaret eder. CrRNA ve ilgi çekici hedef genin onarım şablonu dpy-10 crRNA ve dpy-10 onarım şablonu ile aynı enjeksiyon karışımında olduğundan, tanımlanan Rol solucanlarının da aynı anda ilgi çekici hedef gende düzenlenmiş olma olasılığı yüksektir. Bu nedenle, bu Rol solucanları daha sonra polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) (50 bp'den büyük düzenlemeler için) veya PCR ve ardından kısıtlama sindirimi (50 bp'den küçük düzenlemeler için) gibi tekniklerle ilginin düzenlenmesi için taranır.

Genom düzenleme için bu yöntemi kullanmanın avantajları şunlardır: i) CRISPR düzenlemeleri bu yöntem kullanılarak nispeten yüksek bir verimlilikte (%2 ila% 70) oluşturulabilir^27; ii) bu yöntemde kullanılan onarım şablonları ve kılavuz RNA'lar klonlama içermez, böylece nesilleri için gereken süreyi azaltır; iii) ribonucleoprotein komplekslerinin in vitroolarak birleştirilmesiyle, monte edilen düzenleme komplekslerinin konsantrasyonları nispeten sabit tutulabilir, böylece tekrarlanabilirliği arttırır; iv) plazmidlerden ifade edildiğinde düzenleme oluşturamayan bazı kılavuz RNA'ların, in vitro transkript crRNA'lar²⁷olarak sağlandığında CRISPR/Cas9 genom düzenlemesi için çalıştığı gösterilmiştir; v) dpy-10 co-CRISPR işaretleyicisi dahil olmak üzere, bir diseksiyon mikroskobu kullanılarak kolay tarama sağlar ve pozitifleri bulmak için taranan soy sayısını azaltır^24,27; ve vi) DNA dizilimi doğrulanmış homozigöz düzenlemeli solucan çizgileri bu yöntemle birkaç hafta içinde elde edilebilir^19,27.

Birçok farklı C. elegans CRISPR yöntemi ile ilgili mükemmel kitap bölümleri yayınlanmıştır^14,15,16,17,18^,19,20,43. Bununla birlikte, dpy-10 co-CRISPR yönteminin laboratuvar ortamında bir video formatında gösterilmesi şu anda eksiktir. Bu makalede, putatif bir RNA bağlayıcı protein olan rbm-3.2 adlı temsili bir hedef geni düzenlemek için dpy-10 co-CRISPR yöntemini kullanma sürecini açıklar ve gösteririz (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10).  Özellikle, burada in vitro monte ribonükleoprotein kompleksleri ve eksojen olarak sağlanan doğrusal tek iplikli onarım şablonu kullanarak C. elegans rbm-3.2 geni içinde üç prematüre durdurma kodonunun tanıtılması yöntemini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Bu çalışmalar rbm-3.2 geninde erken stop kodonları ile ilk C. elegans CRISPR suşunu üretmede başarılı olmuştur. C. elegans'ta bu genin işlevi ile ilgili şu anda çok fazla şey bilinmediğinden, bu suş RMB-3.2'nin işlevinin parçalanmasında yararlı bir araç olarak hizmet edecektir. Bu yöntem, C. elegans genomu içindeki herhangi bir çekirgeye eklemeler, ikameler ve silmeler yapmak için de benimsenebilir.

CRISPR/Cas9 genom düzenleme protokolü, NIH yönergelerine uyarak Tulsa Üniversitesi Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokol boyunca steril teknik uygulandı. Bu protokolün tüm adımları çekirdek içermeyen reaktifler kullanılarak gerçekleştirildi. RNase arındırıcı bir çözelti ile temizlik eldivenlerinin yanı sıra çalışma alanları ve ekipmanlar (örneğin pipetler, cam eşyaların dış cephesi vb.) gibi RNaze kontaminasyonunun önlenmesine özel özen sunuludur.

1. crRNA tasarımı

1. Cas9'un düzenleme sitesine en yakın kesimi yapmasına olanak sağlayan PAM'yi bulun.
   1. PAM sitesi 5'-NGG-3'.
   2. PAM'nin DNA'nın her iki ipinde de olabileceğini unutmayın.
2. CRRNA dizisi olarak PAM'nin 5' ucunda 20 bp seçin.
   NOT: Ticari şirketler tarafından sentezlenen gerçek crRNA dizisi, sentezleme şirketi tarafından hedefe özgü 20 bp crRNA dizisine otomatik olarak eklenen ek bir genel sıraya sahip olduğundan 20 bp'den daha uzundur. Hedef dışı etkilerle ilgili olarak, son çalışmalar C. elegans36 , 37 , 38^{,39,40'taCas9'un}hedef dışı etkilerinibulamadı. Ayrıca, CRISPR tarafından düzenlenen suşlar aşilir. Bu nedenle, tasarlanan CRRNA'ların hedef dışı etkileri konusunda çok endişeli değiliz. Bununla birlikte, http://genome.sfu.ca/crispr/ ve http://crispor.tefor.net/ dahil olmak üzere çevrimiçi web siteleri, en az hedef dışı efektlere sahip CRRNA'ları bulmak ve seçmek için kullanılabilir^38,41. G veya GG ile biten crRNA'lar ve %50'den fazla GC içeriğine sahip olanların daha verimli olacağı tahmin edilmektedir^19,23,42.
3. Bir şirketten en az 10 nmol crRNA sipariş edin (örneğin IDT, Horizon Discovery, vb.).
   1. Liyofilize crRNA geldiğinde, mikroenjeksiyon gününe kadar -30 ° C'de saklayın.
   2. Mikroenjeksiyonun gerçekleştirildilmesi gününde, liyofilize crRNA'yı bir dakika boyunca maksimum hızda (17.000 x g) döndürün ve crRNA'nın 8 μg/μL stoğunu yapmak için 5 mM Tris-Cl (pH 7.4) olarak yeniden depolanın.
   3. Kullanılmayan crRNA stoğunu -80 °C'de dondurarak saklayın.

2. Şablon tasarımını onarın

1. Bir dizi düzenleme yazılımı indirin (örneğin CLC sıra görüntüleyici, APE, Snapgene, Vector NTI, vb.). ClC sıra görüntüleyici sürüm 8.0'ı (Qiagen) kullanıcı dostu olduğu ve ücretsiz olarak indirilebildiği için kullanıyoruz.
2. İlgi çekici hedef DNA'nın dizisini dizi görüntüleyiciye yapıştırın.
3. Onarım şablonunun yönü düzenleme verimliliğini etkiler²⁸. PAM'nin 5' ucuna bir onarım dizisi eklemek için, PAM dizisinin bulunduğu DNA ipliğine ait DNA dizisine sahip tek iplikli bir onarım şablonu tasarlayın (protospacer strand)²⁸. PAM'nin 3' ucuna bir onarım dizisi eklemek için, PAM dizisini (ara iplikçik) taşımayan DNA iplikçiğinden DNA dizisi ile tek iplikli bir onarım şablonu tasarlayın²⁸.
4. Düzenlemenin her iki tarafında (5' ve 3' ucunda) kesintisiz homolojiye sahip 35 baz sıra çifti seçin.
5. Onarım şablonunun veya düzenlenmiş genomik DNA'nın Cas9 tarafından kesilmesini önlemek için PAM'yi mutasyona uğratın veya silin.
   1. PAM'nin mutasyonu mümkün değilse, onarım şablonunun veya düzenlenmiş genomik DNA'nın kesilmesini önlemek için PAM'nin 5' ucuna yakın birkaç sessiz mutasyon tanıtın.
   2. PAM'nin sessiz mutasyonlarını yalnızca şeytani bir bölgede mevcutsa ortaya çıkarmakta olduğundan emin olun.
   3. Mutasyona uğramış kodon'un orijinal mutasyona uğramamış kodonla karşılaştırılabilir bir frekansta tanıtıldığından emin olmak için kodon kullanım sıklığını kontrol edin (örneğin https://www.genscript.com/tools/codon-frequency-table). Bazı durumlarda, mutasyona uğramış kodon'u, mutasyona uğramamış kodonla benzer bir frekansta tanıtmak mümkün olmayabilir. Bununla birlikte, birkaç amino asidin mutasyonlarını yapmak için, mutant proteinin ifade seviyesinin önemli ölçüde değiştirilmesini beklemiyoruz.
6. Düzenleme küçükse (örneğin birkaç tabanın mutasyonu), sessiz mutagenezi tarafından düzenlemeye yakın benzersiz bir kısıtlama sitesi tanıtın. Sessiz mutajeniz tarafından getirilebilecek kısıtlama sitelerini bulmak için http://heimanlab.com/cut2.html kullanıyoruz.
   1. Mutasyona uğramış kodon'un orijinal mutasyona uğramamış kodonla karşılaştırılabilir bir frekansta tanıtıldığından emin olmak için kodon kullanım sıklığını kontrol edin. Yukarıda belirtildiği gibi, bu her zaman mümkün değildir. Bununla birlikte, birkaç amino asidin mutasyonlarını içeren deneyler için mutant proteinin ifade seviyesinin önemli ölçüde değiştirilmesini beklemiyoruz.
7. HDR için doğrusal tek iplikli onarım şablonlarını 4 nmol ultramer oligos olarak sentezle ve satın al.
8. Onarım şablonunun 1 μg/μL stoğunu yapmak için nükleaz içermeyen suda liyofilize oligonükleotid onarım şablonunu yeniden depolayın ve bir sonraki kullanıma kadar -30 °C'de saklayın.

3. Astar tasarımının taranır

1. CLC sıra görüntüleyici veya diğer benzer uygulamaları kullanarak, sırasıyla düzenlemenin her iki tarafında 20 ila 23 baz çifti ileri ve ters astarlar tasarlayın, böylece PCR amplifikasyonu üzerine 400 ila 600 baz çift arasında bir bant üretirler.
   1. Birkaç kilobases boyutunda daha büyük eklemeler için, ileri astarı onarım şablonunun sol homoloji kolunun hemen dışında yer olacak şekilde tasarlayın. Ters astarı onarım şablonlarının içinde yerleştirilecek şekilde tasarlayın. Bu durumda, bir PCR ürünü yalnızca olumlu düzenlenmiş solucanlar durumunda elde edilecektir.
   2. Daha uzun eklemeler için homozigous tarafından düzenlenmiş solucanları tanımlamak için, ekleme bağlantı noktaları dışında bulunan ileri ve ters astarlar tasarlayarak eklemenin tüm bölgesini güçlendirin.
2. Astarları test edin ve genotipleme için astarları kullanmadan önce vahşi tip genomik DNA ile PCR koşullarını optimize edin.
   1. Genomik DNA'nın PCR amplifikasyonu sırasında (varsa) beklenen boyutta tek bir bant üretildiğinden emin olun.

4. Genç yetişkin solucanların enjeksiyona hazırlanması

1. L2-L3 evre C. elegans'ı MYOB plakasında taze bir bakteri çimine alın ve bir gecede 20 °C'de kuluçkaya yatırın.
   NOT: MYOB plakaları yapma protokolüne buradan ulaşabilirsiniz: http://www.wormbook.org/wli/wbg13.2p12a/
2. Mikroenjeksiyon gününde, enjekte etmek için uterusta 10'dan az embriyo olan genç yetişkin solucanları seçin.

5. Enjeksiyon karışımının hazırlanması

1. Enjeksiyon karışımını steril nükleaz içermeyen tüplerde Tablo 1'de gösterildiği gibi hazırlayın.
   NOT: Enjeksiyon karışımının bileşenleri, bu karışımla gelecekteki enjeksiyonlar öngörülmezse 5 μL enjeksiyon karışımları (20 μL yerine) yapmak için ölçeklendirilebilir.
2. Enjeksiyon karışımını pipetleme ile karıştırın.
3. Ribonokleoprotein komplekslerini monte etmek için enjeksiyon karışımını 37 °C'de 15 dakika kuluçkaya bırakın.
4. Enjeksiyon karışımını 4 °C'de 17.000 x g'da 5 dakika döndürün.

6. C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon

1. CRISPR enjeksiyon karışımının Iyer ve ark. 2019^43'teaçıklandığı gibi C. elegans gonadına mikroenjeksiyonu gerçekleştirin.
   1. CRISPR enjeksiyon karışımı ile yaklaşık 30 solucan enjekte edin. Kullanılmayan enjeksiyon karışımı, verim kaybı olmadan yaklaşık 6 ay boyunca 4 °C'de depolanarak yeniden kullanılabilir⁴⁹.
   2. Mümkünse her iki gonad kolunu da enjekte edin. Enjekte edilen solucanlar P₀ kuşağı olarak kabul edilir.

7. Enjekte solucan kurtarma ve transfer

1. Mikroenjeksiyondan sonra, mikroenjeksiyonlu P₀ solucanlarını bir solucan çekme kullanarak OP50 E. coli ile tohumlanmış 60 mm MYOB agar plakasına taşıyın ve yaklaşık bir saat oda sıcaklığında iyileşmelerini bırakın.
   1. Geri kazanım sıcaklığının enjekte edilen solucanların genotipine bağlı olacağını unutmayın. Örneğin, sıcaklığa duyarlı suşlar için farklı bir sıcaklıkta solucan geri kazanımı gerekebilir.
2. Platin tel solucan toplama kullanarak, enjekte edilen her solucanı tek bir tohumlu 35 mm MYOB agar petri plakasına aktarın ve ertesi güne kadar 20 ° C'de yumurta bırakmalarına izinverin.
   1. Bazı solucanların mikroenjeksiyon prosedüründen kaynaklanan yaralanma sonucu öleceğini unutmayın. Sadece hayatta olan solucanları toplar ve hareket sergiler.
3. 24 saat sonra, enjekte edilen solucanları yeni bireysel plakalara aktarın (plaka başına 1 solucan).

8. C'ninseçilmesi. tarama için eleganlar

1. Enjeksiyon yapıldıktan sonra 20 °C'de 3 ila 4 gün, bir diseksiyon mikroskobu kullanarak enjekte edilen solucanların soylarını içeren tüm plakaları izleyin.
2. Silindir (Rol) ve dumpy (Dpy) fenotipleri sergileyen F₁ soyuna sahip plakaları tanımlayın. Dpy fenotipi, solucanların aynı gelişim aşamasındaki kontrol solucanlarından daha kısa ve stouter göründüğü yerdir (WormBase: https://wormbase.org/species/all/phenotype/WBPhenotype:0000583#0--10). Rol ve Dpy solucanlarına sahip plakalar,_sırasıyla heterozipöz veya homozig durumunda mevcut olacak dpy-10 (cn64) mutasyonu ile F 1 soylarının başarıyla düzenlendiği plakaları temsil eder.
3. Tarama için en silindirli ve dumpy solucanlara sahip plakaları seçin.
4. Bu plakalardan kendi bireysel plakalarına (plaka başına₁ solucan) 50 ila 100 F 1 Rol solucanı ayırır ve yumurta bırakmalarına izin verir.
   1. L4 aşamalı F 1 Rol solucanlarının₁ ila 2 gün boyunca yumurta bırakmasına ve soy (F₂₎üretmesine izin verin.

9. Tek solucan lizisi ve PCR

1. F_{2'yi 1} ila 2 gün ürettikten sonra, her bir F₁ Rol annesini 20 mg/ mL Proteinaz K'nin 1:100 seyreltilmesiyle 2,5 μL lizis tamponuna (Tablo 2) aktarın.
2. Tüpleri -30 °C'de 20 dakika dondurun. Solucanlar bu aşamada bir sonraki analize kadar uzun bir süre saklanabilir.
3. Aşağıdaki koşullarla bir PCR termosikörü üzerinde tek solucan lizisi yapın: 1 saat için 60 °C, 15 dakika 95 °C ve 4 °C'de tutun.
4. Pcr tüpü içeren lysed solucanın 2,5 μL'sine doğrudan aşağıdaki reaktifleri ekleyin: dNTP'ler içeren 12,5 μL 2x PCR karışımı, DNA polimeraz, MgCl₂ ve yükleme boyası, 1 μL 10 μM ileri astar, 1 μL 10 μM ters astar ve steril su 22,5 μL'ye. Her PCR reaksiyonunun toplam hacmi 25 μL'dir.
   NOT: Birden fazla F₁ solucanının taranması durumunda, birden fazla reaksiyon için bir PCR master-mix yapmak ve her liziz tüpüne 22,5 μL ana karışım eklemek daha hızlı ve daha uygundur.
5. Pcr reaksiyonlarını aşağıdaki koşullarla bir termosikçi üzerinde ayarlayın: 1 dakika için 95 °C, 15 s için 95 °C 35 döngü, 15 s için 55 °C (her astar seti için optimize), 1 dakika için 72 °C (her hedef DNA için optimize edin)⁴⁴. Reaksiyonları 4 °C'de tutun.

10. Kısıtlama sindirimi ve agarose jel elektroforezi

NOT: Kısıtlama sindirimi yalnızca küçük düzenlemeleri (50 bp'den az) tararken gereklidir.

1. PCR DNA'sının 10 μL'lik kısmını 9.
2. 15 μL reaksiyon başına 2 ila 4 birim kısıtlama enzimi ve 1x kısıtlama enzim tamponu (1,5 μL 10x reaksiyon tamponu) ekleyin.
3. 37 °C'de (veya enzime özgü diğer sıcaklıkta) 2 saat kuluçkaya yatırın (hızlı etkili enzimlerle daha kısa kuluçka süreleri mümkün olabilir).
4. Isı, PCR tüplerini 65 °C'de (veya enzime özgü diğer sıcaklıkta) 10 ila 15 dakika ısıtarak kısıtlama sindirimini devre dışı bırakın.
5. Her PCR tüpünden gelen tüm reaksiyonun tamamını% 1-2 agarose jelin tek bir kuyusuna yükleyin ve uygun bant ayrımı elde edilene kadar jeli 110 mA'da çalıştırın.
   NOT: Agarose jel üzerinde çalışırken görselleştirme için zaten bir yükleme boyası olan bir PCR karışımı kullanıyoruz. Bu karışım kısıtlama sindirim reaksiyonunu engellemez ve bu nedenle aynı anda birçok solucanı taramak için kullanılması uygundur.

11. Olumlu düzenlenmiş solucanları tanımlayın

1. DNA bant boyutlarını tespit etmek için agarose jellerini UV ışığı altında (ethidium bromür jelleri için) görselleştirin.
   NOT: Pozitif olarak düzenlenmiş solucanlar, solucan genomunda istenen çekirgede kısıtlama alanını taşıyan onarım şablonunu kullanarak düzenleme nedeniyle beklenen boyutta ekstra bir DNA bandı gösterecektir. F₁ silindir solucanlarının düzenleme için heterozygous olması ve bu nedenle üç bant (bir vahşi tip kesilmemiş PCR ürünü ve düzenlenmiş kesilmiş PCR ürününden iki küçük parça) sergilemesi beklenir. Nadir olmasına rağmen, homozigotların ara sıra ortaya çıktığı belirtilmelidir.
2. Düzenlemenin varlığı Sanger dizilimi tarafından doğrulanana kadar tüm orijinal olumlu düzenlenmiş plakaları kaydedin.

12. İlginin homozigoz düzenlemesi

1. İlgili olumlu düzenlenmiş F 1 Rol solucan plakalarından 8 ila₁₂ arasında vahşi tip görünümlü yuvarlanmayan F 2 solucanı seçin ve₁ ila 2 gün boyunca yumurta bırakmalarına ve soy üretmelerine izin verin.
   NOT: C. eleganlar kendi kendine döllenen hermafroditler olduğundan, düzenlenmiş alel canlılığı veya gelişimi etkilemiyorsa, beklenen homozigöz mutantların oranı yaklaşık% 25 olmalıdır. Yuvarlanmayan F₂ solucanları dpy-10 locus için vahşi tip olmalıdır. Yuvarlanmayan solucanları toplamak, dpy-10 (cn64) mutasyonunu kaybetmiş ve yalnızca ilgi geninizde mutasyona sahip olan düzenlenmiş solucanların üretilmesini sağlar.
   1. Dpy-10 geninin kromozom II'de mevcut olduğunu unutmayın. İlgi geniniz dpy-10ile bağlantılıysa, dpy-10 mutasyonunu ilgi geninizden kolayca ayıramayabilirsiniz.
2. Homozigöz solucan çizgilerini tanımlamak için 9 ile 11 arasında adımlar gerçekleştirin.

13. Sıralama yaparak düzenlemeyi onaylayın

1. Homozigöz solucanlar tanımlandıktan sonra, adım 9'da açıklandığı gibi lizis ve PCR gerçekleştirin.
   1. Sıralanacak her homozigöz hat için en az 3 PCR reaksiyonları ayarlayın.
2. PCR arıtma kiti kullanarak PCR reaksiyonlarını arındırın.
3. Nanodrop spektrofotometre kullanarak DNA konsantrasyonunu ölçün.
4. Sanger dizilimi için ilgili ileri astar ile örnek gönderin. İleri astarın sıralanacak düzenlemeden en az 50 taban uzakta olacak şekilde tasarlandığından emin olun.
5. Düzenlemenin varlığını onaylamak için sıra analiz yazılımını kullanarak sıralama sonuçlarını analiz edin.

rbm-3.2, insan dekolte stimülasyon faktörü alt birimi 2 tau varyantı (WormBase: https://wormbase.org/species/c_elegans/gene/WBGene00011156#0-9fcb6d-10) için homolojiye sahip putatif bir RNA bağlayıcı proteindir. RBM-3.2 proteini, protein fosfataz 1 (GSP-1) ve düzenleyicileri Inhibitör-2 (I-2SZY-2)ve SDS-22'nin bağlayıcı bir ortağı olarak tanımlanmıştır. Şu anda, C. elegans rbm-3.2 geninin işlevi hakkında çok az şey bilinmektedir. Bu nedenle, C. elegans rbm-3.2 geninin biyolojik rolünü daha fazla araştırmak için, rbm-3.2-null allele rbm-3.2 (ok688) Caenorhabditis Genetics Center'dan (CGC) eldeedildi.

Ne yazık ki, tüm rbm-3.2 geninin silinmesine ek olarak, rbm-3.2 (ok688) alelesi de üst üste binen bir genin kısmi olarak silinmesine neden olur, rbm-3.1, böylece genetik analizi karmaşıklaştırır. Bu nedenle, RBM-3.2 geninin C. elegans'taki rolünü doğru bir şekilde araştırmak için CRISPR/Cas9 düzenlemesini kullanarak C. elegans rbm-3.2 kodlama bölgesinin başlangıcına çok yakın üç erken durdurma kodonunu tanıttık ve üst üste gelen rbm-3.1 geni bozulmadan bıraktık.

Bu erken durdurma kodonlarını C. elegans rbm-3.2 genine tanıtmak için, DNA'nın karşı teli (şablon iplikçik) üzerinde bulunan pam motifli bir crRNA tasarladık (Şekil 1A). Cas9 kesim alanı, rbm-3.2 başlangıç kodon ATG'sinden 6 taban uzakta bulunuyordu. RBM-3.2 genine erken durdurma kodonları sokmak, Aşağıdaki beş ana özelliğe sahip bir onarım şablonu tasarladık: 1) RBM-3.2 başlangıç kodonunun (sol homoloji kolu) rbm-3.2 yukarı akışına 35 kesintisiz homoloji tabanı 2 ) PAM motifini içeren kısa bir taban alanı silindi 3) Tarama için başlangıç kodonunun hemen ardından bir EcoRI kısıtlama sitesi tanıtıldı 4) RBM-3.2'nin ikinci ve üçüncü kodonları silindi ve rbm-3.2 mRNA 5'in çevirisini durdurmak için beşinci RBM-3.2 kodon'dan sonra üç stop codon tanıtıldı) Rbm-3.2'nin ilk intronuna 35 kesintisiz homoloji tabanı edit'in aşağı akışına dahil edildi (sağ homoloji kolu) ( Şekil1B).

Bu CRISPR deneyi için enjeksiyon karışımı Tablo I'debelirtildiği gibi hazırlanmıştır. Enjeksiyon karışımı ribonokleoprotein komplekslerini monte etmek için 15 dakika boyunca 37 °C'de inkübe edildi. Karışım daha sonra santrifüjlendi ve çekilen mikroenjeksiyon iğnesine yüklendi. C. elegangonad içine mikroenjeksiyon Iyer ve ark. 201943'teaçıklandığı gibi gerçekleştirildi.

Şekil 2, bu protokolü kullanarak düzenlenmiş C. elegans oluşturmak için deneysel zaman çizelgesini tasvir eder. Her CRISPR deneyi için tipik olarak 30 solucan enjekte etsek de, bazı laboratuvarlar her CRISPR deneyi için daha az solucan (10 ila 20 arasında) enjekte eder. Daha fazla solucan enjekte etmek olumlu düzenlemeler bulma olasılığını artırdığından, daha fazla sayıda solucan enjekte etmeyi tercih ediyoruz. Birçok laboratuvar tarama için "jackpot" kuluçkalarını (P'den fazla Rol ve Dpy soyuna sahip plakalar) seçer. Birkaç CRISPR deneyi yaptıktan sonraki deneyimimizde, jackpot yavruları ara sıra ortaya çıksa da, çoğu zaman, tarama için seçilen Rol solucanları genellikle her biri birkaç Rol soyundan oluşan birçok farklı P0 plakasından gelir. Bu deneyde büyük ikramiye yavruları elde edildi.

Toplamda, düzenlemenin varlığı için 7 enjekte edilen P0 solucanından elde edilen 73 F1 Rol solucanının genomik DNA'sını taradık. Rbm-3.2 geninin başlangıç kodonlarına göre tarama astarlarının dizileri ve konumları Şekil 3A'datemsil edilmektedir. Analizimiz sayesinde, 73 F1 solucandan 7'sinin düzenleme için olumlu olduğu bulundu (%9,5) (Şekil 3B). Düzensiz solucanlar EcoRI sindirimi üzerine 445 bp'lik tek bir DNA parçası gösterdi. Rbm-3.2 geninde prematüre stop codon taşıyan solucanlar EcoRI sindirimi üzerine sırasıyla 265 bp ve 166 bp'lik iki parça sergilediler. Heterozipöz olarak düzenlenmiş solucanlar EcoRI sindirimi üzerine üç parça gösterdi: rbm-3.2 geninin düzenlenmiş kopyasından sırasıyla 445 bp'lik bir vahşi tip düzenlenmemiş DNA parçası ve sırasıyla 265 bp ve 166 bp'lik iki DNA parçası.

Homozigot düzenleri taşıyan solucanları tanımlamak için, tanımlanan pozitif F 1 heterozygotlardan12 F2 solucanını yeni bireysel plakalara aktardık ve soy üretmelerine izin verdik (F3). F2 solucanları daha önce açıklandığı gibi homozigozite taramasından geçirildi. 12 üzerinden 6 (P) taranmış solucanların ilgi alanı düzenlememiz için homozigous olduğu bulunmuştur (Şekil 4A). Tanımlanan homozigöz düzenlemeli bir solucan hattının genomik DNA'sı DNA dizileme reaksiyonunun kurulmasında kullanıldı. DNA dizileme analizi, düzenlemenin homozig durumunda varlığını doğruladı (Şekil 4B). Genel olarak, tüm homozygous tarafından düzenlenmiş solucan çizgilerinin aynı fenotipi (null mutasyon belirli bir fenotip üretiyorsa) sergilediğini sağlamak için birden fazla homozigöz solucan çizgisini sıralamak faydalıdır. Ayrıca, batı şişkinliği veya RT-PCR gibi ifade tabanlı bir test kullanarak veya fenotip analizi yoluyla gen nakavtlarını doğrulamak da gerekebilir. Bunun nedeni, genin başlangıcında erken durdurma kodonlarının tanıtılmasına rağmen, prematüre durdurma kodonlarının aşağı akışlarında alternatif bir ATG'nin mevcut olması mümkündür. Bu ATG protein ekspresyon başlatmak için kullanılabilir, bu da kısmen fonksiyonel bir kesilmiş protein ile sonuçlanır.

Tablo 1: Riboncleoprotein kompleksleri ve dpy-10'u ortak CRISPR işaretleyicisi olarak kullanarak CRISPR/Cas9 düzenlemesi için enjeksiyon karışımının bileşenleri. Enjeksiyon karışımını yaparken steril teknikler ve RNase içermeyen reaktifler kullanın. Enjeksiyon karışımını yapmak için steril, DEPC arıtılmamış nükleaz içermeyen su kullanıldığını lütfen unutmayın.

Tablo 2: Solucan liziz tampon tarifi. Solucan liziz tamponu uzun süreli depolama için toplu, otoklavlı, filtrelenmiş ve aliquoted yapılabilir (NOT: lizis tamponu oda sıcaklığında bir yıldan fazla saklanabilir). Her kullanımdan hemen önce solucan liziz tamponu için 20 mg/mL proteinaz K 1:100 seyreltme ekleyin.

Şekil 1: RBM-3.2 prematüre stop CRISPR için crRNA ve onarım şablonu tasarımını gösteren şematik. A. rbm-3.2 geninin kodlama ve şablon iplikçiklerini crRNA dizisi ve şablon dizisinde bulunan PAM motif dizisi ile gösteren şematik. B. RBM-3.2 genine üç erken durdurma kodon tanıtmak için sentezlenen onarım şablonunun farklı özelliklerini temsil eden şematik. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Önceden monte edilmiş ribonucleoprotein kompleksleri ve ortak CRISPR işaretçisi olarak dpy-10 kullanarak CRISPR/Cas9 düzenlemesi ilehomozygous-edited C. elegans oluşturmak için deneysel zaman çizelgesi. CRISPR/Cas9 düzenleme yöntemini kullanarak homozigous-edited C. elegans oluşturmak için gerçekleştirilmesi gereken adımların günlük dökümü. Kısaca, 30 solucan mikroenjeksiyon kullanılarak CRISPR düzenleme karışımı ile enjekte edildi ve OP50 E. coliile tohumlanmış bireysel MYOB plakalarına ayrıştırıldı. 24 saat sonra, enjekte edilen P0 solucanları taze yeni MYOB plakalarına aktarıldı ve yumurta bırakmaya devam etmesine izin verildi. Mikroenjeksiyondan sonraki 3. ve 4. günlerde plakalarda Rol F1 solucanlarının varlığı incelendi. Maksimum Rol ve Dpy F1 solucan sayısına sahip plakalar seçildi ve 73 F1 Rol solucanı (CRISPR deneyi başına genellikle 50 ila 100 F1 Rol solucanı topluyoruz) yeni bireysel MYOB plakalarına (plaka başına 1 solucan) tek tek verildi ve yaklaşık 2 gün boyunca yumurta bırakmasına izin verildi. Mikroenjeksiyondan sonraki 6. günde, progeny (F2)üreten F1 solucanlarından solucan lizazları hazırlandı ve PCR tarafından düzenlemenin varlığı ve ardından EcoRI ve agarose jel elektroforezi ile kısıtlama sindirimi için tarandı. 7. Günde, Rol olmayan 12, Dpy olmayan F2 solucanları pozitif plakalardan yeni bireysel plakalara aktarıldı ve soy üretmesine izin verildi (F3). 9. günde, F2 solucanları daha önce açıklandığı gibi düzenlemenin homozigozitesi için tarandı. 10. günde homozigous F3 solucanları için solucan lizisi, PCR ve PCR temizliği yapıldı ve DNA konsantrasyonu NanoDrop spektrofotometre kullanılarak ölçüldü. 11. günde, Sanger dizileme reaksiyonları pozitif örnekler için kuruldu ve reaksiyonlar DNA dizilemesi için gönderildi. 12. günde sıralama sonuçları analiz edildi ve düzenlemenin varlığı bir sıra analiz yazılımı (örneğin CLC sıra görüntüleyici) kullanılarak doğrulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Rbm-3.2 prematüre stop kodonları için heterozipöz olan C. eleganların taranır. EcoRI ile sindirilen C. elegans genomik PCR DNA'sının agarose jel elektroforezi görüntüleri. 73 bireysel F1 solucanı genotiplendi ve rbm-3.2 düzenlemesinin varlığı için tarandı. Kırmızı sayılar ve yıldız işaretleri pozitif düzenlenmiş solucanları gösterir. Pozitif olarak düzenlenmiş 7 C. elegans'ın tümü, EcoRI sindirimi üzerine rbm-3.2 geninin düzenlenmiş kopyasından sırasıyla 445 bp'lik bir vahşi tip düzenlenmemiş DNA parçası ve 265 bp ve 166 bp'lik iki DNA parçası sergiledikleri için düzenleme için heterozygous oldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Rbm-3.2 prematüre stop kodonlarını taşıyan homozygous düzenlemeli C. eleganların tanımlanması ve doğrulanması. A. RBM-3.2 prematüre stop codons için homozigous C. elegans içintarama. EcoRI ile sindirilen C. elegans genomik DNA'sının agarose jel elektroforezi görüntüleri. Pozitif plakalardan12 ayrı F 2 solucanı genotiplendi ve rbm-3.2 düzenlemesinin homozigozitesi açısından tarandı. Kırmızı: homozigous-düzenlenmiş solucanlar. Taranan 12 F2 solucanının 6'sı (P) rbm-3.2 prematüre stop kodonları için homozigous idi. Solucan 7 için PCR ürünü yoktu. B. ERKEN DURDURMA KODONLARININ RBM-3.2'ye yerleştirilmesi dna dizilimi ile doğrulanıyor. Düzenlenmemiş ve düzenlenmiş homozigotların DNA ve protein dizilerinin karşılaştırılını gösteren şematik. Homozigöz düzenlemeli solucanlardan elde edilen genomik DNA'nın DNA dizileme sonuçlarının analizi CRISPR/Cas9 düzenlemesi üzerine rbm-3.2 geninde üç erken durdurma kodonunun varlığını doğruladı. CRISPR/Cas9 düzenlemesinden sonra ortaya çıkan tüm amino asit değişiklikleri kırmızı harflerle veya kırmızı yıldızlarla gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.