Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model

4.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/62003

⸱

10 Nisan 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Advanced Innovation Centre for Biomedical Engineering, Key Laboratory for Biomechanics and Mechanobiology of Chinese Education Ministry, School of Biological Science and Medical Engineering, Beihang University, 2School of Engineering Medicine, Beihang University, 3Artificial Intelligence Key Laboratory of Sichuan Province, School of Automation and Information Engineering, Sichuan University of Science and Engineering, 4Beijing Research Center of Urban System Engineering

Bu makalede

Özet

Burada, bir mikroakışkan çip ve neovaskülarizasyonun ilk mikroçevresini yeniden sağlayan, endotel hücrelerinin (VC' ler) yüksek luminal kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve çeşitli vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) dağılımı ile aynı anda uyarılmasını sağlayan otomatik olarak kontrol edilen, yüksek verimli bir sirkülasyon mikroakışkan sistemi sağlıyoruz.

Özet

Neovaskülarizasyon genellikle mevcut normal bir vaskülatörden başlatılır ve ilk aşamada endotel hücrelerinin (VC) biyomekanik mikroçevrasyonu aşağıdaki neovaskülarizasyon sürecinden önemli ölçüde değişir. Neovaskülarizasyonun farklı aşamalarını simüle etmek için birçok model olmasına rağmen, normal vaskülür mikroçevronmentlerinin karşılık gelen stimülasyonları altında neovaskülarizasyonun ilk sürecini teslim eden bir in vitro 3D model hala eksiktir. Burada, neovaskülarizasyonun (MIEN) ilk olayını taklit eden bir in vitro 3D modeli yeniden inşa ettik. MIEN modeli bir mikroakışkan filizlenen çip ve otomatik kontrol, yüksek verimli sirkülasyon sistemi içerir. Endotel ile kaplanmış fonksiyonel, perf kullanılabilir bir mikrokanal oluştu ve mikroakışkan filizlenme çipinde filizlenme süreci simüle edildi. Neovaskülarizasyonun başlangıçtaki fizyolojik mikroçevresi, VC'lerin aynı anda yüksek ışıklı kesme stresine, fizyolojik transendotelyal akışa ve çeşitli vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) dağılımlarına maruz kalacağı mikroakışkan kontrol sistemi ile yeniden düzenlendi. MIEN modeli, neovaskülarizasyon mekanizmasının çalışmasına kolayca uygulanabilir ve ilaç taraması ve toksikoloji uygulamaları için düşük maliyetli bir platform olarak potansiyel bir vaatte bulunmaktadır.

Giriş

Neovaskülarizasyon, yetişkinlerde anjiogenez ve arteriogenez 5 olmak üzere iki ana süreci içeren birçok normal ve patolojik süreç1,2,3,4'te gerçekleşir. Vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF)6gibi en iyi bilinen büyüme faktörlerinin yanı sıra, mekanik stimülasyonlar, özellikle kan akışı kaynaklı kesme stresi, neovaskülarizasyonun düzenlenmesinde önemlidir7. Bildiğimiz gibi, kesme stresinin büyüklüğü ve formları vaskülarürün farklı bölgelerinde önemli ölçüde ve dinamik olarak değişir ve vasküler hücreler üzerinde önemli etkilere neden olan 8,9,10,11,12. Önceki çalışmalar, kesme stresinin hücre fenotipik değişiklikler, sinyal transdüksiyon, gen ekspresyasyonu ve duvar hücreleri 13 , 14 , 15 , 16,17,18,19,20ile iletişim dahil olmak üzere VC'lerin çeşitli yönlerini etkileyebileceğini göstermiştir; bu nedenle, neovaskülarizasyonu düzenleyin21,22,23,24.

Bu nedenle, neovaskülarizasyonu daha iyi anlamak için, süreci doğal hücresel mikroçevrici in vitro olarakyeniden oluşturmak önemlidir. Son zamanlarda, mikro gıda ve mikroakışkan teknolojideki gelişmelerden yararlanarak mikro damarlar oluşturmak ve mikroçevre25,26,27'ninhassas kontrolünü sağlamak için birçok model kurulmuştur. Bu modellerde, mikro damarlar hidrojel28 , 29,polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan çipler30 , 31,32 veya 3D biyobaskı33,34ile üretilebilir. Işıklı kesme stresi22 , 23,35 , 36,transendotelial akış37,38,39,40, biyokimyasal gibi mikroçevrenin bazı yönleri anjiyojenik faktörlerin gradyani41,42, gerinim / streç43,44,45ve diğer hücre türleriyle birlikte kültürlenmiş32,46 taklit edilmiş ve kontrol edilmiştir. Genellikle, perfüzyonlu ortam sağlamak için büyük bir rezervuar veya şırınna pompası kullanılmıştır. Bu modellerde transendotelial akış rezervuar ve mikro tüp arasındaki basınç düşüşü ile oluşturulmuştur22,23,38,40. Bununla birlikte, mekanik mikroçevretmenin bu şekilde sürekli olarak sürdürülmesi zordu. Perfüzyon için yüksek kesme stresi olan yüksek bir akış hızı kullanılırsa transendotelial akış artacak ve daha sonra fizyolojik seviyeyi aşacaktı. Önceki çalışma, neovaskülarizasyonun ilk döneminde, genellikle 0.05 μm / s8'inaltında, bozulmamış WC'ler ve bodrum membran nedeniyle transendotelial akış hızının çok düşük olduğunu göstermiştir. Bu arada, vasküler sistemde parlak kesme stresi büyük ölçüde değişmekle birlikte, 5-20 dyn /cm 2,11,47ortalama değerleri ile nispeten yüksektir. Şimdilik, önceki çalışmalarda transendotelyal akışın hızı genellikle 0,5-15 μm /s22,38,39,40arasında tutulmuştur ve ışık kesme stresi genellikle 10 dyn/cm2 23'ünaltındadır. VC'leri sürekli olarak yüksek ışık yarıçapı stresine ve fizyolojik transendotelyal akış seviyesine aynı anda maruz bırakmak zor bir konu olmaya devam etmektedir. 

Bu çalışmada, neovaskülarizasyonun (MIEN) ilk olayını taklit etmek için bir in vitro 3D modeli tarif ediyoruz. Perfüzyon mikro tüpleri oluşturmak ve filizlenme sürecini simüle etmek için bir mikroakışkan çip ve otomatik kontrol, yüksek verimli sirkülasyon sistemigeliştirdik. MIEN modeli ile, neovaskülarizasyonun ilk döneminde uyarılan EC'lerin mikroçevrimi öncelikle yeniden kapsüllenir. WC'ler yüksek ışıklı kesme stresi, fizyolojik transendotelyal akış seviyesi ve aynı anda çeşitli VEGF dağılımı ile uyarılabilir. MIEN modelini oluşturma adımlarını ve dikkat edilmesi gereken önemli noktaları ayrıntılı olarak açıklıyoruz, diğer araştırmacılar için bir referans sağlamayı umuyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Gofret hazırlığı

NOT: Bu protokol, bu araştırma sırasında kullanılan SU-8 2075 negatif fotoresist için özeldir.

  1. Silikon gofreti bir spin kaplayıcı üzerinde metanol ve izopropanol ile 3 ila 5 kez temizleyin: önce 500 rpm'de 15 s için spin ve ardından 3.000 rpm'de 60 s için döndürün.
  2. Silikon gofreti önceden 180 °C'ye ısıtılmış bir ocaklara aktarın ve gofreti 10 dakika pişirin.
  3. Silikon gofretleri ocaktan çıkarın ve oda sıcaklığına soğutun. Spin kaplamasına geçmeden önce gofreti basınçlı hava ile tekrar temizleyin. Gofretin ortasına 4 mL SU-8 2075 fotoresist uygulayın.
  4. Spin kaplayıcıda 70 μm'lik bir özellik yüksekliği elde edin: önce 500 rpm'de 12 sn için spin ve ardından 2.100 rpm'de 50 s için döndürün.
  5. Gofretleri bir ocakta aşağıdaki gibi yumuşak pişirin: önce 65 °C'de 8 dakika pişirin, sonra 95 °C'de 20 dakika pişirin. Daha sonra, silikon gofretleri ocaktan çıkarın ve litografiden önce oda sıcaklığına soğutun.
  6. Fotoresist filmin üzerine bir fotomask yerleştirin. Toplam 200 mJ/cm2pozlama elde etmek için gofretleri bir litografi ekipmanı ile maruz bırakın.
    NOT: Fotomask, çipin dokuz desen setini içerir, böylece her seferinde dokuz mikroakışkan filizlenen çip üretebilir.
  7. Gofretleri bir ocakta aşağıdaki gibi açığa çıkar: önce 65 °C'de 5 dakika pişirin ve sonra 95 °C'de 20 dakika pişirin. Daha sonra, silikon gofretleri ocaktan çıkarın ve gelişmeden önce oda sıcaklığına soğutun.
  8. Gofret, geliştirmeye başlamak için SU-8 geliştiricisi (PGMEA) ile dolu bir cam Petri kabına aktarın.
    DİkKAT: Geliştirici gözlere ve solunum yollarına tahriş edicidir. Duman kaputunda geliştirme gerçekleştirin. Operasyon sırasında sıçrama gözlükleri, nitril eldivenler ve havayolu maskesi takın.
  9. Yemeği akış kanalının yönü boyunca hafifçe sallayın ve geliştiriciyi 10 dakika sonra değiştirin.
  10. Desenler net bir şekilde gözlemlenine kadar 1,9 adımını 3-5 kez tekrarlayın.
    NOT: Gofret üzerinde fotoresist kalıntısı kalmadığından emin olun, aksi takdirde gofreti geliştiricide tekrar durulayın.
  11. Gofreti önceden ısıtılmış 120 °C'ye ayarlanmış bir ocaka aktarın ve 30 dakika pişirin.
  12. Pipet 35 μL silane bir kapakçık üzerine, daha sonra kapak kapağını gofret ile birlikte bir kurutucuya koyun ve vakumu çekin. Kurutucuyu kapatın ve yumuşak litografi işlemleri sırasında PDMS'nin yapışkanlığını önlemek için gofreti silezlemek için gofreti 4 saat boyunca vakum altında bırakın.
    DİkKAT: Silane toksiktir. Zehirlenmeyi önlemek için duman kaputunda silanizasyon gerçekleştirin ve elleçleme yaparken nitril eldiven giyin.
  13. Vakumyu kurutucudan serbest bırakın. Silanize gofreti önceden ısıtılmış bir ocak üzerine çıkarın ve 2 saat boyunca 65 °C'de pişirin.
  14. Gofretleri gerekli olana kadar temiz bir Petri kabında saklayın.

2. Mikroakışkan filizlenen çip imalatı

  1. 20 g baz madde ve 2 g kürleme maddesini (10:1 oranı) plastik bir kapta birleştirin ve bir karıştırma çubuğu ile iyice karıştırın.
  2. Kabı bir kurutucuya yerleştirin ve PDMS karışımındaki hava kabarcıklarını çıkarmak için 1 saat boyunca vakum çekin.
  3. PDMS karışımını Petri kabındaki gofrete dökün ve Petri kabını 30 dakika daha gazdan arındırarak kurutucuya geri yerleştirin.
    NOT: Gaz giderme ve kürleme sırasında gofretin yatay tutulmasını sağlamak için gofreti Petri kabının altına yapıştırmak için çift taraflı yapışkan bant kullanılması yararlıdır.
  4. Petri kabını kurutucudan çıkarın ve tedavisi için 3 saat boyunca 80 °C kuru bir fırına yerleştirin.
  5. PDMS katmanını gofretten dikkatlice ayırın ve desene göre neşterle tabakayı dokuz yongaya kesin.
    NOT: Ayırmadan sonra özellik tarafını yukarıda tutun.
  6. Her çipten sırasıyla 1 mm ve 3,5 mm biyopsi zımbası kullanarak iki hidrojel enjeksiyon portu ve dört ortam enjeksiyon portu dene.
  7. PDMS kalıntılarını gidermek için delikli talaşları kalıntısız bantla temizleyin. Çipleri ve dokuz cam kapak kapağını bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve yüzeyde kursel yapıştırma oluşturmak için 30 s oksijen plazması ile tedavi edin.
  8. Cipsleri ve kapakları çıkar. Talaşların özellik tarafını kapak kapaklarına takın.
  9. Bağlanmayı yoğunlaştırmak için bağlı talaşları 1 saat boyunca 80 °C kuru bir fırına yerleştirin.
  10. Çipleri kullanmadan önce otoklavlayın ve işlemin geri kalanında steril tutun.

3. Yüzey modifikasyonu ve hidrojel enjeksiyonu

  1. Her çip için, boru 40 μL 1 mg /mL poli-D-lizin (PDL) ve hidrojel enjeksiyon portundan çipteki kanallara enjekte edin.
    NOT: PDL'nin özellikle bağlantı noktalarının yakınındaki dar kanallarda kanalları doldurduğundan emin olun.
  2. PDMS'nin yüzeyini değiştirmek için çipleri 37 °C'de 4 saat kuluçkaya yatırın.
  3. Pipet 200 μL steril su ve PDL'yi yıkamak için hidrojel enjeksiyon portundan çipteki kanallara enjekte edin.
  4. Hidrofobikliği geri yüklemek için talaşları 3 saat boyunca 120 °C kuru bir fırına çıkarın.
  5. Buz üzerine steril bir tüp yerleştirin ve aşağıdaki denklem olarak kullanılacak Tip I kolajen hacmini hesaplayın.
    Son hacim (50 μL) x Son kollajen konsantrasyonu (bu araştırmada 3 mg/mL) / Şişede konsantrasyon = eklenecek hacim kollajen
  6. Aşağıdaki denklem olarak kullanılacak NaOH hacmini hesaplayın.
    (eklenecek hacim kollajeni) x 0.023 = cilt 1 N NaOH
  7. Aşağıdaki protokol olarak tüpte 50 μL hidrojel hazırlayın: 5 μL 10x PBS, 0,5 μL fenol kırmızısı, hesaplanan hacim 1 N NaOH, 4 μL 1 mg / mL Fibronektin, sırayla Tip I kolajen hesaplanan hacmi ekleyin. Toplam hacmin 50 μL'ye ulaşması için uygun miktarda dH2O ekleyin.
    NOT: Tüm işlemleri buz üzerinde gerçekleştirin. Hidrojel pH'ının görsel olarak belirlenmesine yardımcı olmak için asit bazlı bir gösterge olarak fenol kırmızısı kullanın. PH yaklaşık 7.4 ve sertlik yaklaşık 15 kPa49olduğunda son hidrojel turuncu olur.
  8. Her çip için pipet 2-3 μL hidrojel ve yavaşça hidrojel enjeksiyon portundan merkezi hidrojel kanalına enjekte edin.
  9. Jelleşmeyi sağlamak için talaşları 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya bırakın.
    NOT: Çipleri hemen kullanılmazlarsa 1 mL steril su ile kapalı bir kutuya kapatın. Sızdırmaz talaşlar 37 °C'de en fazla 24 saat saklanabilir.

4. Hücre tohumlama

  1. Hücre kültürü kanalının bir ortam enjeksiyon portuna pipet 20 μL 125 μg/mL Fibronektin.
  2. Hücre kültürü kanalının bağlantı noktasına makasla uyacak şekilde bir pipet ucu kesin.
  3. Pipet ucunu hücre kültürü kanalının diğer ortam ekleme bağlantı noktasına yerleştirin. Sonra, fibronektin ile doldurmak için hücre kültürü kanalından hava boru.
  4. Çipleri 37 °C'de 1 saat kuluçkaya yatırın.
  5. Hücre tohumlamadan önce, her bir ortam enjeksiyon bağlantı noktasına 20 μL ECM ortam borulayın ve çipleri 37 °C'de 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  6. Ardından, tüm ortam ekleme bağlantı noktalarındaki tüm ortamları boruyla dışarı atın.
  7. Daha sonra, hücre kültürü kanalının bir ortam enjeksiyon bağlantı noktasına 5 μL hücre süspansiyonu pipet. Daha sonra endotel hücreleri diferansiyel hidrostatik basınç altında hızla tüm kanala yayılır.
    NOT: İnsan göbek damarı endotel hücrelerini (HUVEC' ler) kültür şişesinden deneyerek ve 400 x g'da santrifüj ederek hücre süspansiyonunu hazırlayın. Daha sonra, hücreleri bir tüpte 107 hücre / mL'ye yeniden biriktirin.
  8. Hidrostatik basıncı ayarlamak ve hücrenin hareket etmesini durdurmak için diğer bağlantı noktasına yaklaşık 4-6 μL ECM ortamı ekleyin.
  9. Çipleri hücre inkübatörüne çıkarın. Daha sonra, endotel hücreleri hücre kültürü kanalının iç yüzeyini kaplayana kadar her 30 dakikada bir talaşları ters çevirin (Şekil 1).
    NOT: Çipi baş aşağı yapmak için kapak kapağının arkasına biraz su borulayın. Daha sonra çip Petri kabının kapağına takılabilir.
  10. Enjeksiyon bağlantı noktalarındaki ekli hücreleri çok dikkatli bir şekilde çıkarmak için pipet ucunu kullanın.
  11. Ardından, ortam enjeksiyon portlarına dört dikenli dişi Luer adaptörü yerleştirin ve ECM ortamıyla doldurun.
    NOT: Adaptörler, kanaldaki hücrelere besin sağlamak için sıvı rezervuarları olarak işlev görür.
  12. Çipleri hücre inkübatörüne çıkarın. Luer adaptörlerindeki ECM medyayı her 12 saat değiştirin.

5. FITC-dekstran difüzyonal geçirgenliğin ölçümü

NOT: Mikro damarın bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için, EC kültür kanalının hücre astarlı veya hücre astarsız difüzyonal geçirgenliği değerlendirilir.

  1. Hidrojel enjekte edilmiş bir mikroakışkan filizlenen çipi çıkar.
  2. 4.1-4.6 arası adımları yineleyin.
  3. Tüm Luer adaptörlerini çıkarın ve dört ortam enjeksiyon bağlantı noktasındaki tüm medyayı boruyla çıkarın.
  4. Çipi konfokal lazer tarama mikroskobuna yerleştirin.
  5. Hücre kültürü kanalının bir bağlantı noktasına 500 μg/mL 40 kDa FITC-dektran içeren pipet 5 μL kültür ortamı.
    NOT: 40 kDa FITC-dektran, VEGF-165 (39-45 kDa) ile benzer moleküler boyuta sahiptir.
  6. 30 s için her 3 sn'de bir görüntü yakalayın. Böylece hücre astarı olmayan difüzyonal geçirgenlik ölçülür.
  7. HUVEC'ler hücre kültürü kanalında bir araya geldikten sonra mikroakışkan filizlenen çipi çıkar.
  8. 5.3-5.5.
  9. 30 s için her 3 sn'de bir görüntü yakalayın. Böylece hücre astarı ile difüzyonal geçirgenlik ölçülür.
  10. Aşağıdaki değiştirilmiş denklemi kullanarak zaman içinde floresan yoğunluğundaki değişiklikleri ölçerek difüzyonal geçirgenliği hesaplayın50.
    Pd= (I2- I1) / ((I1- Ib)· Δt) · S/d
    burada, Pd difüzyonal geçirgenlik katsayısıdır, I1 ilk zaman noktasında ortalama yoğunluk, I2 delta süresinden sonraki ortalama yoğunluk (Δt), Ib arka plan yoğunluğudur, S floresan görüntülerde kanalın alanıdır ve d floresan görüntülerdeki mikro direklerin toplam aralığıdır. Mevcut çalışmada, Δt 9 s olarak ayarlanır.
    NOT: Mevcut denklem orijinal50'denbiraz farklıdır Çipteki floresanın difüzyon yönü sadece EC kanalından hidrojel kanala kadardır, bu da tüm radyal yönde yayılan dairesel tüp gibi değildir.

6. Mikroakışkan kontrol sistemi kurulumu

NOT: Bu çalışmadaki mikroakışkan kontrol sistemi bir mikro şırınga pompası, bir elektromanyetik sıkıştırma vanası, bir kabarcık tuzak çipi, bir mikroakışkan çip, bir mikro-peristaltik pompa ve bir rezervuardan oluşmaktadır. Sistemin her parçası aynı işlevi yerine getirebilecek alternatifler ile değiştirilebilir.

  1. Kabarcık tuzak çip imalatı
    NOT: Kabarcık tuzak çipi dolaşımdaki hava kabarcıklarını gidermek için kullanılır. Çip üç PDMS katmanından oluşur. Üst katman, sıvı odası olarak ızgara yapısını oluşturmak için yumuşak litografi kullanılarak inşa edilir. Şebeke yapısının her kanalı 100 μm genişliğindedir. Alt katman, delikli bir PDMS öbeğidir. İki katman arasında 100 μm ince pdms film serilir.
    1. Gofret'i kabarcık tuzak çipi için hazırlamak için 1.
    2. Kabarcık tuzak çipinin üst katmanını ve alt katmanını oluşturmak için 2.1-2.5 adımlarını yineleyin.
      NOT: Üst katmanın fotokütlesi üç desen kümesi içerir, bu nedenle PDMS katmanını desene göre üç yongaya kesin.
    3. 3,5 mm biyopsi zımbası kullanarak üst tabakanın giriş ve çıkış kanallarının ucunda altı delik açın.
    4. Üst katmandaki desene göre 6 mm biyopsi zımba kullanarak alt katmanın ilgili konumunda iki delik açın.
    5. 10 g PDMS karışımı hazırlamak için 2.1-2.2 adımlarını tekrarlayın ve temizlenmiş bir silikon gofretin ortasına dökün.
    6. Aşağıdaki spin protokolünü uygulayarak 100 μm PDMS film üretin: 500 rpm'de 15 sn için spin yapın, spin hızını 1.300 rpm'ye çıkarın ve burada 45 s tutun.
    7. Gofreti önceden ısıtılmış 180 °C'ye ayarlanmış bir ocaka aktarın ve 30 dakika pişirin.
    8. PDMS kalıntılarını gidermek için delikli katmanları kalıntısız bantla temizleyin. Üst katmanları yerleştirin ve bir plazma temizleyicisine gofretleyin ve yüzeyde kursel yapıştırma oluşturmak için 30 s oksijen plazması ile tedavi edin.
    9. Üst katmanları çıkar ve gofret. Üst katmanların unsur tarafını PDMS filmine takın.
    10. Filmi bir iğne ile üst katmanların kenarı boyunca dikkatlice kesin.
    11. Filmi gofretten yavaşça ayırın ve ayrıldıktan sonra film tarafını yukarı çekmek için çipleri ters çevirin.
    12. Alt katmanları ve takılı talaşları bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve tekrar 30 s oksijen plazması ile tedavi edin.
    13. Alt katmanları ve takılı talaşları çıkar. Alt katmanları PDMS filmine takın ve kabarcık kapanı çipleri yapılır.
      NOT: Alt katmandaki delikleri, eklerken üst katmandaki desenlerle hizalayın.
    14. Yapıştırma işlemi yoğunlaştırmak için talaşları 1 saat boyunca 80 °C kuru bir fırına yerleştirin.
  2. Mikroakışkan kontrol sistemini monte edin
    NOT: Elektronik ekipmanlar hariç, sistemin kabarcık tuzak çipi, rezervuar, tüpler ve konektörler gibi tüm parçaları otoklav sterilizasyondan sonra kullanılır. Mikroakışkan kontrol sistemini temiz bir tezgaha monte edin.
    1. Mikroakışkan kontrol sistemini monte etmek için iki politetrafloroetilen tüp, iki kısa silikon tüp, üç uzun silikon tüp, bir dikenli dişi Luer adaptörü, bir Y tipi konektör ve üç L tipi konektör hazırlayın.
      NOT: Politetrafloroetilen tüpün avantajı düşük elastikiyettir, bu nedenle boru hattında daha az ortama ihtiyaç vardır. Silikon tüp, aksine, yüksek elastikiyete sahiptir, bu nedenle sıkıştırma valfi ve peristaltik pompa için uygundur.
    2. Şırınnayı önceden ısıtılmış 10 mL (37 °C) ECM ortamı ile doldurun.
      NOT: Ön ısıtma, orta salınımlı çözünmüş gaza yardımcı olur.
    3. Dikenli dişi bir Luer adaptörü ile şırındağa bir politetrafloroetilen tüpü bağlayın. Ardından, politetrafloroetilen tüpün diğer ucunu bir Y tipi konektöre bağlayın.
    4. Daha sonra, iki uzun silikon tüpü rezervuara bağlanan bir tüp ve kabarcık tuzak çipine bağlanan diğer tüp ile Y tipi konektörün diğer iki ucuna bağlayın.
    5. Rezervuara başka bir uzun silikon tüp bağlayın.
    6. Ardından, kabarcık tuzak çipinin üst tabakasındaki tüm giriş ve çıkış deliklerini bağlamak için iki kısa silikon tüp kullanın. Çipin arka ucuna bir politetrafloroetilen tüpü bağlayın.
    7. Ardından, şırıngayı mikro şırınga pompasına sabitlayın.
    8. Elektromanyetik sıkıştırma vanasına iki uzun silikon tüp takın.
    9. Ardından, şırıngam ve rezervuar arasındaki boru hattını açmak için elektromanyetik sıkıştırma vanasını değiştirin. Tüpteki havayı tüketmek için bir mikro şırınga pompası kullanarak ortamı rezervuara enjekte edin.
    10. Ardından, şırınna ve kabarcık tuzak çipi arasındaki boru hattını açmak için vanayı tekrar değiştirin. Sıvı haznesini ve kabarcık tuzak çipinin arka uç tüpünü doldurmak için medyayı enjekte edin.

7. Endotel filizlenen test

NOT: Bu çalışmada filizlenme sürecini gerçek zamanlı olarak gözlemlemek için faz kontrast mikroskobu ile monte edilmiş bir sahne üstü inkübatör kullanılmaktadır. Kademeli üst inkübatör, mikroskop aşamalarında sıcaklık, nem ve CO2 kontrolünü koruyarak canlı hücre görüntüleme için iyi olabilir. Ancak ekipman tahlil için gerekli değildir. Burada sağlanan protokoller temel bir hücre inkübatöründe de çalışılabilir.

  1. Hücre inkübatöründen endotel filizlenen cipsleri çıkar.
  2. Ardından, hücre kültürü tarafındaki Luer adaptörlerini çıkarın. Mikroakışkan filizlenen çipin hidrojel enjeksiyon portlarına iki boru fişi yerleştirin.
    NOT: Fişler iğnelerden dönüşebilir ve ana işlevleri ortamın dökülmesini önlemektir.
  3. Kabarcık tuzak çipinin arka uç tüpünü hücre kültürü kanalının bir bağlantı noktasına bağlayın.
    NOT: Bağlantıdan önce tüpte kabarcık olmadığından emin olun.
  4. Diğer bağlantı noktasına bir T tipi konektör takın ve rezervuara bağlı uzun silikon tüpe bağlayın.
  5. Uzun silikon tüpü mikro-peristaltik pompaya kırpın.
  6. Ardından, rezervuara bir hava filtresi yerleştirin.
  7. Ardından, mikroakışkan filizlenen çipi sahne üstü inkübatöre monte edin.
  8. Ardından, vakum pompasını bir TPU tüpü ile kabarcık tuzak çipinin alt tabakasındaki deliklere bağlayın.
  9. Mikro şırınga pompasını ve elektromanyetik sıkıştırma vanasını aynı anda kontrol eden özel programda sirkülasyon hacmini ve akış hızını ayarlayın (Şekil 2).
    NOT: Endotel hücre kültürü kanalı boyunca akış hızı klasik denkleme göre hesaplanır.
    φ = 6μQ / Wh2
    burada kesme stresi (dyn/cm2),μ ortamın viskozitesi (8,8 x 10-4 Pa•s), Q endotel hücre kültürü kanalı (ml/s) boyunca akış hızı, h kanal yüksekliği (70 μm) ve W kanal genişliği (1.000 μm) şeklindedir. Ortamın viskozitesi koaksiyel silindir tipi rotasyonel viskometre kullanılarak ölçülür. Kanalın yüksekliği ve genişliği önceden belirlenmiştir ve 4x büyütmede bir faz kontrast mikroskobu kullanılarak manuel olarak onaylanır. Hesaplamaya göre 15 dyn/cm 2 kesme stresi için sirkülasyon hacmi 5 mL ve akış hızı 85 μL/dk 'dır (hücre kültürü kanalında ortalama0,2 m/sn).
  10. Ardından, mikro peristaltik pompanın akış hızını ayarlayın.
    NOT: Mikro-peristaltik pompanın akış hızı, ortamın dökülmesini önlemek için mikro şırınga pompasından biraz daha yüksektir.
  11. Mikro şırınga pompasını açın. Daha sonra sirkülasyon kontrol sistemi kurulur.

8. Veri analizi

NOT: Filizleri ölçmek için normalleştirilmiş filiz alanı, ortalama filiz uzunluğu ve en uzun filiz uzunluğu hesaplanmıştır. Sonuçlar, üç bağımsız çalışmadan elde edilen ortalama ± SEM'i temsil eder. İstatistiksel önemi (P < 0.05) Öğrencinin t-testi ile değerlendirilir.

  1. PBS'de 15 dakika boyunca% 4 paraformaldehit ile yapılan deneylerden sonra mikroakışkan filizlenen çipteki hücreleri ve filizleri düzeltin. Leke çekirdeği ile 4′,6-diamidino-2-fenylindole dihidrochloride (DAPI; 1: 1000; Sigma-Aldrich) 10 dakika boyunca ve daha sonra TRITC phalloidin ile sitoskeleton leke (P5285, 1: 100; Sigma-Aldrich) 1 saat boyunca. PBS'li hücreleri her adım arasında 5 dakika aralıklarla üç kez yıkayın.
  2. Yongaların konfokal görüntülerini döşeme modunda alın ve görüntü düzenleme yazılımını kullanarak dikin.
  3. Normalleştirilmiş filizlendirme alanını ölçmek için programlama yazılımında özel bir kod kullanarak Z projeksiyon görüntülerinin floresan piksellerinin sayısını sayın (Bkz. Ek Dosya).
  4. Filizlerin her ucunu Z-projeksiyon görüntülerinde manuel olarak tanımlayın ve etiketleyin ve ortalama filiz uzunluğunu ve en uzun filiz uzunluğunu ölçmek için başka bir özel kod kullanarak filiz uçları ile IC bodrum zarı arasındaki mesafeleri hesaplayın (Bkz. Ek Dosya).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Burada sunulan ilk neovaskülarizasyon (MIEN) olayını taklit eden in vitro 3D model, mikroakışkan filizlenen bir çip ve bir mikroakışkan kontrol sisteminden oluşuyordu. Mikroakışkan filizlenen çip önceki yayınlardan optimizeedilmiştir 22,23,37,40,51,52,53. Kısaca, üç kanal ve altı ba...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Uzun zamandır, neovaskülarizasyonun gerçek zamanlı gözlemi bir sorun olmuştur. Son zamanlarda 22 ,32,40 ,46,54filizlenmesi için WC'lerle ve hücre dışı matrise bitişik perfüzyonlu kaplar oluşturmak için çeşitli yaklaşımlar geliştirilmiştir, ancak mekanik mikroçevrimini sürekli olarak sürdürmek hala zordur. Yüksek ışıklı kesme stresine ve düşük transendotelial a...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Araştırma Vakfı Yardım Hibeleri tarafından desteklendi (hibe no. 11827803, 31971244, 31570947, 11772036, 61533016, U20A20390 ve 32071311), Çin Ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı (hibe no. 2016YFC11010101 ve 2016YFC1102202), 111 Projesi (B13003) ve Pekin Doğa Bilimleri Vakfı (4194079).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
% 0.25 Tripsin-EDTAGenviewGP3108
Kollajen I, sıçan kuyruğuCorning354236
DAPISigma-AldrichD9542
Elektromanyetik sıkıştırma valfiWokun TeknolojisiWK02-308-1 / 3
Endotel hücre ortamı (ECM)Sciencell1001
Fetal sığır serumu (FBS)Her YeşilNA
FibronektinCorning354008
FITC-dextranMiragen60842-46-8
Grafik programlama ortamıLab VIEWNA
Görüntü düzenleme yazılımıPhotoShopNA
Görüntü işleme programıImageJNA
İzopropanolSigma-Aldrich91237
Litografi ekipmanıOptik ve Elektronik Enstitüsü, Çin Bilimler AkademisiURE-2000/35
MetanolSigma-Aldrich82762
Mikro-peristaltik pompaKurşun SıvısıBT101L
Mikro şırınga pompasıKurşun SıvısıTYD01
Oksijen plazmasıMING HENGPDC-MG
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148
PBS (10x)BeyotimeST448
Kalıcı epoksi negatif fotorezistMicrochemSU-8 2075
Fenol Kırmızı sodyum tuzuSigma-AldrichP5530
Polidimetilsiloksan (PDMS)Dow CorningSylgard 184
Poli-D-lizin hidrobromür (PDL)Sigma-AldrichP7886
PolitetrafloroetilenTeflonNA
Program yazılımıMATLABNA
Rekombinant İnsan VEGF-165StemImmune LLCHVG-VF5
Sodyum hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrich1.06498
Aşama üst inkübatörTokai HitNA
SU-8 geliştiriciMicrochemNA
Trikloro (1H, 1H, 2H, 2H-perflorooktil) silanSigma-Aldrich448931
TRITC PhalloidinSigma-AldrichP5285

Kaynaklar

  1. Potente, M., Gerhardt, H., Carmeliet, P. Basic and therapeutic aspects of angiogenesis. Cell. 146 (6), 873-887 (2011).
  2. Barger, A. C., Beeuwkes, R. D., Lainey, L. L., Silverman, K. J. Hypothesis: vasa vasorum and neovascularization of human coronary arteries. A possible role in the pathophysiology of atherosclerosis. New England Journal of Medicine. 310 (3), 175-177 (1984).
  3. Homan, K. A., et al. Flow-enhanced vascularization and maturation of kidney organoids in vitro. Nature Methods. 16 (3), 255-262 (2019).
  4. Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
  5. Carmeliet, P. M. J. Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nature Medicine. 6 (4), 389-395 (2000).
  6. Yancopoulos, G. D., et al. Vascular-specific growth factors and blood vessel formation. Nature. 407 (6801), 242-248 (2000).
  7. Heil, M., Eitenmüller, I., Schmitz-Rixen, T., Schaper, W. Arteriogenesis versus angiogenesis: similarities and differences. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 10 (1), 45-55 (2006).
  8. Tarbell, J. M., Demaio, L., Zaw, M. M. Effect of pressure on hydraulic conductivity of endothelial monolayers: role of endothelial cleft shear stress. Journal of Applied Physiology. 87 (1), 261(1999).
  9. Pedersen, J. A., Lichter, S., Swartz, M. A. Cells in 3D matrices under interstitial flow: Effects of extracellular matrix alignment on cell shear stress and drag forces. Journal of Biomechanics. 43 (5), 900-905 (2010).
  10. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  11. Ballermann, B. J., Dardik, A., Eng, E., Liu, A. Shear stress and the endothelium. Kidney International. 54, 100-108 (1998).
  12. Stone, P. H., et al. Prediction of sites of coronary atherosclerosis progression: In vivo profiling of endothelial shear stress, lumen, and outer vessel wall characteristics to predict vascular behavior. Current Opinion in Cardiology. 18 (6), 458-470 (2003).
  13. Wragg, J. W., et al. Shear stress regulated gene expression and angiogenesis in vascular endothelium. Microcirculation. 21 (4), 290-300 (2014).
  14. Yoshino, D., Sakamoto, N., Sato, M. Fluid shear stress combined with shear stress spatial gradients regulates vascular endothelial morphology. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 9 (7), 584-594 (2017).
  15. Chistiakov, D. A., Orekhov, A. N., Bobryshev, Y. V. Effects of shear stress on endothelial cells: go with the flow. Acta Physiologica. 219 (2), 382-408 (2016).
  16. Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
  17. Hergenreider, E., et al. Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs. Nature Cell Biology. 14 (3), 249(2012).
  18. Chien, S. Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis: the wisdom of the cell. American Journal of Physiology Heart & Circulatory Physiology. 292 (3), 1209(2007).
  19. Qi, Y. X., et al. PDGF-BB and TGF-{beta}1 on cross-talk between endothelial and smooth muscle cells in vascular remodeling induced by low shear stress. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1908-1913 (2011).
  20. Chiu, J. J., Shu, C. Effects of disturbed flow on vascular endothelium: pathophysiological basis and clinical perspectives. Physiological Reviews. 91 (1), 327-387 (2011).
  21. Tressel, S. L., Huang, R. P., Tomsen, N., Jo, H. Laminar shear inhibits tubule formation and migration of endothelial cells by an angiopoietin-2 dependent mechanism. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 27 (10), 2150-2156 (2007).
  22. Song, J. W., Munn, L. L. Fluid forces control endothelial sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (37), 15342-15347 (2011).
  23. Galie, P. A., et al. Fluid shear stress threshold regulates angiogenic sprouting. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 7968-7973 (2014).
  24. Pipp, F., et al. Elevated fluid shear stress enhances postocclusive collateral artery growth and gene expression in the pig hind limb. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 24 (9), 1664-1668 (2004).
  25. Islam, M. M., Beverung, S., Steward, R. Bio-Inspired Microdevices that Mimic the Human Vasculature. Micromachines (Basel. 8 (10), (2017).
  26. Warren, K. M., Islam, M. M., Leduc, P. R., Steward, R. 2D and 3D mechanobiology in human and nonhuman systems. ACS Applied Materials & Interfaces. 8 (34), 21869(2016).
  27. Pellegata, A. F., Tedeschi, A. M., De Coppi, P. Whole organ tissue vascularization: engineering the tree to develop the fruits. Front Bioeng Biotechnol. 6, 56(2018).
  28. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  29. Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Crosstalk between developing vasculature and optogenetically engineered skeletal muscle improves muscle contraction and angiogenesis. Biomaterials. 156, 65-76 (2018).
  30. Ribas, J., et al. Biomechanical strain exacerbates inflammation on a progeria-on-a-chip model. Small. 13 (15), 1603737(2017).
  31. Song, J. W., Bazou, D., Munn, L. L. Anastomosis of endothelial sprouts forms new vessels in a tissue analogue of angiogenesis. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 857-862 (2012).
  32. Kim, J., et al. Engineering of a Biomimetic Pericyte-Covered 3D Microvascular Network. PLoS One. 10 (7), 0133880(2015).
  33. Divito, K. A., Daniele, M. A., Roberts, S. A., Ligler, F. S., Adams, A. A. Microfabricated blood vessels undergo neoangiogenesis. Biomaterials. 138, 142-152 (2017).
  34. Lee, V. K., et al. Creating perfused functional vascular channels using 3D bio-printing technology. Biomaterials. 35 (28), 8092(2014).
  35. Buchanan, C. F., Verbridge, S. S., Vlachos, P. P., Rylander, M. N. Flow shear stress regulates endothelial barrier function and expression of angiogenic factors in a 3D microfluidic tumor vascular model. Cell Adhesion & Migration. 8 (5), 517-524 (2014).
  36. Jr, S. R., Tambe, D., Hardin, C. C., Krishnan, R., Fredberg, J. J. Fluid shear, intercellular stress, and endothelial cell alignment. American Journal of Physiology Cell Physiology. 308 (8), 657(2015).
  37. Kim, S., Chung, M., Ahn, J., Lee, S., Jeon, N. L. Interstitial flow regulates the angiogenic response and phenotype of endothelial cells in a 3D culture model. Lab on A Chip. , 4189-4199 (2016).
  38. Shirure, V. S., Lezia, A., Tao, A., Alonzo, L. F., George, S. C. Low levels of physiological interstitial flow eliminate morphogen gradients and guide angiogenesis. Angiogenesis. (6801), 1-12 (2017).
  39. Bazou, D., et al. Flow-induced HDAC1 phosphorylation and nuclear export in angiogenic sprouting. Scientific Reports. 6, 34046(2016).
  40. Vickerman, V., Kamm, R. D. Mechanism of a flow-gated angiogenesis switch: early signaling events at cell-matrix and cell-cell junctions. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. 4 (8), 863(2012).
  41. Song, J., et al. Microfluidic platform for single cell analysis under dynamic spatial and temporal stimulation. Biosens Bioelectron. 104, 58-64 (2018).
  42. Jeong, G. S., et al. Sprouting angiogenesis under a chemical gradient regulated by interactions with an endothelial monolayer in a microfluidic platform. Analytical Chemistry. 83 (22), 8454-8459 (2011).
  43. Steward, R. L., Tan, C., Cheng, C. M., Leduc, P. R. Cellular force signal integration through vector logic Gates. Journal of Biomechanics. 48 (4), (2015).
  44. Jing, Z., Niklason, L. E. Microfluidic artificial "vessels" for dynamic mechanical stimulation of mesenchymal stem cells. Integrative Biology Quantitative Biosciences from Nano to Macro. (12), 1487-1497 (2012).
  45. Zheng, W., et al. A microfluidic flow-stretch chip for investigating blood vessel biomechanics. Lab on A Chip. 12 (18), 3441-3450 (2012).
  46. Buchanan, C. F., et al. Three-dimensional microfluidic collagen hydrogels for investigating flow-mediated tumor-endothelial signaling and vascular organization. Tissue Engineering Part C Methods. 20 (1), 64(2014).
  47. Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Biophysical aspects of blood flow in the microvasculature. Cardiovascular Research. 32 (4), 654-667 (1996).
  48. Zhao, P., et al. Flow shear stress controls the initiation of neovascularization via heparan sulfate proteoglycans within biomimic microfluidic model. Lab on A Chip. 21, 421-434 (2021).
  49. Yamamura, N., Sudo, R., Ikeda, M., Tanishita, K. Effects of the mechanical properties of collagen gel on the in vitro formation of microvessel networks by endothelial cells. Tissue Engineering. 13 (7), 1443(2007).
  50. Huxley, V. H., Curry, F. E., Adamson, R. H. Quantitative fluorescence microscopy on single capillaries: alpha-lactalbumin transport. American Journal of Physiology. 252 (1), Pt 2 188(1987).
  51. Kim, S., Lee, H., Chung, M., Jeon, N. L. Engineering of functional, perfusable 3D microvascular networks on a chip. Lab on A Chip. 13 (8), 1489-1500 (2013).
  52. Campisi, M., et al. 3D self-organized microvascular model of the human blood-brain barrier with endothelial cells, pericytes and astrocytes. Biomaterials. 180, 117-129 (2018).
  53. Polacheck, W. J., et al. A non-canonical Notch complex regulates adherens junctions and vascular barrier function. Nature. 552 (7684), 258-262 (2017).
  54. Nguyen, D. H., et al. Biomimetic model to reconstitute angiogenic sprouting morphogenesis in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (17), 6712-6717 (2013).
  55. Huang, C. P., et al. Engineering microscale cellular niches for three-dimensional multicellular co-cultures. Lab on A Chip. 9 (12), 1740-1748 (2009).
  56. Chung, M., Ahn, J., Son, K., Kim, S., Jeon, N. L. Biomimetic model of tumor microenvironment on microfluidic platform. Advanced Healthcare Materials. 6 (15), (2017).
  57. Kakisis, J., Liapis, C., Sumpio, B. Effects of cyclic strain on vascular cells. Endothelium. 11 (1), 17-28 (2004).
  58. Charoenpanich, A., et al. Cyclic tensile strain enhances osteogenesis and angiogenesis in mesenchymal stem cells from osteoporotic donors. Tissue Engineering Part A. 20 (1-2), 67-78 (2014).
  59. Narimiya, T., et al. Orthodontic tensile strain induces angiogenesis via type IV collagen degradation by matrix metalloproteinase. Journal of Periodontal Research. 52 (5), (2017).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Neovaskülarizasyon MekanizmasıEndotelyal HücrelerMikroakışkan Filizlenme ÇipiKayma GerilmesiTransendotelyal AkışVasküler Endotelyal Büyüme FaktörüPerfüzyon Yapılabilir MikrokanalEndotelyal Filizlenme Analiziİlaç Tarama Platformu
Neovaskülarizasyonun İlk Olayını Taklit Etmek için Mikroakışkan Model
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.