Fırıncı Maya saccharomyces cerevisiae Mitokondriyal Genom İfade Ürünlerinin Etiketlenmesi ve Görselleştirilmesi

Summary

Baker mayası mitokondriyal genom sekiz polipeptid kodlar. Mevcut protokolün amacı, hepsini etiketlemek ve daha sonra bunları ayrı bantlar olarak görselleştirmektir.

Abstract

Mitokondriler, aerobik solunum yapabilen ökaryotik hücrelerin temel organelleridir. Dairesel genom ve gen ifade aparatı içerirler. Fırıncı mayasının mitokondriyal genomları sekiz proteini kodlar: sitokrom c oksidazın üç alt bireyi (Cox1p, Cox2p ve Cox3p), ATP sintazının üç alt bölümü (Atp6p, Atp8p ve Atp9p), ubiquinol-sitokrom c oksitodoreductase enzimi, sitokrom b (Cytb) ve mitokondriyal ribozomal protein Var1p'nin bir alt bölümüdür. Burada açıklanan yöntemin amacı, bu proteinleri özellikle ³⁵S metiyonin ile etiketlemek, elektroforez ile ayırmak ve sinyalleri ekranda ayrık bantlar olarak görselleştirmektir. Yordam birkaç adım içerir. İlk olarak, maya hücreleri geç logaritmik büyüme aşamasına ulaşana kadar galaktoz içeren bir ortamda kültürlenir. Daha sonra, sikloeximide tedavisi sitoplazmik çeviriyi engeller ve sadece mitokondriyal çeviri ürünlerinde ³⁵S metiyonin birleştirilmesine izin verir. Daha sonra, tüm proteinler maya hücrelerinden çıkarılır ve poliakrilamid jel elektroforez ile ayrılır. Son olarak, jel kurutulur ve depolama fosfor ekranı ile inkübe edilir. Ekran, bantları ortaya çıkaran bir fosforimager üzerinde taranır. Yöntem, bir mutant maya suşunun mitokondrilerindeki tek bir polipeptitin biyosentez oranını, mitokondriyal gen ekspresyon kusurlarını incelemek için yararlı olan vahşi tiple karşılaştırmak için uygulanabilir. Bu protokol, tüm maya mitokondriyal mRNA'ların çeviri oranı hakkında değerli bilgiler verir. Bununla birlikte, uygun sonuçlara varmak için çeşitli kontroller ve ek deneyler gerektirir.

Introduction

Mitokondriler, ökaryotik bir hücrenin metabolizmasında derinden yer alan organellerdir. Elektron transfer zincirleri hücreye birden fazla biyokimyasal yolda kullanılan ana enerjik para birimi olan ATP'yi sağlar. Ayrıca, apoptoz, yağ asidi ve heme sentezi ve diğer süreçlerde yer almaktadırlar. Mitokondri disfonksiyonu iyi bilinen bir insan hastalığı kaynağıdır¹. Organellerin yapısal veya düzenleyici bileşenlerini kodlayan nükleer veya mitokondriyal genlerdeki mutasyonlardan kaynaklanabilir². Fırıncı mayası Saccharomyces cerevisiae, çeşitli nedenlerden dolayı mitokondriyal gen ekspresyonunu incelemek için mükemmel....

Protocol

1. Maya kültürü hazırlığı

1. Donmuş stok kültürlerinden uygun ortama sahip taze tabaklarda maya serin. Plakaları 24-48 saat boyunca 30 °C'de bir kültür inkübatöre koyun.
   NOT: Sıcaklığa duyarlı mutantların izin verilen sıcaklıkta büyümesine izin verin.
2. Maya kültürlerini 15 mL tüplerdeki taze çizgiden 2 mL YPGal ortamında (%2 pepton, %1 maya özü, %2 galaktoz) aşılayın ve 30 °C'de 200 rpm'de ajite ederek bir gecede kuluçkaya bırakın.
3. Kültürün optik yoğunluğunu 600 nm (OD₆₀₀₎dalga boyunda ölçün.
4. Steril tüplerde 0,2 absorbans ünitesine karşılık gelen hacmi, oda sıcaklığında 30 s için 9.000 x g'da pelet maya hücrel....

Results

Yukarıda açıklanan protokolün ardından, iki S. cerevisiae suşundan mitokondriyal çeviri ürünleri atadık: vahşi tip (WT) ve AIM23 geninin ( AIM23Δ ) silinmesini taşıyan bir mutant), kodlama mitokondriyal çeviri başlatma faktörü 3 (Tablo 1)⁸. Mitokondriyal çeviri ürünleri radyoaktif olarak etiketlendi ve SDS-PAAG9'da ayrıldı. Örnekler, bir zaman kursu oluşturmak için doygunluk öncesinde her 2,5 dakikada bir toplanmıştı (Şekil .......

Discussion

Gen ekspresyasyonu incelemeleri modern yaşam bilimlerinde merkezi bir yer kaplar. Bu karmaşık süreç hakkında fikir veren çok sayıda yöntem geliştirilmiştir. Burada, fırıncı mayası S. cerevisiae mitokondrisinde protein biyosentezine erişmeye izin verme yöntemini tanımladık. Genellikle mutant maya suşunun mitokondrilerindeki mRNA'ların çeviri verimliliklerini, çalışılan mutasyonun sonuçlarına erişmek için vahşi tipe karşı karşılaştırmak için uygulanır. Bu, araştırmacıların mitokondriyi etkilediği önerilen mutasyon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-Merkaptoetanol	Sigma-Aldrich	M3148
Akrilamid	Sigma-Aldrich	A9099
Amonyum persülfat	Sigma-Aldrich	A3678
Bakteriyolojik	agar Sigma-Aldrich	A5306
Biyodalga Hücre Yoğunluk Ölçer CO8000	BIOCHROM US BE	80-3000-45
MARKA standart tek kullanımlık küvetler	Sigma-Aldrich	Z330361
kloroform	Sigma-Aldrich	288306
sikloheksimid	Sigma-Aldrich	C1988
D-(+)-Galaktoz	Sigma-Aldrich	G5388
D-(+)-Glikoz	Sigma-Aldrich	G7021
dijital blok ısıtıcı	Thermo Scientific	88870001
EasyTag L- [35S] -Metionin, 500 & mikro; Ci (18.5MBq), Stabilize Sulu Çözelti	Perkin Elmer	NEG709A500UC
Eppendorf Santrifüj 5425	Thermo Scientific	13-864-457
GE Depolama Fosfor Ekranları	Sigma-Aldrich	GE29-0171-33
L-metiyonin	Sigma-Aldrich	M9625
metanol	Sigma-Aldrich	34860
N, N, N ve asal;, N ve prime;-Tetrametiletilendiamin	Sigma-Aldrich	T9281
N, N ve asal;-Metilenbisakrilamid	Sigma-Aldrich	M7279
New Brunswick Innova 44 / 44R Çalkalayıcı İnkübatör	New Brunswick Bilimsel
Pepton et, bakteriyolojik	Millipore	91249
Fenilmetansülfonil florür	Sigma-Aldrich	P7626
Pierce 660nm Protein Test Kiti	Thermo Scientific	22662
PowerPac Temel Güç Kaynağı	Bio-Rad	1645050
Protean II xi hücresi
Puromisin dihidroklorür		Sigma-Aldrich
Storm 865 fosfor görüntüleyici	GE Healthcare
Trizma tabanı	Sigma-Aldrich	93352
Vakumlu Isıtmalı Jel Kurutucu	Cleaver Scientific	CSL-GDVH
Maya özü	Sigma-Aldrich	Y1625 & nbsp;