Yöntem makalesi

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA) - Hücresel Kinetiği Ölçmek için Çok Yönlü Bir Teknik

DOI:

10.3791/62025

⸱

18 Mart 2021

 ,  ,  , 
1Faculty of Physics and Center for NanoScience (CeNS), Ludwig-Maximilians-Universität München, Geschwister-Scholl-Platz 1, 80539 München, Germany

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikropatterned diziler kullanılarak tek hücrelerden floresan muhabir zaman kurslarının alınması için bir yöntem sunuyoruz. Protokolde, tek hücreli dizilerin hazırlanması, canlı hücre tarama zaman atlamalı mikroskopinin kurulumu ve çalışması ve otomatik önseçim, görsel kontrol ve yapıştırma alanı başına hücre entegre floresan zaman kurslarının izlenmesi için açık kaynaklı bir görüntü analiz aracı açıklanmaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesi (LISCA), yüksek verimdeki tek tek hücrelerden floresan sinyallerinin zaman akışlarını toplamak için çok yönlü bir yöntemdir. Genel olarak, kültürlü hücrelerden tek hücreli zaman kurslarının kazanılması hücre hareketliliği ve hücre şekillerinin çeşitliliği ile engellenir. Yapışkan mikro diziler tek hücreli koşulları standartlaştırır ve görüntü analizini kolaylaştırır. LISCA, tek hücreli mikroarrayları tarama zaman atlamalı mikroskopi ve otomatik görüntü işleme ile birleştirir. Burada, tek hücreli floresan zamanı derslerini LISCA formatında almanın deneysel adımlarını açıklıyoruz. Gelişmiş yeşil floresan protein (eGFP) için mRNA kodlaması kullanarak mikropatterned bir diziye yapışan hücreleri transfect ediyoruz ve tarama zaman atlamalı mikroskopi ile paralel olarak yüzlerce hücrenin eGFP ekspresyon kinetiğini izliyoruz. Görüntü veri yığınları, tek hücreli floresan süresi kursları oluşturmak için floresan yoğunluğunu seçilen hücre konturları üzerinde entegre eden yeni geliştirilen yazılım tarafından otomatik olarak işlenir. mRNA transfection sonrası eGFP ifade süresi derslerinin, mRNA'nın ifade ve bozulma oranlarını ortaya koyan basit bir kinetik çeviri modeli ile iyi tanımlandığını gösteriyoruz. Lisca'nın sinyal kesme apoptoz bağlamında birden fazla belirtecin olay süresi korelasyonları için daha fazla uygulaması tartışılmıştır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Son yıllarda tek hücreli deneylerin önemi belirginleşmiştir. Tek hücrelerden elde edilen veriler, hücreden hücreye değişkenliğin araştırılmasına, hücre içi parametre korelasyonlarının çözülmesine ve topluluk ölçümlerinde gizli kalan hücresel kinetiklerin tespitine izin verir1,2,3. Binlerce tek hücrenin hücresel kinetiğini paralel olarak araştırmak için, hücrelerin birkaç güne kadar birkaç saatlik bir zaman diliminde standart koşullar altında izlenmesini sağlayan yeni yaklaşımlara ihtiyaç vardır ve ardından nicel veri analizi 4. Burada, mikro yapılandırılmış dizilerin kullanımını zaman atlamalı mikroskopi ve otomatik görüntü analizi ile birleştiren Tek Hücreli Dizilerin Canlı Hücre Görüntülemesini (LISCA) sunuyoruz.

Mikro yapılandırılmış tek hücreli diziler üretmek için çeşitli yöntemler oluşturulmuş ve literatür5,6'da yayınlanmıştır. Burada, Mikro Ölçekli Plazma Tarafından Başlatılan Protein Desenlemesini (μPIPP) kısaca açıklıyoruz. μPIPP kullanarak tek hücreli dizi imalatının ayrıntılı bir protokolü de referans7'debulunur. Tek hücreli dizilerin kullanımı, her hücre için tanımlanmış mikroçevirtiler sunan standartlaştırılmış yapışma noktalarına binlerce hücrenin hizalanmasına olanak tanır ve böylece deneysel değişkenlik kaynağını azaltır (Şekil 1A). Tek hücreli diziler, çeşitli hücresel süreçleri belirtmek için amaçlanan floresan belirteçlerin zaman akışlarını izlemek için kullanılır. Tarama zaman atlamalı modunda uzun süreli mikroskopi, tek hücreli dizilerin geniş bir alanını izlemenize ve böylece birkaç saat hatta gün boyunca yüksek aktarım hızına sahip tek hücreli verileri örneklemenize olanak tanır. Bu, dizinin her konumundan zaman çizgisi görüntü yığınları oluşturur (Şekil 1B). Büyük miktarda görüntü verisini azaltmak ve istenen tek hücreli floresan süresi derslerini verimli bir şekilde çıkarmak için, hücrelerin konumlandırılmasından yararlanan otomatik görüntü işleme gereklidir (Şekil 1C).

LISCA'nın zorluğu, deneysel protokolleri ve hesaplama araçlarını hücresel kinetiğin nicel ve tekrarlanabilir verilerini üreten yüksek verimli bir test oluşturacak şekilde uyarlamaktır. Bu yazıda, bireysel yöntemlerin ve bunların bir LISCA testinde nasıl birleştirildiklerinin adım adım bir açıklamasını sunuyoruz. Örnek olarak, yapay mRNA teslimatından sonra geliştirilmiş yeşil floresan protein (eGFP) ekspresyonunun zaman seyrini tartışıyoruz. mRNA teslimini izleyen eGFP ifadesi, reaksiyon hızı denklemleri modelleme çevirisi ve mRNA'nın bozulması ile açıklanmaktadır. eGFP konsantrasyonunun zaman akışı için model işlevinin zaman içinde her bir hücre için floresan yoğunluğunun LISCA okumasına takılması, mRNA bozulma hızı gibi model parametrelerinin en iyi tahminlerini verir. Temsili bir sonuç olarak, iki farklı lipid bazlı transfeksiyon ajanının mRNA teslimat verimliliğini ve parametre dağılımlarının nasıl farklılık gösterir olduğunu tartışıyoruz.

figure-introduction-1
Şekil 1: (A) mikro desenli tek hücreli dizileri (B) tarama zaman atlamalı mikroskopi ve (C) kaydedilen görüntü serilerinin otomatik görüntü analizini birleştiren LISCA iş akışının gösterimi. Tek hücreli diziler, faz kontrastı görüntüsünün yanı sıra eGFP ifade hücrelerinin floresan görüntüsünde(A)görülebileceği gibi, mikropattern üzerindeki hücrelerin düzenlenmesine yol açan hücre itici ara alana sahip iki boyutlu bir hücre yapışkan kare deseni oluşur. Tüm mikro yapılandırılmış alan, bir dizi konumda(B)tekrar tekrar görüntü alan bir tarama zaman atlamalı modunda görüntülenir. Kaydedilen görüntü serileri, zaman içinde hücre başına floresan yoğunluğunu(C)okumak için işlenir. Ölçek çubukları: 500 μm (A), 200 μm (C). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Şekil 2: Tek hücreli mikroarrayları (A) tarama zaman atlamalı mikroskopi (B) ile birleştiren veri toplama. Zaman atlamalı deneyin hazırlanmasında, 2D mikropattern yapışıklık karelerine sahip tek hücreli bir dizi hazırlanır (1), ardından hücre tohumlama ve hücrelerin mikropattern (2) üzerindeki hizalanması ve zaman atlamalı ölçüm sırasında sıvı kullanımı sağlayan altı kanallı slayta bir perfüzyon sisteminin bağlanması (3). Tarama zaman atlamalı bir deney kurulur (4) ve hücreler zaman atlamalı deney sırasında perfüzyon sistemi üzerinden bir mRNA lipoplex çözeltisi enjekte ederek mikroskopta transkripsiyon edilir (5). Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

1. Mikro yapılandırılmış tek hücreli dizi imalatı (Şekil 2A)

  1. μPIPP dizi imalatı için gerekli malzemeleri hazırlayın.
    1. pH 7.4'te steril fosfat tamponlu salin (PBS) hazırlayın.
    2. 25 °C'de en az 18 MΩcm dirençle steril ultra saf su hazırlayın.
    3. PLL(20 kDa)-g[3.5] PEG(2 kDa) (PLL-PEG) çalışma solüsyonlarını 150 mM NaCl ve 10 mM 4-(2-hidroksyetil)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) içeren ultra saf suda 2 mg/mL PLL-PEG konsantrasyonu ile hazırlayın.
    4. Yüzey kaplaması için hücre dışı matris protein çözeltisi hazırlayın: PBS'de 1 mg/mL fibronektin (FN).
    5. Fotolithografi8 ile üretilen ve yeniden kullanılabilir bir ana olarak işlev gören bir mikropattern ile silikon gofret hazırlayın. Mikropattern, her biri 6 mm genişliğe ve 18 mm yüksekliğe sahip altı şerit halinde düzenlenmiş, 30 μm kenar uzunluğuna, 12 μm derinliğe ve 60 μm kareler arası mesafeye sahip karelerden oluşur.
  2. Polidimetilsiloksinan (PDMS) monomerini %9 çaprazlinker (kütle %) ile karıştırın silikon elastomer kiti kullanarak ve bir kurutucu kullanarak kabarcıksız olana kadar yaklaşık 30 dakika degas. Silikon gofret kabaca 3-5 mm kalınlığında pdms tabakası ile dök ve kabarcıksız olana kadar yaklaşık 30 dakika boyunca tekrar gazdan arındırın.
    1. PDMS'yi en az 4 saat iyileştirmek için PDMS ile silikon gofretleri 50 °C'de bir fırına koyun.
  3. PDMS damgalarını kesin.
    1. Bir neşter kullanın ve altı mikropattern çizgi içeren PDMS katmanı bir PDMS başyapıtından kesin.
    2. PDMS şaheserini mikropattern yukarı bakacak şekilde bir banka yerleştirin.
    3. PDMS şaheserinin altı mikropattern şeridinin her birini bir jiletle PDMS damgasına kesin. Desenli alanın bir kısmını keserek PDMS damgalarının kenarlarının açık olmasına dikkat edin.
  4. PDMS damgalarını altı kanallı bir slaydın kapak kapağına yerleştirin (Şekil 3-1).
    1. Kaplamasız bir kapak kılıfı kullanın ve kapak kapağının koruma folyosunu dikkatlice çizerek altı kanallı slaytın kanal konumlarını işaretleyin. Daha sonra kapak kapağını koruma folyosu aşağı bakacak şekilde tezgaha yerleştirin.
    2. PDMS damgalarını mikropattern aşağı bakacak şekilde işaretli kanal konumlarındaki kapak kılıflarına cımbız kullanarak yerleştirin.
    3. Mikroskop altında PDMS damgalarının ekini kontrol edin. Bir PDMS damgası kapak altlığa tamamen iliştirilmişse, temas halindeki kareler ara alandan daha koyu görünür. PDMS damgasının kapak kılıfı içine bağlanması mikropattern kalitesi için çok önemlidir.
  5. Üzerinde altı PDMS damgası bulunan kapak sapını bir plazma temizleyicisine yerleştirin ve PDMS pulları ile kapak hidrofilik arasındaki yüzeyleri yapmak için oksijen plazması (basınç 0,2 mbar, 3 dakika boyunca~40W) ile tedavi edin ( Şekil 3-2).
  6. Mikropattern imalatının diğer tüm adımlarını bir biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin. PLL-PEG çözeltisinin 15 μL'sini kullanın ve her PDMS damgasının yanında bir damla pipet kullanın, böylece PLL-PEG çözeltisi PDMS damgasının hidrofilik desenine emilir(Şekil 3-3). PLL-PEG'in oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya yatmasına izin verin.
  7. 1 mL ultra saf suyu üzerinde PDMS pulları ile kapak boyunca durulayın ve cımbız kullanarak PDMS damgalarını çıkarın (Şekil 3-4). Daha sonra kapak kapağını 1 mL ultra saf su ile ikinci kez durulayın ve kurumasına izin verin.
  8. Kapak kapağı tamamen kuruduğunda, kapak kılıfı için altı kanallı yapışkan bir slayt yapıştırın (Şekil 3-4). Mikropatlanmış alanların kanalların alt kısmına hizalanmış olmasına dikkat edin.
  9. Yapıştırma karelerini FN ile işlevselleştirin.
    1. Her kanala 40 μL PBS doldurun.
    2. PBS'de 100 μg/mL FN çözümü hazırlayın.
    3. Her kanala 40 μL FN çözeltisi ekleyin(Şekil 3-5). FN çözeltisini, bir rezervuardan 40 μL çıkararak ve homojen bir çözelti üretmek için aynı kanalın karşı rezervuara 3 kez ekleyerek kanaldaki PBS ile iyice karıştırın. FN çözeltisini oda sıcaklığında 45 dakika kuluçkaya yatırın.
    4. Her kanalı 120 μL PBS ile üç kez yıkayın (Şekil 3-6).
  10. Desen kalitesini kontrol etmek için, 9.2 adımında floresan etiketli bir FN kullanın. (Şekil 4A).
    NOT: PLL-PEG ve FN substrata birlikte bağlı olmadığı ve desenin kalitesi zamanla düşebileceğinden, μPIPP dizisini hücre tohumlamadan en fazla bir gün önce hazırlamanızı öneririz. Hazırlanan μPIPP dizisini buzdolabında saklayın.

figure-protocol-2
Şekil 3: μPIPP ile tek hücreli mikroarray imalatı. (1) Yüzeyde üç boyutlu mikropattern yapıya sahip PDMS pulları altı kanallı bir slaytın kapak kapağı üzerine düzenlenir. (2) Üzerinde PDMS damgaları bulunan kapak, yüzeyleri hidrofilik hale getirmek için oksijen plazması ile muamele edilir. (3) PLL-PEG eklenir. Kılcal kuvvetler tarafından mikroyapıya emilir ve yüzeylerin PDMS damga hücresi iticisi tarafından kapsanmamasını sağlar. (4) Kapak, kalan PLL-PEG'i çıkarmak için su ile durulanır. Daha sonra PDMS damgaları kaldırılır ve altı kanallı yapışkan bir slayt kapak kapağına yapıştırılır. (5) Hücre dışı matrisin bir proteini olan fibronektin, PLL-PEG hücre yapıştırıcısı olmayan alanları yapmak için eklenir. (6) Altı kanallı slayt fosfat tamponlu salin ile yıkanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Hücre tohumlama (Şekil 2A)

NOT: Aşağıdaki yıkama adımları için, ilgili sıvıyı bir rezervuara ekleyin ve ardından bir kanalın karşı rezervuarından eşit miktarda sıvı çıkarın.

  1. Her kanalı 120 μL 37 °C tam takviyeli hücre büyüme ortamı ile yıkayın. Hücre süspansiyonu eklemeden önce, sadece kanalların orta ile doldurulmasını sağlayın, ancak rezervuarlarla doldurulmamasını sağlayın.
  2. HuH7 hücrelerini hücre geçişi için standart protokolünüzü izleyerek bir hücre kültürü şişesinden ayırın ve hücre süspansiyon konsantrasyonunu 4 x 105 hücre/mL'ye ayarlayın.
  3. 40 μL hücre süspansiyonu ekleyin ve bir rezervuardan 40 μL çıkararak ve homojen bir hücre dağılımına ulaşmak için 3 kez aynı kanalın karşı rezervuara ekleyerek hücre büyüme ortamını hücre süspansiyonu ile karıştırın (Şekil 4B).
  4. Sadece kanalın hücre süspansiyonu ile doldurulması için kanaldan 40 μL süspansiyonu çıkarın.
  5. Slaydı bir inkübatöre koyun ve faz kontrastlı bir mikroskop kullanarak tohumlamadan sonra hücre yapışıklığı 1 saat kontrol edin.
  6. 120 μL 37 °C sıcak hücre büyüme ortamı ekleyin.
  7. Ancak, mikropattern üzerinde hücresel öz organizasyonu etkinleştirmek için inkübatörde 3 saat daha slayt (Şekil 4C).

figure-protocol-3
Şekil 4: μPIPP dizisinin hücresel olarak kendi kendini organizasyonu ve kalite kontrolü. (A) Mikro yapılandırılmış yüzey, hücre itici polimer ile çevrili kırmızı renkte gösterilen kare FN kaplı yapışma lekelerinden oluşur. (B) Hücre tohumlamadan sonra, HuH7 hücreleri rastgele dağıtılır ve (C) esas olarak 4 saat boyunca yapışma noktalarına yapışır. İzinle yeniden basıldı 7. Ölçek çubukları: 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

3. Perfüzyon sistemi (Şekil 2A)

NOT: Perfüzyon sisteminin kullanımı sadece zaman atlamalı ölçüm sırasında reaktiflerin veya floresan belirteçlerin eklenmesi gerekiyorsa gereklidir. İhtiyaçlarınıza bağlı olarak, her kanalı ayrı bir perfüzyon sistemine bağlayabilir veya aynı perfüzyon sistemine seri olarak birkaç kanal bağlayabilirsiniz. Perfüzyon sistemlerinin sayısı bağımsız deneysel koşulların sayısına karşılık gelir. Tüpleri steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine bağlayın ve perfüzyon sistemine hava kabarcıklarının dahil edilmesini önleyin. Perfüzyon sistemi kullanılmazsa, zaman atlamalı ölçümden önce reaktifleri/işaretleyicileri bir biyogüvenlik kabinine ekleyin. Perfüzyon sistemi şirket içinde üretilmiştir, kullanılan malzeme Malzeme Tablosundalistelenmiştir. Perfüzyon sisteminin montajı daha önceaçıklanmıştır 9.

  1. 1 mL şırınna (yedek sporn ile) kullanın ve şırınnayı 1 mL 37 °C hücre büyüme ortamı ile doldurun.
  2. Şırındıcı vanayı kullanarak giriş tüpüne bağlayın ve tüpü orta ile doldurun.
  3. Giriş tüpünü bir kanalın rezervuarı ile bağlayın ve hava kabarcıklarının sıkışmadığından emin olun.
  4. Bu perfüzyon sistemine seri olarak başka bir kanal bağlamak için, mevcut kanalın giriş borusunun karşısındaki rezervuara bir seri konektör bağlayın. Bir sonraki kanala geçin ve seri konektörün serbest ucunu rezervuarlarından birine bağlayın.
  5. Gerekli sayıda kanal seri olarak bağlanana kadar önceki adımları yineleyin.
  6. Çıkış tüpünü doğrudan mevcut kanalın serbest rezervuara bağlayın. Perfüzyon sisteminin sızmadığını kontrol etmek için bağlı tüpü orta ile doldurun.
  7. Slaydın altı kanalı da bir perfüzyon sistemine bağlanana kadar önceki adımları yineleyin.
  8. Bağlı perfüzyon sistemlerine sahip slaydı daha fazla kullanıma kadar inkübatöre geri yerleştirin veya zaman atlamalı ölçüm için önceden 37 °C'ye ısıtılmış mikroskobun ısıtma odasına yerleştirin.

4. Zaman atlamalı mikroskopi (Şekil 2B)

NOT: Uzun süreli ölçümler için 37 °C'lik sabit bir sıcaklığı ve sabit bir CO2 seviyesini koruyun. CO2'yebağımlı hücre büyüme ortamına alternatif olarak, gaz inkübasyon sistemine gerek olmayan L15 ortamını kullanın.

NOT: Nicel görüntüleme için, arka plan floresanını azaltmak için zaman atlamalı ölçüm sırasında fenol kırmızısı olmayan hücre büyüme ortamını kullanın ve zaman atlamalı protokolün aynı ayarlarını ve teknik çoğaltmalar için aynı mikroskobu kullanın.

  1. 10x objektif ve uygun floresan filtreleri kullanarak, 750 ms pozlama süreleri (kameraya bağlı olarak), konum listesinde ardışık döngüler arasında 10 dakika zaman aralığı ve 30 saat gözlem süresi ile faz kontrastı görüntüsünü ve floresan görüntüsünü kaydetmek için bir zaman atlamalı protokol ayarlayın.
  2. Altı kanallı slaydı, hücrelerle birlikte 37 °C ılık ısıtma odasının numune tutucusunda tek hücreli dizilere yerleştirin. Perfüzyon sistemleri altı kanallı slayda bağlıysa, altı kanallı slaydın sıvı değişimi sırasında hareket ettirmediğine emin olmak için tüpleri bir miktar bant kullanarak sahne alanına sabitleyin. Sıvı atıkları toplamak için çıkış tüplerinin serbest uçlarını 15 mL reaksiyon tüpünün bir deliğinden geçirin.
  3. Tarama zaman atlamalı ölçümü için konum listesini ayarlayın. Konum listesi aracılığıyla ardışık döngüler arasında tanımlanan zaman aralığında konum sayısının taranabildiğinden emin olun. 10x hedefle, kamera çipi boyutuna bağlı olarak toplam mikropattern alanı taramak için kanal başına 10-30 pozisyon ayarlanabilir.
  4. Zaman atlamalı ölçüme başlayın. Uzun süreli ölçümlerin daha iyi görüntü kalitesi için otomatik odak düzeltme sistemi kullanın.

5. Floresan işaretleyici - mRNA transfection (Şekil 2B)

NOT: Bir boru sistemi ile bağlanan iki kanaldaki transfeksiyon için toplam 600 μL transfeksiyon karışımına ihtiyaç vardır (bir kanal için 300 μL). Belirtilen birimler, bağlı iki kanaldaki bir transfection'a başvurur.

  1. Serum azaltılmış ortamda 1 μL transfeksiyon maddesi seyrelterek bir transfeksiyon maddesi çözeltisi hazırlayın ve çözeltinin oda sıcaklığında 5 dakika kuluçkaya yatmasını bırakın.
  2. 150 μL serum azaltılmış ortamda eGFP için 300 ng mRNA kodlamasını seyrelterek bir mRNA çözeltisi hazırlayın.
  3. MRNA çözeltisine 150 μL transfeksiyon maddesi çözeltisi ekleyerek transfeksiyon karışımını hazırlayın ve iyice karıştırın. Transfection karışımını oda sıcaklığında 20 dakika kuluçkaya bırakın.
  4. Transfeksiyon karışımının inkübasyonu sırasında bir şırınna kullanarak boru sistemini 1 mL 37 °C sıcak PBS ile yıkayın. Tüpleri yıkırken mikroskop aşamasının hareket etmediğinden emin olun. Gerekirse zaman atlamalı ölçümü duraklatın.
  5. Transfeksiyon karışımını 300 μL serum azaltılmış ortam ekleyerek 0,5 ng/μL'lik son mRNA konsantrasyonuna seyreltin.
  6. Boru sistemini bir şırıng kullanarak transfeksiyon karışımı ile yıkayın ve mRNA lipoplexes'in 1 saat kuluçkaya yatmasına izin verin (gerekirse zaman atlamalı ölçümü duraklatın).
  7. Transfeksiyon inkübasyonunu durdurun ve bir şırınna kullanarak 1 mL 37 °C sıcak tam takviyeli hücre büyüme ortamı ile yıkayarak ilişkisiz mRNA lipoplexes'i boşaltın (gerekirse zaman atlamalı ölçümü duraklatın).

6. Görüntü analizi ve floresan okuma

  1. Görüntü analizini ilk kez çalıştırırken, "Python'da Otomatik Mikroyapı Analizi" (PyAMA) açık kaynaklı yazılımın0.1.6 sürümünü, orada verilen talimatlara göre belirtilen konum 10'dan yükleyin.
  2. Görüntü kanallarının (faz kontrastı ve floresan) çok görüntülü 16 bit TIFF dosyaları olarak kullanılabildiğine emin olun. Gerekirse, bunları uygun şekilde dönüştürün.
  3. PyAMA'yı başlatın ve analiz için görüntüleri açmak için Yığını aç... üzerine tıklayın.
  4. Açılacak her çok resimli TIFF dosyası için Aç'ı tıklatın ve dosyayı iletişim kutusunun sol tarafındaki yüklü dosyalar listesinde görüntülenecek şekilde seçin (Şekil 5-1).
  5. Analize dahil etmek için kanalları işaretleyin. Her kanal için aşağıdaki adımları uygulayın.
    1. Yüklenen dosyalar listesinden kanalı içeren TIFF dosyasını seçin.
    2. Yeni kanal eklebölümünde, TIFF dosyasında kanalın dizinini seçin. Dizin oluşturma sıfır tabanlıdır; ilk kanalda dizin 0, ikinci kanalda dizin 1 vb. vardır.
    3. Kanal türünü seçin. İlgili görüntü kanalları için Faz karşıtlığı veya Floresan'ı ve hücre konturlarını gösteren ikili kanal için Segmentasyon'u seçin.
    4. İsteğe bağlı olarak, farklı floresan kanallarını ayırt etmek için kanalın bir etiketini girin: eGFP ve DAPI.
    5. Kanalı yapılandırdıktan sonra Ekle 'yitıklatın.
  6. Eklenen tüm kanallar iletişim kutusunun sağ tarafındaki kanal listesinde görüntülendiğinde, yığını yüklemek için Tamam'ı tıklatın.
  7. Aşama kontrastı görüntülerine (Şekil 5 -2)dayalı hücre tanıma için PyAMA'nın yerleşik segmentasyon algoritmasını kullanarak segmentasyon gerçekleştirmek için Araçlar | Binarize... ve binarized kanalı ile NumPy dosyası için bir dosya adı girin.
    NOT: Geçerli sürümde, binarized kanalın yüklenmesi için tüm kanalların yeniden yüklenmesi gerekir.
  8. Floresan kanalında arka plandüzeltmesi 11 yapmak için (Şekil 5-3), floresan kanalının ve segmentasyon kanalının yüklendiğinden emin olun. Segmentasyon kanalı yüklenmemişse, otomatik segmentasyon için bir faz kontrastı kanalının yüklendiğinden emin olun. "Arka Plan düzeltme araçları..." > gidin. ve düzeltilmiş floresan kanalı ile elde edilen TIFF dosyası için bir dosya adı seçin.
    NOT: Geçerli sürümde, arka planda düzeltilen kanalın yüklenmesi için tüm kanalların yeniden yüklenmesi gerekir.
  9. Önceden seçilmiş hücreleri (Şekil 5-4) ve entegre floresan sinyallerini (Şekil 5-5) zaman dilimleri arasında kaydırarak, sol taraftaki kanal menüsünde listelenen kanalları görüntüleyerek ve floresan zaman derslerini vurgulamak için hücrelere tıklayarak inceleyin (Şekil 1C). Uygun olmayan, yapışma noktasıyla sınırlı olmayan veya başka bir hücreye bağlı hücreleri daha fazla analizden dışlamak için hücre seçimini kullanın. Shift tuşuna basıp hücreyi tıklatarak veya hücreyi vurgulayıp Enter tuşunabasarak hücre seçimini okuma için değiştirin.
  10. Dosya | tıklayarak hücre alanı ve entegre floresan için tek hücreli zaman derslerini kaydedin (Şekil 5-6) Kaydedilecek dizini kaydedip seçme.

figure-protocol-4
Şekil 5: PyAMA kullanılarak hızlandırılmış görüntü serilerinin otomatik görüntü işlemesi. (1) Her görüntüleme pozisyonu için faz kontrastı ve floresan görüntü serileri içe aktarılır. (2) Hücre konturları faz kontrastı görüntü yığınındaki segmentasyona göre belirlenir. (3) Floresan görüntülere arka plan düzeltmesi uygulanır. (4) Hücre konturları zaman içinde izlenir ve dışa aktarma için önceden seçilir. (5) Floresan yoğunluğu izlenen hücre hatlarına göre entegre edilir. (6) Tek hücreli hücre alanları ve entegre floresan yoğunlukları değerlendirilir ve her hücre için zaman kursları ihraç edilir. Ölçek çubukları: 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. mRNA transfeksiyondan sonra çeviri kinetiğini analiz etmek için, daha önce Reiser ve ark.12tarafından açıklandığı gibi her tek hücreli zaman kursuna biyokimyasal oran denklemlerine dayalı bir çeviri modeli takın. Bu çalışmada kullanılan veriler ve kod herkese açıktır13.
  2. Her tek hücreli zaman kursu için, mRNA bozulma hızını ve çeviri başlangıcının zaman noktasını temsil eden çeviri modelinin tahmini sığdırma parametrelerini alın. Temsili sonuçlar bölümünde örnek bir veri kümesi ele alınmıştır.
  3. Hücre popülasyonları içindeki hücreden hücreye değişkenliği araştırmak için çeşitli deneysel koşullar için parametrelerin en iyi tahminlerinin dağılımları üzerinde daha fazla analiz yapın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LISCA yaklaşımı, floresan zaman kurslarını tek hücrelerden verimli bir şekilde toplamayı sağlar. Temsili bir örnek olarak, transfection sonrası tek hücreli eGFP ifadesini ölçmek için LISCA yönteminin nasıl uygulandığını özetliyoruz. LISCA deneyinin verileri, verimli mRNA ilaçlarının geliştirilmesi için önemli olan mRNA doğum kinetiğini değerlendirmek için kullanılır.

Özellikle iki lipid tabanlı mRNA dağıtım sisteminin çeviri başlangıç noktası ve tek hücre düzeyindeki ifade oranı açısından fark...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada LISCA'yı hücre içi floresan etiketlerin hücresel kinetiğini tek hücreli düzeyde takip etmek için çok yönlü bir teknik olarak tanımladık. Başarılı bir LISCA denemesi gerçekleştirmek için, protokol bölümünün açıklanan adımlarının her biri ayrı ayrı oluşturulmalı ve ardından tüm adımlar birleştirilmelidir. LISCA'nın üç ana yönünün her biri çok önemli adımlara sahiptir.

Tek hücreli mikroarray imalatı
Mikroarrayın kalitesi çok önemlidir, çünkü mikroarray üzerindeki hücresel hizal...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar rakip finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Alman Bilim Vakfı'nın (DFG) İşbirlikçi Araştırma Merkezi (SFB) 1032'ye verdiği hibelerle desteklendi. Almanya Federal Eğitim, Araştırma ve Teknoloji Bakanlığı'nın (BMBF) 05K2018-2017-06716 Medisoft kooperatif projesi kapsamındaki desteğinin yanı sıra Bayerische Forschungsstiftung'dan bir hibe de minnetle kabul edilmektedir. Anita Reiser, Nicel Biyobilim münih Enstitüsü (QBM) aracılığıyla bir DFG Bursu tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Adtech Polimer Mühendisliği PTFE Microtubing Fisher Scientific10178071
pişirme fırınıBağlayıcı9010-0190
CFI Plan Fluor DL 10xNikonMRH20100
KurutucuRothNX07.1
Eclipse Ti-ENikon
eGFP mRNATrilinkL-7601
Dişi Luer - Tüp KonektörüMEDNETFTL210-6005
Fetal sığır serumuThermo Fisher10270106
FibronektinYo Proteinleri663
Filtre seti eGFPAHFF46-002
Fisherbrand  Yarı Saydam Platinle Kürlenmiş Silikon BoruFisher Scientific11768088
HEPES (1 M)Thermo Fisher15630080
Kuluçka KutusuOkolabOKO-H201
kuluçka makinesiBağlayıcı9040-0012
L-15 fenol kırmızısı içermeyenThermo Fisher21083027
Lipofektamin 2000Thermo Fisher
Erkek Luerteflon
Erkek Luer - Tüp KonektörüMEDNETMTLS210-6005'tenfabrikasyon erkek luerlere alternatif
NaCl (5 M)Thermo FisherAM9760G
Erkek Luer Konektörüne İğnesiz VanaMEDNETNVFMLLPC
NIS ElemanlarıNikonGörüntüleme yazılımı Sürüm 5.02.00
NOA81ThorlabsNOA81Tüp sistemi montajı için Hızlı Kürlenen Optik Yapıştırıcı
Opti-MEMThermo Fisher31985062
PCO edge 4.2 M-USB-HQ-PCOpco
Fosfat tamponlu salin (PBS)şirket içinde hazırlanan
Plazma TemizleyiciDiener FemtoPico-BRS
PLL(20 kDa)-g[3.5]-PEG(2 kDa)SuSoS AG
silikon gofret mit mircorstructuresşirket içi fabrikasyon
Sola Light EngineLumencor
yapışkan slayt VI 0.4 ibidi80608
Sylgard 184 Silikon Elastomer KitiDow Corning1673921
Tango 2Mä rzhä kullanıcı00-24-626-0000
Evde hazırlanmışultra saf su
kaplamasız lamelleribidi10813
Injekt-F Solo, 1 mLOmilab9166017V, yedek sporn ile
11668027, oluşan şirket içi

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Altschuler, S. J., Wu, L. F. Cellular heterogeneity: do differences make a difference. Cell. 141 (4), 559-563 (2010).
  2. Locke, J. C., Elowitz, M. B. Using movies to analyse gene circuit dynamics in single cells. Nature Reviews Microbiology. 7 (5), 383-392 (2009).
  3. Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
  4. El-Ali, J., Sorger, P. K., Jensen, K. F. Cells on chips. Nature. 442 (7101), 403-411 (2006).
  5. Segerer, F. J., et al. Versatile method to generate multiple types of micropatterns. Biointerphases. 11 (1), 011005(2016).
  6. Piel, M., Théry, M. Micropatterning in cell biology, part A/B/C. , Elsevier. (2014).
  7. Reiser, A., Zorn, M. L., Murschhauser, A., Rädler, J. O. Cell-Based Microarrays: Methods and Protocols. Ertl, P., Rothbauer, M. , Springer. New York. 41-54 (2018).
  8. Picone, R., Baum, B., McKendry, R. Methods in cell biology. 119, Elsevier. 73-90 (2014).
  9. Reiser, A. Single-cell time courses of mRNA transport and translation kinetics. , Ludwig-Maximilians University. PhD thesis (2019).
  10. Woschée, D. Softmatter LMU-Raedler Group. , Available from: https://github.com/SoftmatterLMU-RaedlerGroup/pyama (2020).
  11. Schwarzfischer, M., et al. MIAAB, 29262. , Available from: https://push-zb.helmholtz-muenchen.de/frontdoor.php?source_opus=6773 (2020).
  12. Reiser, A., et al. Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection. Integrative Biology. 11 (9), 362-371 (2019).
  13. Reiser, A., Woschée, D., Mehrotra, N., Krzysztoń, R. S., Strey, H. H., Rädler, J. O. Supplementing data and code for: "Correlation of mRNA delivery timing and protein expression in lipid-based transfection". Zenodo. , Version 1.0 (2019).
  14. Ferizi, M., et al. Stability analysis of chemically modified mRNA using micropattern-based single-cell arrays. Lab on a Chip. 15 (17), 3561-3571 (2015).
  15. Fröhlich, F., et al. Multi-experiment nonlinear mixed effect modeling of single-cell translation kinetics after transfection. NPJ systems biology and applications. 4 (1), 1-12 (2018).
  16. Krzysztoń, R., et al. Single-cell kinetics of siRNA-mediated mRNA degradation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine. 21, 102077(2019).
  17. Röttgermann, P. J., Alberola, A. P., Rädler, J. O. Cellular self-organization on micro-structured surfaces. Soft Matter. 10 (14), 2397-2404 (2014).
  18. Röttgermann, P. J., Dawson, K. A., Rädler, J. O. Time-resolved study of nanoparticle induced apoptosis using microfabricated single cell arrays. Microarrays. 5 (2), 8(2016).
  19. Murschhauser, A., et al. A high-throughput microscopy method for single-cell analysis of event-time correlations in nanoparticle-induced cell death. Communications Biology. 2 (1), 1-11 (2019).
  20. Chatzopoulou, E. I., et al. Chip-based platform for dynamic analysis of NK cell cytolysis mediated by a triplebody. Analyst. 141 (7), 2284-2295 (2016).
  21. Sztilkovics, M., et al. Single-cell adhesion force kinetics of cell populations from combined label-free optical biosensor and robotic fluidic force microscopy. Scientific Reports. 10 (1), 1-13 (2020).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Zaman Atlamal MikroskopiFloresan Zaman SeyirleriOtomatik G r nt AnaliziMikroarray H cre K lt rEGFP EkspresyonumRNA TransfeksiyonuH cre Kineti i NicelendirmesiH cre Adhezyon Analizi

İlgili makaleler